王碩,楊其賢,殷旭薇,孫穎昕
(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江212013;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇常州213004)
結(jié)直腸癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢(shì),其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制復(fù)雜,尚未明確。目前臨床治療結(jié)直腸癌主要通過(guò)手術(shù)及放化療,由于其惡性程度高,患者5年生存率僅為50%左右[1-2]。從基因?qū)用嫣綄そY(jié)直腸癌分子生物學(xué)治療靶標(biāo)以改善患者預(yù)后成為研究熱點(diǎn)。RasGRF1是一種父系印記基因,位于人染色體25q15 上,能夠調(diào)控基因表達(dá),參與腫瘤進(jìn)展[3]。何新等[4]研究顯示,抑制RasGRF1 表達(dá)能夠抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前RasGRF1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能影響的具體機(jī)制尚未明確。隋華等[5]研究顯示,抑制PI3K/Akt 通路活化,能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,提高化療敏感性。目前RasGRF1 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響是否與調(diào)控PI3K/Akt 通路有關(guān)少見報(bào)道,故本研究探究RasGRF1 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并分析其對(duì)PI3K/Akt 通路的影響,以期為臨床治療結(jié)直腸癌提供一定參考。
人結(jié)直腸癌細(xì)胞系DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15 細(xì)胞均由廣東藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存,購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。
DMEM-H 培養(yǎng)基(北京伊塔生物科技有限公司),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(廣州蕊特生物科技有限公司),Lipo-fectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司),si-RasGRF1、si-RasGRF1-NC序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成,CCK-8 試劑盒(深圳市紐邦生物技術(shù)有限公司),Annexin V/PITC 雙染試劑盒(上海復(fù)申生物科技有限公司),兔抗人Caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及β-actin 多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗(武漢亞科因生物技術(shù)有限公司)。
二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司),C1000 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)儀(美國(guó)Bio-Rad 公司),CytoFLEX SRT 型流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。
1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇并解凍DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15 細(xì)胞,置于含10% 滅活FBS+DMEM-H 的培養(yǎng)液,在37℃、5%二氧化碳2、95%氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 天換1 次培養(yǎng)液,傳代培養(yǎng)。
1.3.2 根據(jù)RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量篩選細(xì)胞系分別取1.3.1 中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各細(xì)胞,并提取總RNA、測(cè)濃度,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)??偡磻?yīng)體系20 μL:ULtra SYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2.0 μL、正反向引物各2.0 μL、去離子純化水4.0 μL。反應(yīng)條件:95℃變性15 s,60℃退火60 s,共40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線:60℃至95℃,每15 秒升溫0.3℃。以β-actin 為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR 引物序列見表1。
表1 引物設(shè)計(jì)
1.3.3 細(xì)胞分組及處理1.3.2 結(jié)果顯示DiFi 細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量最高,選其為研究對(duì)象。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DiFi 細(xì)胞,按2.5×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板,待細(xì)胞融合至70%~80%,更換無(wú)FBS 培養(yǎng)液,將細(xì)胞隨機(jī)分為3 組。用無(wú)FBS 的培養(yǎng)液將LipofectamineTM3000 稀釋并分別配制濃度為10 mmol/L 的si-RasGRF1-NC、si-RasGRF1,然后將等體積LipofectamineTM3000 分別與si-RasGRF1-NC、si-RasGRF1 混勻、靜置,加入DiFi 細(xì)胞中,分別作為si-RasGRF1-NC 組(陰性對(duì)照)、si-RasGRF1 組(沉默RasGRF1 表達(dá))。同時(shí)將未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞設(shè)置為NG組(空白對(duì)照)。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h,倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度,每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.3.4 qRT-PCR 檢測(cè)RasGRF1 mRNA 的表達(dá)分別取各組DiFi 細(xì)胞并提取總RNA、測(cè)濃度,參照1.3.2 的方法,計(jì)算各組DiFi 細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。
