4 株雞源多殺性巴氏桿菌生物學(xué)特性分析

于 勇，左家坤，王凱民，張 瑤，李思言，韓先干，孫學(xué)強

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，OIE 豬鏈球菌病參考實驗室，江蘇南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 730070；3.南京海關(guān)動植物與食品檢測中心，江蘇南京 210095；4.青島立見生物科技有限公司，山東青島 266144；5.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是導(dǎo)致多種動物巴氏桿菌病的一種重要病原，屬于巴氏桿菌科，為革蘭氏陰性菌，有莢膜，無鞭毛，不運動，不能形成芽孢，亞甲藍染色時呈典型雙極著色。與大部分巴氏桿菌種屬類似，多殺性巴氏桿菌通常是多種動物和鳥類正?？谘饰⑸锶旱慕M成部分，但同時它也是一種條件性致病菌，與多種動物呼吸道綜合征密切相關(guān)[1]。多殺性巴氏桿菌廣泛存在于世界各地，特別是澳大利亞、越南、加拿大和美國等國家流行嚴(yán)重[2-4]。該菌可導(dǎo)致一系列疾病暴發(fā)，如豬萎縮性鼻炎和禽霍亂等。我國學(xué)者對豬多殺性巴氏桿菌遺傳特征有一定研究[5]，但對禽多殺性巴氏桿菌研究較少。

禽多殺性巴氏桿菌是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一，能夠引起禽霍亂，導(dǎo)致家禽急性出血性敗血癥，死亡率高。此外，該病原菌通常與亞急性或慢性胸膜炎相關(guān)。研究[6]表明，禽多殺性巴氏桿菌具有遺傳多樣性，可以垂直和水平傳播，其中通過呼吸道和消化道傳播最常見，此外多殺性巴氏桿菌的種間傳播也被認(rèn)為可在某些條件下發(fā)生。

禽多殺性巴氏桿菌導(dǎo)致禽類死亡的病程從幾小時到幾天不等，其致病性強弱與攜帶的各種毒力因子（VFs）有關(guān)[7-9]，包括莢膜、脂多糖（LPS）、黏附素、鐵調(diào)節(jié)系統(tǒng)、透明質(zhì)酸酶、唾液酸代謝相關(guān)酶等，這些VFs 能夠幫助多殺性巴氏桿菌入侵和抵御宿主的防御系統(tǒng)。研究[10-11]表明，莢膜血清型可能與巴氏桿菌病類型密切相關(guān)，根據(jù)莢膜抗原不同，多殺性巴氏桿菌主要分為5 個莢膜血清型（A、B、D、E 和F），分別由基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD調(diào)控。在我國，禽多殺性巴氏桿菌導(dǎo)致的禽霍亂廣泛流行，但主要集中于南方地區(qū)，且以血清A 型為主。

目前，使用抗生素是預(yù)防和控制巴氏桿菌臨床感染的普遍方法[12]，但其耐藥性問題不可忽視[13-14]。本試驗對4 株臨床分離的雞源多殺性巴氏桿菌的莢膜血清型、毒力基因、耐藥性、生物被膜形成能力等進行分析，以期為禽多殺性巴氏桿菌的致病機制研究和臨床防治提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源 雞源多殺性巴氏桿菌Pm01 和Pm03 株，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)從某雞場病死雞肝臟中分離；1801 和1802 株，保種于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，從江蘇省某雞場病死雞肝臟中分離。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 DL 2 000 DNA Marker、2×HieffTMPCR Master mix 和瓊脂，均購自上海翊圣生物科技有限公司；BHI 培養(yǎng)基，購自美國碧迪公司；M9 培養(yǎng)基，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；MgSO4和CaCl2，購自美國AMRESCO公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302-02），購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 藥敏紙片 甲氧嘧啶、恩諾沙星、阿奇霉素、克林霉素、大觀霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、利福平、復(fù)方新諾明、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考、阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢曲松、頭孢拉定和氨芐西林等20 種藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 試驗動物 1 日齡三黃雞200 只，購自上海市某養(yǎng)雞場，按照相關(guān)動物福利規(guī)定飼喂至21 日齡。

1.2 細(xì)菌基因組提取

將4 株多殺性巴氏桿菌凍存株復(fù)蘇后接種于BHI 培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)期；取1.0 mL 菌液至2.0 mL 離心管中，12 000 r/min離心2 min；棄掉上清，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取巴氏桿菌基因組，保存于-20 ℃，用于后續(xù)PCR 擴增鑒定。

