蘋果樹腐爛病病原種類及其親緣關(guān)系分析

李亞鵬，張王斌,2，儀子博

(1塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2塔里木大學(xué)南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】我國蘋果樹的栽植面積、總產(chǎn)量均位于世界第一[1]。新疆獨(dú)特的氣候光熱資源和區(qū)域比較優(yōu)勢，為阿克蘇地區(qū)發(fā)展優(yōu)勢特色林果業(yè)提供得天獨(dú)厚的自然條件[2-3]，阿克蘇地區(qū)蘋果果面光滑細(xì)膩、色澤光亮、皮薄、肉質(zhì)脆、口感風(fēng)味極佳。阿克蘇地區(qū)的蘋果種植業(yè)屬于典型的沙漠綠洲農(nóng)業(yè)，不僅具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且還起著防風(fēng)固沙的作用[4]。蘋果樹腐爛病(Valsamali)是蘋果樹上一種具有毀滅性的病害。蘋果樹腐爛病在國內(nèi)已有記錄[5-7]，2008新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第四師蘋果樹腐爛病大爆發(fā)，果樹死亡率達(dá)40%；2013～2014年阿克蘇地區(qū)10年樹齡的蘋果樹上腐爛病平均發(fā)生率為30%，發(fā)病嚴(yán)重的果園發(fā)病率高達(dá)80%[8]。蘋果樹腐爛病主要危害蘋果樹的枝干，可使蘋果樹樹皮腐爛壞死，刮開發(fā)病部位為褐色，當(dāng)側(cè)枝上的樹皮壞死1周時(shí)會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)輸送終止，使病部以上部分不能結(jié)果，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。當(dāng)主干發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響樹體運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致樹勢衰弱，最終導(dǎo)致樹體死亡，阿克蘇地區(qū)的蘋果樹腐爛病發(fā)生日益嚴(yán)重，研究蘋果樹腐爛病菌的種類及其親緣關(guān)系，對有效防治蘋果樹腐爛病有重要意義[9-10]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘋果樹腐爛病主要由殼囊孢屬真菌引起，殼囊孢屬(Cytospora)屬于子囊菌門(Asco-mycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、間座殼目(Diaporthales)、黑腐皮殼科(Valsaceae)。將病原菌命名為ValsamaliMiyabeet[11]。臧睿和桂騰茸等[12-13]的研究已明確我國的蘋果樹腐爛病菌是由V.maliMiyabeetYamada、V.malicolaZ.Urb、V.persoonii(=Leucostompersoonii)和V.ceratosperma4個(gè)種類組成。其中V.mali種下又可以劃分為Valsamalivar.Mali(Vmm)和Valsamalivar.Pyri(Vmp)2個(gè)不同的變種，并明確Vmm為我國蘋果樹腐爛病中最主要的致病菌；杜琴等[14]的研究鑒定出新疆林木腐爛病菌主要為V.malicola、V.sordida、V.ceratosperma；劉應(yīng)敏等[15]已對新疆蘋果樹腐爛病菌的Cytosporaschulzeri(有性型V.malicola)進(jìn)行具體研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前相關(guān)研究多集中于如何提高果品果質(zhì)及經(jīng)濟(jì)效益，且該地區(qū)的蘋果樹腐爛病菌種類還尚未明確。需研究蘋果樹腐爛病菌的種類及其親緣關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以阿克蘇地區(qū)不同區(qū)域蘋果樹腐爛病病樣為材料，采用常規(guī)組織分離法和枝條燙傷接種法分離和鑒定菌株，記錄形態(tài)學(xué)特征和發(fā)病情況，研究阿克蘇地區(qū)蘋果樹腐爛病病菌種類、培養(yǎng)形狀、致病性等，為病害的診斷及抗病品種篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 發(fā)病枝條與樹皮

隨機(jī)采集從阿克蘇地區(qū)紅旗坡農(nóng)場(N41°15′23″E 81°17′54″)和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)一師5團(tuán)7連(N41°22′26″E 80°45′19″)蘋果園6份發(fā)病枝條和樹皮(含有健康組織)，放置于牛皮紙袋備用。表1

表1 樣品采集信息

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[16](PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂條20 g、蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)液(PD培養(yǎng)液)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水 1 000 mL。

接種枝條：從塔里木大學(xué)校園內(nèi)采集1～2年生健康蘋果樹枝條。

1.1.2 儀器

中科美菱超低溫冷凍儲(chǔ)存箱、SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)、DHG-9240(A)數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、THZ-C氣浴恒溫振蕩器、MLS-3750桌上型蒸汽滅菌鍋、GXZ-436B智能光照恒溫培養(yǎng)箱、AL204電子分析天平、D8023CTL-K4微波爐、Power Basic基礎(chǔ)型電泳儀電源、Chemi Dos XRS熒光和化學(xué)放光成像分析系統(tǒng)、nexus GSX1基因擴(kuò)增儀、Mastercycler pros梯度PCR儀C1000、HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋、ML203電子天平、Heraeus Pico21小型離心機(jī)、Multifuge XIR高速冷凍離心機(jī)。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分離、培養(yