氟苯尼考中間體氟代物含量的檢測方法

王新江(浙江康牧藥業(yè)有限公司，浙江 嵊州 312400)

0 引言

氟苯尼考(Florfenicol)學名為氟甲砜霉素，屬于當前一種較為新型的酰胺醇類抗生素。該藥物由美國公司先靈-葆雅公司在1988年研制成功，是一種獸醫(yī)專用的氯霉素類光譜抗菌類藥物[1]。該藥物雖然由美國公司研發(fā)，但是首次是在日本上市，隨后在挪威上市，藥品名稱為Aquatlor。在1955年，法國引進該藥物并將其命名為Nuflor。而我國引進相對較晚，在1999年才正式批準該藥物為國家二類新獸藥。目前，氟苯尼考已經(jīng)在獸醫(yī)臨床方面應用較多，主要用于防治細菌類疾病，例如治療牛呼吸道方面由巴氏桿菌引起的感染、乳腺炎等，家禽類的大腸桿菌和禽霍亂等病癥。但是近年來，隨著世界上禽畜養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，禽畜業(yè)臨床方面的細菌感染也隨之出現(xiàn)較大的變化，朝著混合及復雜性方向發(fā)展。為更好的應對上述變化，近年來相繼有大量耐氟苯尼考菌株的出現(xiàn)，同時一些氟苯尼考藥物的不規(guī)范使用使得藥物出現(xiàn)較大的毒性[2]。因此有必要研究一些新型的制劑技術，改善當前氟苯尼考藥物性能。

綜合近些年的相關研究可知，國內外都開展關于氟苯尼考及其代謝產(chǎn)物的檢測，尤其是在中間體氟代物的檢測取得一定的成果。為更好的應用氟苯尼考，有必要研究其生產(chǎn)過程中相關問題，從而提高療效與生物利用度。

1 理化性質

氟苯尼考的結構式具體如圖1所示，其化學名為D(+)-蘇-1-對甲砜基苯基-2-二氯乙酰胺-3-氟丙醇，分子式為C12H14Cl2FNO4S，分子量為358.22。氟苯尼考作為一種氟化衍生物，類似于氯霉素，二者同樣不具有硝基，所以同樣具有不會引起畜禽類的再生障礙性貧血[3]。氟苯尼考為白色或者類白色的結晶性粉末，無臭，極其容易溶解于二甲基酰胺，能夠較好溶解在甲醇，冰醋酸中微融，在水或者氯仿中極微融。

圖1 氟苯尼考結構圖

2 抗菌機理

氟苯尼考在發(fā)揮抗菌作用時，其主要機理變現(xiàn)在同70S核蛋白體的50S亞基為目標靶點，同該靶點位置的A位實現(xiàn)緊密結合，從而有效阻礙了肽?；D移酶的轉肽反應，阻止其肽鏈的延伸，從而抑制細菌蛋白質合成，實現(xiàn)抗菌效果。細菌在進化過程中，已經(jīng)逐步對氯霉類藥物出現(xiàn)了耐藥性，上述特征的出現(xiàn)主要是和細菌的耐藥基因有關[4]。早在1996年就已經(jīng)實現(xiàn)了對氟苯尼考耐藥基因pp-FloR的分離鑒定，隨后在2000年和2002年先后發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌的氟苯尼考耐藥基因。從上述發(fā)現(xiàn)成果中，可以看出主要是由于病原細菌產(chǎn)生了氯霉素乙酰轉移酶，也就是氯霉素和甲砜霉素最為容易誘發(fā)上述情況的出現(xiàn)。

氟苯尼考作為動物專用的抗菌素藥物，在禽畜業(yè)應用廣泛，因此當前對于應用方式和應用效果研究較多，但是關于氟苯尼考的原料生產(chǎn)和制劑生產(chǎn)研究相對較少，尤其是關于如何有效控制雜質殘留方面更是鮮見。對于氟苯尼考生產(chǎn)過程中，原料中及其容易存在一些雜質，對于不同企業(yè)而言，由于其工藝和技術的不同，因此在生產(chǎn)氟苯尼考的原料質量方面，也都是略有差異。對于氟苯尼考原料生產(chǎn)，其雜質主要包含D-乙酸，甲砜氨，D-乙酯等其他的一些氟代物中間體[5]。這些雜質的存在，降低了氟苯尼考在應用的有效性，主要是降低了在水溶液中的溶解性，即使在后期采用一定的技術手段提高藥物的溶解性，但是同時也提高了雜質的溶解性，對于氟苯尼考的最大溶解度而言依舊起不了多大作用。因此在實際應用中，即使加倍或者加數(shù)倍使用藥物，由于畜禽飲水的水線末端藥物濃度幾乎保持不變，因此在臨床方面不會出現(xiàn)藥效提升的跡象。在上述雜質中，尤其是中間體氟代物，對于氟苯尼考的質量影響最為明顯，因此有必要對氟苯尼考的生產(chǎn)進行中間體氟代物的檢測，從而衡量當前氟苯尼考生產(chǎn)質量的合理有效性。

3 關于氟苯尼考中間體氟代物的含量檢測

目前在國內，關于開展氟苯尼考制劑檢測的方法主要有電位滴定法，紫外分光光度法和旋光法，高效液相、氣相色譜法等[6]。當前企業(yè)在開展氟代物含量的檢測中，最為常用的方式就是采用氣相色譜法，該方法將氟代物用乙醇溶解后，直接將溶液進入氣相色儀中，檢測氟代物的含量，乙醇溶劑影響氟代物含量計算，該方法誤差比較大，準確度較差，檢測時間偏長，對生產(chǎn)的指導意義不理想。因此本文將采用液相方法進行研究，以便快速準確檢測氟代物含量。氟苯尼考的合成一般以D-對甲砜基苯絲氨酸乙酯為起始原料，經(jīng)硼氫化鉀還原反應，然后與二氯乙腈發(fā)生環(huán)合反應得到環(huán)合物，環(huán)合物再與氟化劑(試劑，F(xiàn)PA)發(fā)生氟化反應，得到中間體氟代物，然后再經(jīng)水解脫色、結晶、離心、干燥、粉碎、混合、包裝得到氟苯尼考產(chǎn)品。氟代物的分子式為C12H12Cl2FNO3S，分子量為340，氟代物的主要成分含量直接影響到后續(xù)生產(chǎn)氟苯尼考的含量與雜質殘留。因此，精確及時檢驗氟代物含量既能可以指導企業(yè)生產(chǎn)，又可以提升企業(yè)氟苯尼考產(chǎn)品質量。

4 實驗部分

4.1 主要儀器

Agilent 1260液相色譜，賽默飛U3000液相色譜儀；C18色譜柱；天子天平；50mL容量瓶。

4.2 主要試劑

色譜乙腈；色譜甲醇；純化水；色譜級三氟乙酸。

4.3 實驗方法

4.3.1 色譜條件

色譜柱：SB-C18 150 nm×5 μm×4.6 μm；波長：223 nm；檢測器：UV檢測器。

流動相A：乙腈；流動相B: 0.075%三氟乙酸水溶液。

流速為 1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量 5 μL。

流動相B配制：取純凈水1 000 mL，加三氟乙酸0.75 mL，混勻，用0.45 μm的水系濾膜抽濾。

流動相梯度分析如表1所示。

表1 方法流動相梯度

4.3.2 實驗方法

稱取氟代物25 mg(精確于0.000 1 g)，置于50 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶解并定容至量瓶刻度，搖勻后濾過，取5 μL濾液進入液相色譜儀中，記錄色譜峰，按面積歸一法進行定量計算氟代物含量。

5 結果與討論

5.1 檢測波長的選擇

氟代物用甲醇溶解后，通過紫外波長掃描，發(fā)現(xiàn)氟代物在223 nm處有較大紫外吸收，為此方法確定檢測波長為223 nm，如圖2 所示。

圖2 氟代物光譜掃描曲線圖

5.2 流動相的選擇

分別使用不同比例的甲醇、乙腈、水作為流動相，對試樣進行分離、色譜峰形條件的選擇，結果表明，用乙腈與0.075%三氟乙酸水溶液為流動相，并進行梯度分析，分離度效果較好，滿足檢測分析要求，且檢測成本低，檢測時間短。典型色譜圖如圖3所示。

圖3 氟代物典型色譜圖

5.3 方法精密度試驗

準確稱取同一樣品的6個平行樣，在上述色譜條件下進行平測定，計算其標準偏差和RSD，6次平行測定結果如表2所示。

表2 不同氟代物樣品平測定結果

5.4 專屬性和準確度測試結果

精密稱取氟代物5份，每份中加一定量的中間體環(huán)合物，在相同的色譜條件下測定，氟代物與環(huán)合物的分離度符合要求，環(huán)合物的存在不影響氟代物含量檢測，結果如表3和圖4所示。

圖4 氟代物樣品測試數(shù)據(jù)曲線

表3 氟代物樣品測試結果表

6 結語

試驗結果表明，用本方法測定氟苯尼考中間體氟代物含量具有較高的精密度和準確性，環(huán)合物與氟代物有良好的分離度，該方法操作簡單、快速，是一種較為理想的快速分析方法，便于生產(chǎn)質量控制。