涮辣與昆明皺皮椒苯丙氨酸解氨酶(PAL)的生物信息學(xué)及表達(dá)分析*

張 祥，劉雨婷，張婧柔，李平平，謝志和，張芮豪，鄧明華,2

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省通海縣經(jīng)濟作物工作站，玉溪市鄧明華專家基層科研工作站，云南 通海 652700)

苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanine ammonia-lyase，PAL)屬于lyases 家族，最近此類酶被重新命名為EC 4.3.1.24 (苯丙氨酸解氨酶)、EC 4.3.1.25(酪氨酸解氨酶)和EC 4.3.1.26 (苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶)，該酶催化苯丙氨酸的非氧化脫氨基反應(yīng)，產(chǎn)生反式肉桂酸和NH3[1]。PAL 是苯丙烷途徑中的第1 步反應(yīng)酶，同時也是此途徑的限速酶[2-3]。苯丙烷途徑中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物可直接或間接合成多種植物次生代謝物質(zhì)，包括類黃酮、木質(zhì)素、酚類、植物抗毒素和辣椒素等，這些次生代謝物在植物生長發(fā)育及抗逆方面起重要作用[4-7]。因此，研究不同辣椒材料、發(fā)育時期和栽培環(huán)境下的PAL 酶活性及基因表達(dá)對解析辣椒次生代謝物質(zhì)合成和積累有重要價值。

馬鈴薯未成熟塊莖組織中的PAL表達(dá)水平和酶活性最高[8]。BALDI 等[9]研究表明：苯丙烷類和類黃酮生物合成相關(guān)基因可能在調(diào)控蘋果早期果實發(fā)育中起重要作用，并指出在蘋果果實發(fā)育前期，PAL表達(dá)水平顯著上調(diào)。同樣，在葡萄果實發(fā)育的一定階段呈現(xiàn)出PAL 依賴性[10]。對擬南芥PAL基因的研究顯示：PAL在植物生長、發(fā)育和對環(huán)境脅迫的反應(yīng)中不可或缺[11]。由此可知，除不同發(fā)育時期外，PAL在應(yīng)對不同環(huán)境因子脅迫中也發(fā)揮著一定的作用。目前許多研究表明：PAL類基因在應(yīng)對環(huán)境刺激反應(yīng)中受到不同的調(diào)節(jié)[12-13]，同時相關(guān)植物激素如脫落酸、赤霉素和茉莉酸等也會影響PAL基因的表達(dá)量和酶活性[14]。

涮辣是云南的特色辣椒品種，為小米辣的栽培變種，分布于云南省德宏、保山和西雙版納等地，是已知報道中中國最辣的辣椒[15-16]。王姣等[17]通過研究得到云南涮辣中PAL 酶活性與辣椒素含量的變化基本一致，表明PAL 是影響涮辣辣椒素積累的重要因素。本實驗室通過測定涮辣和昆明皺皮椒辣椒素和二氫辣椒素含量，經(jīng)辣度換算后發(fā)現(xiàn)涮辣辣度為昆明皺皮椒的42.4 倍(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，兩者同為云南本地特色辣椒，但辣椒素積累差異較大。PAL 作為影響辣椒素合成的主要酶之一，盡管在不同發(fā)育時期、環(huán)境和物種對PAL作用有許多相關(guān)研究，但對于地方特色辣椒(如云南高辣度涮辣)辣椒素積累現(xiàn)象的分子水平解釋較少。因此，本研究將涮辣與昆明皺皮椒進行對比，運用生物信息學(xué)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，基于qPCR 與報道的PAL 酶活性測定方法，測定不同發(fā)育時期、不同栽培環(huán)境下PAL的表達(dá)水平與酶活性，并測定不同外源物質(zhì)處理下涮辣PAL表達(dá)水平，旨在解析涮辣與昆明皺皮椒PAL基因及蛋白的差異，探究不同發(fā)育時期、不同栽培環(huán)境下PAL基因表達(dá)及酶活性的變化規(guī)律，為研究PAL在云南特色涮辣辣椒素積累中的作用提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

涮辣與昆明皺皮椒來源于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院番茄辣椒實驗室，于露天和大棚2 種不同環(huán)境中正常栽培。以花后每10 d 為1個發(fā)育時期，選擇7個發(fā)育時期的辣椒果實作為試驗材料，分別構(gòu)建2 種辣椒的cDNA 混池進行PAL基因克隆。選擇辣椒不同發(fā)育時期的果實測定PAL表達(dá)水平及酶活性，對涮辣花后30 d 果實進行不同外源物質(zhì)處理并測定PAL表達(dá)水平，所有試驗均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1PAL基因分離與鑒定

