一種姬松茸菌床常見病害的病原菌分離鑒定*

華 蓉，李建英，劉紹雄，羅孝坤，李雪松，熊永生，孫達(dá)鋒**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221）

姬松茸（Agaricus blazei）又名巴西蘑菇、柏拉氏蘑菇、巴氏蘑菇、小松菇等，原產(chǎn)于巴西、秘魯、美國等地，我國鮮見有關(guān)野生資源的報道。野生姬松茸夏秋季節(jié)生長在林地或草地，屬草腐菌，分類學(xué)上隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）傘 菌 目 （Agaricales）傘 菌 科 （Agaricaceae）傘菌屬 （Agaricus）[1]。姬松茸味道鮮美，具有獨(dú)特的杏仁香味，口感極好、營養(yǎng)豐富，食用價值較高。含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦質(zhì)元素、多糖、活性核酸、活性甾醇類和外源凝集素等物質(zhì)，有一定的降血脂、降血糖、降低低密度脂蛋白、抗癌、抗氧化、抗衰老、防治糖尿病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗疲勞等功效[2-5]。姬松茸因食用價值和藥用價值均很高，受到廣大消費(fèi)者的喜愛，近年來也成為國內(nèi)外的重點(diǎn)研究對象，作為材料被制成酸奶、即食產(chǎn)品、餅干、面條、保肝膠囊、復(fù)方口服液、多糖分散片等多種功能食品、醫(yī)療用品和保健品[6-12]。

1965年日本人古本隆壽成功分離菌種后開始了姬松茸的栽培研究，1978年開始進(jìn)行商業(yè)化栽培；我國福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院1992年從日本引進(jìn)姬松茸菌株試種成功，后逐步推廣至全國[13-14]。多年來，我國姬松茸產(chǎn)量呈現(xiàn)穩(wěn)步上漲的趨勢，具中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2010年我國姬松茸產(chǎn)量為2.87萬噸，2019年達(dá)到了12.11萬噸；福建是第一個栽培姬松茸的省份，也一直是全國產(chǎn)量最大的省份；然而近年來隨著云南省食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，2019年云南省姬松茸產(chǎn)量達(dá)4.91萬噸，位居全國第一[15]。2020年12月19日，云南省食用菌協(xié)會姬松茸分會的成立更是提高了中國姬松茸的國際知名度，提升了我國食用菌國際市場影響力和競爭力[16]。

目前姬松茸的主要栽培方式為發(fā)酵料覆土栽培，基料養(yǎng)分對產(chǎn)量有決定性影響。在實(shí)際栽培中，栽培戶發(fā)現(xiàn)基料易感染一種霉菌，其與基料長在一起呈灰色，具有可見霉層，輕拍有粉末狀孢子彈出，此病癥被稱為“灰霉病”。發(fā)生病害后病原菌擴(kuò)散速度快，處理不及時會大量消耗基料中的養(yǎng)分，影響姬松茸的產(chǎn)量。文山是云南省姬松茸栽培的主要產(chǎn)地，也是“灰霉病”病害較為嚴(yán)重的區(qū)域。通過從文山姬松茸栽培主產(chǎn)地采集病害樣品，分離純化出病原菌并進(jìn)行鑒定，以期為“灰霉病”的生物防治提供參考依據(jù)，為姬松茸菌種選育篩選抗病性菌株提供供試菌株材料。

1 材料與方法

1.1 姬松茸病害調(diào)查和樣品采集

1.1.1 樣地概況

文山市滇珍菌業(yè)有限公司為云南省內(nèi)最大的姬松茸栽培企業(yè)，為本次病害調(diào)查地和研究樣本采集地。具體樣點(diǎn)為文山市滇珍菌業(yè)有限公司姬松茸栽培大棚。

1.1.2 病害調(diào)查和樣品采集

病害情況：播種后約6天，菌床開始出現(xiàn)病害，菌床表面呈現(xiàn)灰色霉層，強(qiáng)光下仔細(xì)觀察可見淺桔色粉末狀孢子層；天氣干燥時病害較少，開棚晚、濕度較大的情況下病害較嚴(yán)重，下雨后病害會加重；四層架的最上層情況相對嚴(yán)重；往年出現(xiàn)過病害的大棚，后續(xù)栽培過程中病害更易發(fā)生；病害發(fā)生后，開邊窗、降濕度能在一定程度上緩解癥狀。

樣品采集時間為2021年5月17日，在3個病害嚴(yán)重的大棚中隨機(jī)采集覆滿病原菌菌絲的基料樣品3份，并進(jìn)行編號（1～3），裝入樣品采集袋中，用冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。

1.2 姬松茸病原菌分離鑒定

1.2.1 培養(yǎng)基制備

從病害情況調(diào)查結(jié)果可知，病害部位有明顯的真菌菌絲和孢子層，初步判斷此病害是由真菌感染引起。因此病原菌分離采用孟加拉紅培養(yǎng)基，純化、培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基[17]。

孟加拉紅培養(yǎng)基：瓊脂15 g～20 g、葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、氯霉素0.1 g，1/3 000孟加拉紅100 mL，蒸餾水1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂15 g～20 g、葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 病原菌分離與純化

在超凈工作臺進(jìn)行無菌操作，挑取病原菌包裹的少量基料，接種在孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，置于24℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d～5 d后，挑取病原菌菌落邊緣部分菌絲或帶菌絲的培養(yǎng)基至PDA平板上進(jìn)行純化，重復(fù)此操作至獲得單一菌落。對3個樣品進(jìn)行相同的操作，獲得的純菌株命名為HMB-1～HMB-3。放置于4℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 真菌菌株的分子鑒定

采用ITS序列分析法[18-20]對純化的菌株HMB-1～HMB-3進(jìn)行分子鑒定，樣品送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增和測序。用DNASTAR軟件對雙向序列進(jìn)行拼接處理，用DNAman軟件對病原菌序列進(jìn)行相似度比對。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對，并下載與樣品序列相似度較高的序列，用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的系統(tǒng)學(xué)發(fā)育地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸病害調(diào)查結(jié)果與分析

本次研究的病害為姬松茸栽培過程中的常見病害，病害發(fā)生后如處理不及時，病害會快速擴(kuò)散，病原菌與姬松茸菌絲競爭消耗基料中的養(yǎng)分，影響姬松茸的產(chǎn)量。據(jù)調(diào)查，大棚開棚晚、通風(fēng)不良，加上降雨后濕度大的情況下較易發(fā)生病害。層架中的最上面一層溫度較高、病害較嚴(yán)重，說明氧氣不足、高溫高濕的條件下病害更易發(fā)生，通風(fēng)、降濕是緩解病害的有效手段。往年出現(xiàn)過病害的大棚發(fā)生病害的幾率更大，因此在每年栽培料進(jìn)棚前應(yīng)對大棚進(jìn)行充分的清潔消毒，保障周邊環(huán)境干凈整潔，盡量減少病害的再次發(fā)生。

2.2 病原菌分離鑒定

姬松茸菌床感染病害情況見圖1。

圖1 感染病害的姬松茸菌床發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of Agaricus blazei infected with the disease

如圖1所示，為姬松茸菌床發(fā)病癥狀（位于菌床層架下方），將覆滿病原菌菌絲的姬松茸菌床基料3個樣品進(jìn)行病原菌分離，在PDA培養(yǎng)基上24℃培養(yǎng)4 d獲得純培養(yǎng)菌株，結(jié)果見圖2。

圖2 病原菌菌株菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of pathogen

如圖2所示，菌落圓形，中間桔色，有明顯的孢子層，邊緣白色，氣生菌絲貼于培養(yǎng)基生長。3個菌株 （HMB-1～HMB-3）菌落形態(tài)一致。

2.3 病原菌菌株的ITS序列分析

經(jīng)過DNA提取、擴(kuò)增、測序和雙向序列校對，菌株HMB-1～HMB-3的ITS序列片段大小分別為560 bp、565 bp、567 bp。用DNAman軟件對3條序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)將3條序列兩端處理后剩余559 bp，相似度為100%，結(jié)合菌落形態(tài)一致性，可以確定3個樣品中分離到的3個菌株為同一種病原菌。