1.3 毒力基因和莢膜血清型PCR 鑒定

按照Townsend 等[15]方法，通過PCR 擴增鑒定4 株多殺性巴氏桿菌的12 種毒力基因（toxA、pfhA、ptfA、nanH、nanB、exBDtonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87、ompH）[16]，及5 種莢膜血清型基因（A 型hyaD-hyaC、B 型bcbD、D 型dcbF、E 型ecbJ和F 型fcbD）[17]。根據(jù)NCBI 相關(guān)參考序列，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，引物序列和目的片段大小見表1，送上海桑尼生物科技有限公司合成。20 μL PCR反應(yīng)體系：2×HieffTMPCR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，多殺性巴氏桿菌菌株DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，并用凝膠記錄系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.4 耐藥性試驗

參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2015 年標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴散法測定4 株多殺性巴氏桿菌的藥物敏感性。將4 株多殺性巴氏桿菌分別在BHI 瓊脂平板上劃線，挑取單個菌落接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)中期；用滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋菌液，使其渾濁度與0.5 的麥?zhǔn)媳葷峁芟喈?dāng)；將稀釋后的菌液分別均勻涂布于BHI 平板培養(yǎng)基表面，每塊平板培養(yǎng)基上貼5 個藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)16～18 h 后用游標(biāo)卡尺測定各種藥物抑菌圈直徑，每株菌均檢測20 種藥物敏感性。抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn)評定參照美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)，抑菌結(jié)果分為敏感、中度敏感（簡稱“中敏”）和耐藥。

1.5 生物被膜形成能力測定

對劃線后的4 株多殺性巴氏桿菌分別挑取單個菌落接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)中期；吸取50 μL 菌液接種至5 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，靜置培養(yǎng)至OD600nm=1.0，4 ℃離心收集菌體，使用BHI 基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗2 次；4 ℃離心收集菌體，分別用BHI、BHI+1%馬血清、BHI+1%葡萄糖培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整至OD600nm=0.3；分別吸取200 μL 菌液加至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，不同培養(yǎng)基重懸的每株菌重復(fù)6 孔，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h；小心棄去上清菌液，加入200 μL PBS 清洗3 遍，晾干后放入烘箱中烤20 min；加入0.1%結(jié)晶紫200 μL，37 ℃孵育染色15 min；棄去結(jié)晶紫，以PBS 清洗3 遍，自然晾干；加入95% 乙醇200 μL 溶解生物被膜，置于搖床（37 ℃、50 r/min）搖20 min，直至完全溶解，最后測定OD595nm。

1.6 半數(shù)致死劑量（LD50）測定

動物試驗根據(jù)國際生物醫(yī)學(xué)研究涉及動物的指導(dǎo)原則（1985 年）進行。將所購的200 只三黃雞飼喂至21 日齡，隨機挑選健康、體質(zhì)量相近的136 只來測定多殺性巴氏桿菌株LD50。將4 菌株分別在BHI 平板上劃線，置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；挑取單菌落置于BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)中期；以PBS 洗滌2 遍，再用PBS 將每株菌稀釋為2×104～2×101CFU/mL 4 個梯度（本試驗前期已測定OD600nm=1.0 時，含菌量為3×108CFU/mL）；將136 只三黃雞隨機分成16 個試驗組和1 個PBS 對照組（8 只/組），對不同試驗組三黃雞分別肌肉注射4 種菌株不同梯度劑量的菌液0.5 mL，即每株菌的攻毒劑量梯度分別為104～101CFU，對照組三黃雞肌肉注射無菌PBS 0.5 mL；觀察記錄所有三黃雞7 d 內(nèi)的死亡數(shù)量，通過改良寇式法計算4 菌株的LD50。

2 結(jié)果

2.1 莢膜血清型鑒定

分別用多殺性巴氏桿菌5 種莢膜血清型引物，對4 株多殺性巴氏桿菌進行PCR 擴增。結(jié)果（圖1）顯示，4 株多殺性巴氏桿菌均為莢膜血清A 型，使用引物hyaD-hyaC-F/R 均能擴增出約l 000 bp 的片段，與預(yù)期條帶大小相符。

2.2 毒力基因擴增

12 種毒力基因的PCR 擴增結(jié)果（圖2）顯示，4 株多殺性巴氏桿菌都含有pfhA、exBDtonB、nanB、oma87、ompH、hgbB、hgbA、sodC、sodA9 種毒力基因，而toxA、nanH、ptfA3 種毒力基因均沒有被檢測到。

2.3 耐藥性試驗

參照NCCLS 藥敏紙片抑菌圈直徑評定標(biāo)準(zhǔn)測定的結(jié)果（表2）顯示：菌株P(guān)m01 對克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、卡那霉素、阿莫西林、頭孢噻吩和氨芐西林等7 種抗生素表現(xiàn)耐藥；菌株P(guān)m03 僅對四環(huán)素表現(xiàn)耐藥；菌株1801 對克林霉素、大觀霉素、四環(huán)素、卡那霉素和新霉素等5 種抗生素表現(xiàn)耐藥；菌株1802 對克林霉素、大觀霉素、四環(huán)素、卡那霉素和新霉素等5 種抗生素表現(xiàn)耐藥。