使用RNA 提取試劑盒 (北京華越洋生物科技有限公司)提取涮辣與昆明皺皮椒總RNA，利用Takara 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第1 鏈cDNA，并以此為模板，使用KIM 等[18]報道的PALRTPCR 特異性引物 (表1)進行RT-PCR 特異性擴增，回收特異性PCR 產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序，使用ORF Finder 軟件預(yù)測PAL開放閱讀框，在線BLAST 進行驗證。

表1 反應(yīng)引物Tab.1 Primers involved in the reaction

1.2.2 涮辣與昆明皺皮椒的PAL基因特性分析

基于Pepper Hub 與NCBI 公共數(shù)據(jù)庫查找辣椒 (GeneID：107 843 098)與其他茄科植物PAL基因的上游2 000 bp 序列，在plant CARE 軟件上預(yù)測上游順式元件，用Microsoft Excel 365 篩選整理，TBtools 軟件進行順式元件可視化。使用DNAMAN 9 對涮辣和昆明皺皮椒PAL序列進行同一性分析，使用MEGA X 進行序列比對。

1.2.3 涮辣與昆明皺皮椒的PAL 蛋白特性分析

使用在線軟件MEME 分析各物種PAL 氨基酸序列motif，并在TBtools 軟件中進行可視化。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測基于DART 與PFAM 工具；使用PORTPARAM 工具對涮辣與昆明皺皮椒 PAL蛋白理化性質(zhì)進行預(yù)測；使用SOPMA 預(yù)測涮辣與昆明皺皮椒 PAL 蛋白二級結(jié)構(gòu)；基于SWISSMODEL 在線工具對涮辣與昆明皺皮椒的PAL 蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，在預(yù)測結(jié)果中以GMQE(全局模型質(zhì)量估計)值和QMEAN Z 得分衡量模型的準(zhǔn)確性。GMQE 估計模型質(zhì)量，其分?jǐn)?shù)表示為介于0 和1 之間的數(shù)字，反映使用該對齊模板構(gòu)建模型的預(yù)期準(zhǔn)確性以及目標(biāo)的覆蓋范圍，數(shù)字越大，即可靠性越高；QMEAN Z 得分在0 左右表示模型結(jié)構(gòu)和類似大小的試驗結(jié)構(gòu)之間良好一致，-4.0 或以下分?jǐn)?shù)表示模型質(zhì)量低。用Pymol 2.4.1 軟件對三級結(jié)構(gòu)模型進行3D 渲染；使用SignalP-5.0、TMHMM 和NetPhos 預(yù)測二者PAL蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和磷酸化位點；運用PSORT Prediction 預(yù)測涮辣與昆明皺皮椒 PAL 的亞細(xì)胞定位。

1.2.4 進化樹構(gòu)建

在NCBI BLAST 上選擇不同物種但同一性大于70%的PAL 氨基酸序列，使用 MEGA X 軟件基于鄰接法并設(shè)置Bootstrap method 為1 000，選擇Poisson model 模型檢驗構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用ITOL 軟件作圖。

1.2.5 不同發(fā)育時期涮辣與昆明皺皮椒的PAL表達(dá)水平及酶活性測定

利用Primer-blast 設(shè)計qPCR 引物(表1)，基于qPCR 測定PAL表達(dá)水平，使用KOUKOL[19]和王姣等[17]報道的方法提取不同發(fā)育時期的涮辣和昆明皺皮椒果實PAL 酶；使用分光光度計于290 nm 下測定其OD 值，PAL 活性以1 mL 酶液在1 h 內(nèi)OD290nm的變化表示。

1.2.6 不同外源因子處理涮辣及PAL表達(dá)水平測定

選擇脫落酸(ABA，0.5 mmol/L)、赤霉素(GA3，0.5 mmol/L)、過氧化氫(H2O2，30%水溶液)、茉莉酸甲酯(MeJA，0.1 mmol/L)、水楊酸(SA，0.1 mmol/L)和褪黑素(MT，0.1 mmol/L)6 種外源物質(zhì)分別對果實胎座進行浸泡處理(處理時間：0、3、6、12 和15 h)，其中0 h 為未處理樣品，以管家基因Actin作為校正，測定PAL表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 涮辣與昆明皺皮椒的PAL 基因分析