將序列在GenBank數(shù)據(jù)庫（NCBI）中進(jìn)行BLAST比對。下載相似度高（100%），且已在期刊發(fā)表的粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）的3條序列 （JQ434579.1，KR559032.1，KT758800.1），以及聚端孢屬（Trichothecium）中其他種已發(fā)表的ITS序列作為參照，選取覆土型食用菌栽培中常見的雜菌米根霉 （Rhizopus oryzae）（MH865593.1）作為外群，使用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的系統(tǒng)學(xué)分類地位，詳見圖3。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖3可見，3個病原菌菌株（HMB-1～HMB-3）與聚端孢屬（Trichothecium）序列聚在一個支系上，且與粉紅聚端孢菌（T.roseum）在同一支，且支持率為99%，因此，可以確定樣品中分離到的3個病原菌菌株為粉紅聚端孢菌。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過研究，從3個病害嚴(yán)重的大棚中采集到的樣品里分離純化出3個真菌菌株HMB-1～HMB-3。3個菌株的菌落形態(tài)一致，均為圓形，中間桔色、邊緣白色，氣生菌絲貼于培養(yǎng)基生長。用DNAman軟件對3條序列進(jìn)行比對，3個菌株序列相似度為100%，結(jié)合形態(tài)一致性可以確定3個菌株為同一種病原菌。經(jīng)過BLAST比對、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定本次研究分離到的3個病原菌菌株為粉紅聚端孢菌。

3.2 討論

本次研究的姬松茸病害雖被栽培戶稱為“灰霉病”，但其實(shí)真正的灰霉病是由葡萄孢屬（Botrytis）真菌侵染植物引起的一種世界性植物真菌病害，因致病菌會在植物組織表面產(chǎn)生大量灰色霉層而得名，主要危害蔬菜、水果和花卉等200多種農(nóng)作物[21-22]。相應(yīng)的研究和防治措施很多。截至2020年4月，我國登記防治灰霉病的殺菌劑商品就有471個；以防治茄科、葫蘆科、葡萄科、薔薇科等經(jīng)濟(jì)作物為主，除了蔬菜水果以外，百合、菊花、牡丹等一些觀賞性花卉，以及人參等具有較高經(jīng)濟(jì)價值的作物也有少量商品登記[22]。

本次研究的病害雖在棚內(nèi)呈現(xiàn)灰色霉層，但在強(qiáng)光下可見淺桔色。從菌落形態(tài)和分子系統(tǒng)學(xué)分析確定本次引起病害的病原菌為粉紅聚端孢菌。因此，此次研究的姬松茸大棚病害不是灰霉病，而是由粉紅聚端孢菌引起的一種競爭性新型病害。粉紅聚端孢菌菌絲生長溫度范圍為10℃～35℃，最適溫度為25℃，在pH 3～8都能生長，最適生長pH為6[23]，與姬松茸的生長條件十分接近，可能也是粉紅聚端孢菌易造成姬松茸栽培病害的原因之一。

粉紅聚端孢菌是引起木瓜、梨、香蕉、葡萄等多種水果紅粉病、棉花紅腐病和蘋果霉心病等病害的重要病原真菌[24]。對粉紅聚端孢菌引起的植物性病害及其防治措施的研究有很多[25]，但食用菌中的粉紅聚端孢菌病害報道和防止措施都比較少。2013年董文慧[26]首次報道了紅聚端孢菌是引起雞腿菇菌柄潰瘍病的病原菌，并證實(shí)50%咪鮮胺錳鹽（WP）在對雞腿菇菌絲影響較小的前提下對粉紅聚端孢菌有較好的抑制作用；王剛正等[27]研究報道了大蒜 （Allium sativum）提取液對粉紅聚端孢菌有較好的抑制作用；之后未見其他相關(guān)報道。

由于食用菌菌絲對藥物敏感度較高，且粉紅聚端孢菌和食用菌同屬于真菌，在藥物防治上相對于植物病害要更為艱難，也需要更加謹(jǐn)慎。栽培戶在姬松茸粉紅聚端孢菌病害發(fā)生后，曾使用菌核凈或是氟啶胺和喹啉銅的混合劑噴灑，對病原菌菌絲有明顯的抑制作用，但藥物對姬松茸菌絲的影響、用藥劑量等都缺乏確切的數(shù)據(jù)，需要開展更多的研究。本次研究中首次發(fā)現(xiàn)粉紅聚端孢菌能夠引起姬松茸病害，為今后姬松茸栽培病害防治提供了更多的依據(jù)，為姬松茸菌種選育篩選抗病性菌株提供了供試菌株材料，也為后期食用菌中粉紅聚端孢菌病害的藥劑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。