表2 4 菌株耐藥性試驗結(jié)果

2.4 生物被膜形成能力測定

4 株多殺性巴氏桿菌生物被膜形成能力檢測結(jié)果（圖3）顯示：菌株P(guān)m03、1801 以及1803 幾乎不能形成生物被膜；而無論馬血清存在與否，菌株P(guān)m01 生物被膜形成能力顯著高于其他3 菌株，可形成極強的生物被膜（OD ＞3.0，P＜0.001）。

2.5 LD50 測定

使用4 株多殺性巴氏桿菌對21 日齡三黃雞攻毒，統(tǒng)計攻毒后7 d 內(nèi)三黃雞的死亡情況。通過LD50校正公式計算的結(jié)果（表3）顯示，菌株P(guān)m01、Pm03、1801 和1802 的LD50分別為1.33×10、2.74×102、4.22 和4.22 CFU。

表3 4 菌株LD50 測定結(jié)果

3 討論

引發(fā)巴氏桿菌病的臨床菌株多為莢膜毒力較強的多殺性巴氏桿菌。目前世界范圍內(nèi)引發(fā)多殺性巴氏桿菌病的主要病原菌株包括5 個莢膜血清型（A、B、D、E 和F）和16 種血清型，且以A 型為主，主要引起禽霍亂、豬肺疫、兔巴氏桿菌病等。本研究中，4 株雞源多殺性巴氏桿菌Pm01、Pm03和1801、1802 分別從安徽省和江蘇省雞場患有禽巴氏桿菌病的病死雞肝臟中分離得到，通過莢膜血清型檢測證明均為A 型。

禽巴氏桿菌能引起禽類急性出血性敗血癥，引起的病禽死亡率較高，且成年雞或火雞是其主要攻擊對象。本研究中，4 株禽多殺性巴氏桿菌對雞表現(xiàn)出很高的毒力，僅101～103個CFU 就能引起禽類發(fā)病死亡，推測這與禽多殺性巴氏桿菌攜帶的眾多毒力基因有關(guān)，這些基因包括黏附素基因（pfhA）、鐵攝取蛋白基因（exBDtonB、hgbB、hgbA）、唾液酸酶基因（nanB）、外膜蛋白基因（oma87、ompH）和超氧化物歧化酶基因（sodC和sodA）[9-11]。根據(jù)LD50測定結(jié)果，菌株1801 和1802 毒力明顯強于Pm01 和Pm03，但4 株菌攜帶的毒力基因相同，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是存在其他未知毒力基因。

抗生素在動物養(yǎng)殖業(yè)尤其是養(yǎng)禽業(yè)細(xì)菌性疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用，雖然在生產(chǎn)環(huán)節(jié)帶來了良好收益，但隨著濫用問題的產(chǎn)生，也導(dǎo)致了日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性威脅。研究[18]顯示，臨床分離的多殺性巴氏桿菌已對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。胡恒龍等[19]對安徽省六安市禽多殺性巴氏桿菌進行耐藥性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)32 株臨床株對林可霉素、復(fù)方新諾明、強力霉素和青霉素呈現(xiàn)出較高的耐藥性。此外，近年來禽多殺性巴氏桿菌臨床分離株多呈現(xiàn)出對四環(huán)素類藥物的耐藥性。本研究中4 株雞源多殺性巴氏桿菌臨床株同樣對四環(huán)素表現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性。目前研究[20]認(rèn)為，這種耐四環(huán)素類藥物機制多是由于禽多殺性巴氏桿菌菌株的質(zhì)粒或染色體上攜帶了一種或多種外排泵基因。

生物被膜是細(xì)菌附著在生物或非生物表面，并由胞外基質(zhì)所包裹的系統(tǒng)化、組織化的細(xì)菌多細(xì)胞群落。生物被膜的形成有利于提高細(xì)菌對不利環(huán)境的抵抗，與細(xì)菌的致病性、耐藥性密切相關(guān)。本研究中，相較于其他3 株多殺性巴氏桿菌菌株，無論馬血清存在與否，菌株P(guān)m01 都具有較高的生物被膜形成能力。同時，其藥敏檢測結(jié)果也呈現(xiàn)出更強的耐藥性，對β-內(nèi)酰胺類抗生素（阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻吩）均表現(xiàn)出耐藥性，這一點與預(yù)期相符。此外，編碼β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因也能夠介導(dǎo)細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性，具體機制需要進一步研究。雖然Pm01 菌株能夠形成較強的生物被膜，但其毒力低于1801 和1802 菌株，說明禽多殺性巴氏桿菌的毒力與生物被膜形成能力不完全相關(guān)。