2.1.1 涮辣和昆明皺皮椒的PAL基因堿基序列對比分析

涮辣和昆明皺皮椒PAL進行RT-PCR 特異性擴增并測序后，經(jīng)BLAST 驗證，二者與NCBI數(shù)據(jù)庫中GeneID：107843092 的辣椒PAL類基因序列同一性高達(dá)99%以上。開放閱讀框預(yù)測顯示：涮辣PAL基因2 166 bp，編碼721個氨基酸殘基；昆明皺皮椒PAL基因2 154 bp，編碼717個氨基酸殘基。同一性分析結(jié)果顯示：涮辣與昆明皺皮椒PAL堿基序列同一性為98.71%。涮辣與昆明皺皮椒PAL基因序列比對結(jié)果表明：涮辣存在12個堿基插入，且涮辣PAL存在16個SNP 位點，分別為：20 (A-T)、53 (T-G)、239 (C-G)、452 (G-A)、771 (G-A)、786 (A-C)、1095 (A-T)、1527 (A-G)、1711 (T-C)、1759 (A-C)、1917 (T-C)、1992 (G-C)、2091 (G-C)、2103 (G-A)、2104 (A-G)和2106 (T-C)。

2.1.2 辣椒及其他常見茄科植物PAL上游順式元件預(yù)測

對茄科中除辣椒外的番茄、馬鈴薯、潘那利番茄和普通煙草的PAL基因上游順式元件進行預(yù)測，結(jié)果共預(yù)測到447個順式元件，其中馬鈴薯109個，潘那利番茄78個，普通煙草71個，番茄79個，辣椒109個 (圖1)。所有預(yù)測到的順式元件共有11 種，按類型可分為：①核心啟動元件：啟動子和增強子區(qū)、-30 轉(zhuǎn)錄起始位點；② 植物激素響應(yīng)元件：脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和生長素(Auxin)響應(yīng)元件；③環(huán)境響應(yīng)元件：防御與脅迫響應(yīng)、光響應(yīng)元件；④ 轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)結(jié)合位點：光響應(yīng)MYB 結(jié)合位點、干旱誘導(dǎo)MYB 結(jié)合位點。

圖1 辣椒及其他常見茄科植物PAL 基因上游順式元件預(yù)測Fig.1 Prediction of cis-element upstream of PAL genes in pepper and other Solanaceae plants

在辣椒中除存在核心啟動元件外，還存在1個GA 響應(yīng)元件，10個光響應(yīng)元件和1個干旱誘導(dǎo)MYB 結(jié)合位點。由預(yù)測結(jié)果可推測：在辣椒PAL基因的表達(dá)調(diào)控中，其受GA 等植物激素和光的調(diào)控，另外在對干旱脅迫響應(yīng)過程中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子也參與此調(diào)控過程。

2.2 涮辣與昆明皺皮椒 PAL 蛋白特性分析

2.2.1 不同物種PAL 蛋白保守結(jié)構(gòu)分析

選取包括茄科、十字花科、木犀科和菊科4個科共22 條PAL 氨基酸序列進行保守motif 分析，結(jié)果(圖2)顯示：共得到20個顯著保守的motif，其中，包括涮辣與昆明皺皮椒在內(nèi)的所有植物都含有15、4、6、16、10、9、1、3、13、2、8、5、12 和7 等14個不同保守motif。由此可推測：以上14個保守motif 是PAL 蛋白結(jié)構(gòu)的重要組成部分，且是保證不同物種之間PAL 功能相似的決定性結(jié)構(gòu)。對辣椒而言，除Capsicum baccatum之外的辣椒含有17 和20 兩個特有保守motif，而C.chinense、C.annuum和涮辣相對于昆明皺皮椒含特有的motif 19。蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示：涮辣和昆明皺皮椒PAL 屬于cl30215 超家族中PLN02457 保守蛋白結(jié)構(gòu)域家族，存在PLN 0457 結(jié)合位點，同時屬于lyases家族，包含芳香裂解酶結(jié)構(gòu)域。

圖2 不同物種PAL 蛋白氨基酸motif 分析Fig.2 Motif analysis of amino acids in PAL proteins of different species

2.2.2 涮辣與昆明皺皮椒 PAL 理化性質(zhì)分析

蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示：涮辣與昆明皺皮椒 PAL 蛋白分子式分別為C3436H5533N965O1057S32和C3418H5509N959O1051S33，分子量分別為78.30 和77.91 ku，理論等電點(IP)為 6.26 和6.31，均為脂溶性、親水性的穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示：兩者PAL 定位在質(zhì)膜的確定性為0.700，在微體(過氧化物酶體) 的確定性為0.300，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的確定性為0.200，在線粒體內(nèi)膜上的確定性為0.100。

2.2.3 涮辣與昆明皺皮椒的PAL 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

預(yù)測結(jié)果(圖3)顯示：2個品種辣椒PAL 蛋白含有4 種二級結(jié)構(gòu)，包括α 螺旋、延伸鏈、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，其中α 螺旋與無規(guī)卷曲占主要部分(涮辣：85.02%；昆明皺皮椒：86.19%)。昆明皺皮椒 PAL 蛋白中無規(guī)卷曲與延伸鏈多于涮辣，α 螺旋和β 轉(zhuǎn)角卻少于涮辣PAL。

圖3 涮辣與昆明皺皮椒 PAL 蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structures of PAL proteins in ShuanLa and Kunming wrinkled pepper

2.2.4 涮辣與昆明皺皮椒的PAL 蛋白三級結(jié)構(gòu)分析

SWISS-MODEL 預(yù)測結(jié)果(圖4)顯示：涮辣的PAL 蛋白模型GMQE 值為0.85，QMEAN Z得分為-0.66；昆明皺皮椒的GMQE 值為0.85，QMEAN Z 得分為-1.82，表明本次預(yù)測的涮辣和昆明皺皮椒 PAL 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性高，模型可靠。

圖4 涮辣(a)與昆明皺皮椒 (b) PAL蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.4 Prediction of tertiary structures of PAL proteins in ShuanLa (a) and Kunming wrinkled pepper (b)

2.2.5 涮辣與昆明皺皮椒的PAL 蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)分析和磷酸化位點預(yù)測

SignalP-5.0 與TMHMM Server v.2.0 預(yù)測結(jié)果(圖5)顯示：涮辣和昆明皺皮椒 的PAL 蛋白均無信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)。使用NetPhos 3.1 Server 對涮辣與昆明皺皮椒 PAL 蛋白磷酸化位點預(yù)測，同時對預(yù)測位點在0～1 區(qū)間內(nèi)進行打分，預(yù)測位點可信度隨得分從0.5 到1 增加而增加，涮辣與昆明皺皮椒 PAL 中評分大于等于0.5 的磷酸化位點均為81個。對同一位點，以最高得分的氨基酸殘基類型為準(zhǔn)進行篩選，涮辣與昆明皺皮椒均篩選到58個得分最高的磷酸化位點；在涮辣中S 型30個，T 型21個，Y 型7個；昆明皺皮椒中S 型31個，T 型20個，Y 型7個。

圖5 涮辣(a)與昆明皺皮椒(b) PAL 蛋白磷酸化位點預(yù)測結(jié)果Fig.5 Results of predicting the phosphorylation sites of PAL protein in ShuanLa (a) and Kunming wrinkled pepper (b)

2.2.6 不同物種PAL 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與分析

以選取的包括涮辣和昆明皺皮椒在內(nèi)共22 條PAL 序列構(gòu)建進化樹，結(jié)果(圖6)表明：PAL 序列在系統(tǒng)發(fā)育上按照4個不同的科，聚為四大類群。其中，茄科植物中PAL 又分出眾多亞支。涮辣和昆明皺皮椒PAL 與同科同屬的C.chinense和C.annuum在系統(tǒng)發(fā)育上親緣關(guān)系最近，與C.baccatum最遠(yuǎn)；不同屬中，與茄屬的親緣關(guān)系最近；不同科中，與木犀科最近，與十字花科親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖6 不同植物PAL 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic trees of PAL proteins of different plants

2.3 涮辣與昆明皺皮椒 PAL 基因表達(dá)及酶活性分析

2.3.1 不同材料與環(huán)境條件下PAL基因表達(dá)分析

由圖7 可知：PAL基因的表達(dá)在不同栽培環(huán)境下及2 種辣椒之間差異十分明顯。PAL基因在辣椒果實發(fā)育中的表達(dá)趨勢為先緩慢升高后急劇降低。在果實發(fā)育前期(10 d)，該基因的表達(dá)處于較高階段；在果實發(fā)育中期(20～40 d)，該基因的表達(dá)處于高位，在第40 天達(dá)到峰值；在辣椒果實發(fā)育后期，該基因的表達(dá)急劇下降，在第70 天達(dá)到最低。同一環(huán)境下，涮辣PAL表達(dá)水平整體高于昆明皺皮椒，且在第50 天時，露地條件下涮辣PAL的表達(dá)量是昆明皺皮椒的4 倍。而在果實整個發(fā)育時期，露地栽培環(huán)境下的涮辣PAL表達(dá)量皆高于大棚栽培；而在發(fā)育的大部分階段，露地栽培條件下昆明皺皮椒PAL的表達(dá)量也高于大棚栽培。