1.3.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活情況分別取各組DiFi 細(xì)胞,胰蛋白酶消化處理,將細(xì)胞按2.5×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板,培養(yǎng)24 h 后加入CCK-8 試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處各孔細(xì)胞光密度(optic density, OD)值,重復(fù)3 次,嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞OD 值,每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.3.6 AnnexinV/PITC 雙染法檢測(cè)DiFi 細(xì)胞凋亡分別取各組DiFi 細(xì)胞,PBS 溶液洗滌,棄上清液,調(diào)整密度為1×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液,取100 μL 加入AnnexinV/PITC(5 μL)+PI(10 μL,20 μg/mL)混勻,孵育30 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組6 個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.3.7 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/Akt 通路蛋白的表達(dá)分別取各組DiFi 細(xì)胞,以RIPA 裂解并提取總蛋白,電泳、轉(zhuǎn)膜,放入5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h,分別加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Caspase-3 及內(nèi)參β-actin 作為一抗(1∶500 稀釋),4℃過(guò)夜,加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1 000),室溫孵育1 h,顯影、定影,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15 細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為(1.00±0.15)、(0.69±0.11)、(0.73±0.12)、(0.45±0.07),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=222.059,P=0.005),DiFi 細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量最高(P<0.05),選擇DiFi 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
NG 組、si-RasGRF1-NC 組、si-RasGRF1 組RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為(1.00±0.15)、(0.99±0.16)和(0.71±0.11),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=324.568,P=0.000),si-RasGRF1 組低于NG 組和si-RasGRF1-NC 組(P<0.05),說(shuō)明DiFi 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。
NG 組、si-RasGRF1-NC 組、si-RasGRF1 組DiFi細(xì)胞OD 值分別為(0.87±0.15)、(0.85±0.13)和(0.37±0.06),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2 883.063,P=0.000),si-RasGRF1 組低于NG 組和si-RasGRF1-NC 組(P<0.05)。
NG 組、si-RasGRF1-NC 組、si-RasGRF1 組DiFi細(xì)胞凋亡率分別為(9.15±1.38)%、(9.03±1.36)%和(25.78±3.87)%,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=396.215,P=0.000),si-RasGRF1 組高于NG 組和si-RasGRF1-NC 組(P<0.05)。見圖1。
圖1 各組DiFi細(xì)胞流式細(xì)胞圖
NG 組、 si-RasGRF1-NC 組、 si-RasGRF1 組DiFi 細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果:si-RasGRF1組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于NG組和si-RasGRF1-NC 組(P<0.05),Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于NG 組和si-RasGRF1-NC 組(P<0.05)。見表2和圖2。
圖2 各組DiFi細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白的表達(dá)
表2 各組DiFi細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)
表2 各組DiFi細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)
注:?與NG組、si-RasGRF1-NC組比較,P <0.05。
組別NG組si-RasGRF1-NC組si-RasGRF1組F 值P 值Caspase-3 0.36±0.06 0.40±0.08 0.97±0.16?261.329 0.000 p-PI3K/PI3K 1.08±0.17 1.06±0.16 0.45±0.08?324.015 0.000 p-Akt/Akt 1.15±0.18 1.17±0.18 0.51±0.08?331.5241 0.000
結(jié)直腸癌是惡性程度較高的消化道腫瘤之一,發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第三位,目前臨床治療仍以手術(shù)輔以放化療為主,但未能取得較理想的療效[6]。RasGRF1 是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白,能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為,參與腫瘤進(jìn)展[7]。聶文靜等[8]研究顯示,RasGRF1在結(jié)直腸癌組織中異常高表達(dá),作為促癌基因參與結(jié)直腸癌進(jìn)展。文獻(xiàn)報(bào)道,下調(diào)RasGRF1 表達(dá)能對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用,對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮促進(jìn)作用[4]。
腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵,其中Caspase-3 是凋亡過(guò)程的關(guān)鍵執(zhí)行者[9-10]。本研究選擇DiFi 細(xì)胞進(jìn)行研究,成功轉(zhuǎn)染DiFi 細(xì)胞,且結(jié)果顯示,與NG 組、si-RasGRF1-NC 組比較,si-RasGRF1 組DiFi 細(xì)胞存活率降低,凋亡率升高。與既往研究結(jié)果一致,說(shuō)明抑制RasGRF1 表達(dá)能夠抑制DiFi 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PI3K 是PI3K/Akt 信號(hào)通路的起始因子,其活化產(chǎn)生第二信使PIP3,進(jìn)而磷酸化Akt 蛋白的Thr308位點(diǎn),促使Akt 活化;而活化的Akt 發(fā)生磷酸化,最終抑制下游靶基因Caspase-3 的表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡[11-13]。馬家馳等[14]研究顯示,抑制PI3K/Akt 通路活化能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。既往研究顯示,上調(diào)RasGRF1 表達(dá)能促進(jìn)Ras-PI3K-Akt 通路活化,參與腫瘤成纖維細(xì)胞增殖及分化[15]。本研究結(jié)果顯示,與NG 組、si-RasGRF1-NC 組比較,psi-RasGRF1組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低,Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,說(shuō)明抑制RasGRF1表達(dá)能抑制DiFi 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其作用可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt 通路活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
綜上所述,RasGRF1 在人結(jié)直腸癌DiFi 細(xì)胞中異常高表達(dá)。抑制RasGRF1 表達(dá)可能抑制PI3K/Akt通路活化,從而抑制DiFi 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而本實(shí)驗(yàn)未能明確RasGRF1 對(duì)PI3K/Akt 通路的具體調(diào)控作用,后期應(yīng)進(jìn)行深入研究。
中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志2022年6期