圖7 涮辣與昆明皺皮椒 PAL 在不同發(fā)育時期、不同環(huán)境下相對表達(dá)量與酶活性Fig.7 The relative expression levels and enzyme activities of PAL in ShuanLa and Kunming wrinkled pepper at different developmental stages and under different environments

2.3.2 在果實不同發(fā)育階段和環(huán)境條件下PAL 酶活性差異

由圖7 還可知：在辣椒果實發(fā)育過程中，PAL 酶活性先緩慢升高后急劇降低。在果實發(fā)育的中期(20～40 d)，該酶活性處于高位，并在第40 天時達(dá)到峰值；之后，隨發(fā)育時間的延長該酶活性急劇下降，在第70 天達(dá)到最低。在栽培環(huán)境中，涮辣PAL 酶活性皆高于昆明皺皮椒，在發(fā)育至30 d 時，其露地栽培條件下的酶活性是昆明皺皮椒的2.5 倍。就同種材料不同環(huán)境而言，大棚栽培條件下PAL 酶活性在發(fā)育的7個階段都低于露地栽培。

2.4 不同外源物質(zhì)對涮辣PAL 基因表達(dá)的影響

由圖8 可知：除GA3處理為外，其他5個外源物質(zhì)對涮辣PAL表達(dá)的影響總體趨勢均為先升高后降低。從整體上看，PAL基因的表達(dá)對ABA、GA3、MeJA 和SA 處理的反應(yīng)較為明顯，對H2O2和MT 處理響應(yīng)較低。在ABA 和MeJA處理下，PAL在3 h 時表達(dá)量最高，隨后隨時間增加而降低；在H2O2與SA 處理下，PAL在6 h時表達(dá)量最高；對于GA3處理而言，涮辣PAL在處理后0～3 h內(nèi)呈升高趨勢，在3～6 h內(nèi)呈下降趨勢，且在6 h 時表達(dá)量幾乎降為0，而后在6～15 h 內(nèi)，其表達(dá)量隨時間增加而增加，直至15 h 表達(dá)量最高；在MT 處理下，PAL表達(dá)水平隨處理時長變化而變化，在3～6 h 持續(xù)下降，隨后直到12 h 持續(xù)上升，然后至15 h 內(nèi)下降。

圖8 不同外源因子對涮辣PAL 表達(dá)的影響Fig.8 Influence of different exogenous substances on the expression of ShuanLa PAL

3 討論

3.1 涮辣與昆明皺皮椒 PAL 基因及蛋白特性存在差異

PAL 廣泛分布于高等植物中，是苯丙烷途徑中的關(guān)鍵酶，參與苯丙烷類化合物前體的生物合成[20-21]。本研究利用同源克隆的方法從涮辣與昆明皺皮椒中分離鑒定出PAL基因開放閱讀框，其中涮辣PAL基因共2 166個堿基，編碼721個氨基酸殘基；昆明皺皮椒PAL基因共2 154個堿基，編碼717個氨基酸殘基?；谏镄畔W(xué)方法，對涮辣與昆明皺皮椒PAL基因、蛋白特性與進化關(guān)系進行預(yù)測和分析。上游順式元件預(yù)測結(jié)果揭示了辣椒PAL可能受GA 調(diào)控，另外辣椒PAL具有光響應(yīng)元件與干旱誘導(dǎo)MYB 結(jié)合位點，結(jié)果與前人研究結(jié)果[14]相符。

涮辣與昆明皺皮椒 PAL 蛋白分子量分別為78.30 和77.91 ku；理論等電點分別為 6.26 和6.31；2 種辣椒PAL 蛋白帶負(fù)電荷殘基總數(shù)大于帶正電荷殘基總數(shù)；二者皆是脂溶性、親水性的穩(wěn)定蛋白。PAL 細(xì)胞定位主要在質(zhì)膜上，而在微體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體膜上的可能性較小，與黃小貞等[22]的研究相似。通過對不同物種PAL 氨基酸序列保守motif 分析，在一定程度上反映了PAL具有較高的保守性，但部分物種PAL 包含特有motif，也說明了不同物種對PAL 蛋白功能的需求存在差異。同時，不同辣椒PAL 蛋白保守結(jié)構(gòu)之間的差異可能是辣椒素生物合成產(chǎn)生差異的重要原因。

蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示：涮辣與昆明皺皮椒 PAL 存在PLN 0457 結(jié)合位點，包含芳香裂解酶結(jié)構(gòu)域(lyase aromatic)，與玉米、山葡萄和荸薺等[23-25]植物中PAL基因報道一致，可知涮辣與昆明皺皮椒 PAL 屬于lyases 家族的一員。在辣椒PAL 蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有大量α 螺旋與無規(guī)卷曲，與馮立娟等[26]對石榴 PAL 的預(yù)測結(jié)果相符。CALABRESE 等[27]用X 射線晶體學(xué)描述了PAL 的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：每個亞基含有716個殘基，其分子質(zhì)量為76.88 ku，每個亞基呈海馬形狀，與其他2個亞基頭尾相連，最大限度地增加了相鄰亞基的相互作用，并產(chǎn)生1個緊密配合的四聚體。涮辣與昆明皺皮椒 PAL 蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果符合PAL 晶體學(xué)結(jié)構(gòu)。涮辣與昆明皺皮椒 PAL 蛋白無信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果與馬鈴薯PAL[28]相符。PAL 蛋白磷酸化位點預(yù)測顯示：二者都具有58個磷酸化位點，而在枸杞和馬鈴薯等茄科[2,26]植物皆預(yù)測到PAL 磷酸化位點，但現(xiàn)有磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究未能證實PAL 磷酸化[29-30]，所以對于PAL 蛋白是否進行磷酸化還需要進一步研究。PAL 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明：PAL 在遺傳過程中保守性較高，結(jié)果與蓋江濤等[4]的報道相符。

3.2 PAL 參與環(huán)境、外源因子對辣椒的調(diào)控并且影響辣椒素積累

由PAL 參與的苯丙烷途徑在植物發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其產(chǎn)生的次生代謝物如辣椒素和木質(zhì)素等參與植物發(fā)育過程中相關(guān)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成[11,31]。本研究測定了不同發(fā)育時期和環(huán)境條件下涮辣與昆明皺皮椒PAL相對表達(dá)量與酶活性，結(jié)果表明：PAL 在辣椒果實發(fā)育過程中的酶活性基本和表達(dá)水平成正比，趨勢為先緩慢升高后急劇降低，并在果實發(fā)育中期達(dá)到最高，說明PAL 在辣椒果實發(fā)育的前、中期影響較大。植物進化出多種防御信號途徑應(yīng)對環(huán)境脅迫和病原體攻擊，苯丙烷途徑為其中1 條重要的代謝途徑[32]。相關(guān)研究結(jié)果表明：低溫等外界環(huán)境因子可誘導(dǎo)PAL快速表達(dá)[33-35]。在本研究中，就同一材料而言，露地栽培的辣椒PAL表達(dá)量與酶活性高于大棚栽培，故推測露地與大棚2 種不同的栽培條件下環(huán)境因子的差異對PAL 酶活性及表達(dá)有影響，如低溫等因素可能誘導(dǎo)辣椒PAL較高表達(dá)，以產(chǎn)生較多次生代謝物質(zhì)來抵御環(huán)境脅迫。通過不同外源物質(zhì)對涮辣進行處理，從整體上看，除H2O2和MT 對涮辣PAL表達(dá)影響較小外，ABA、GA3、MeJA 和SA 處理的影響都較為明顯。相關(guān)研究也報道了在一定時間內(nèi)ABA、GA、SA 和MeJA等植物外源激素能夠誘導(dǎo)植物PAL表達(dá)增加[35-37]。PAL 作為辣椒素生物合成的關(guān)鍵酶，已有研究報道涮辣中PAL 酶活性與辣椒素含量成正比[17]。同一栽培環(huán)境下，涮辣PAL的表達(dá)量與酶活性高于昆明皺皮椒，結(jié)合本研究中涮辣PAL表達(dá)量與其酶活性的正比關(guān)系，暗示涮辣PAL基因的高表達(dá)可能是其辣椒素含量極高的原因。

4 結(jié)論

涮辣與昆明皺皮椒PAL基因和蛋白存在差異，在進化關(guān)系上具有保守性。同時PAL 在涮辣和昆明皺皮椒生長發(fā)育過程中有重要功能，并且參與外源物質(zhì)的調(diào)控。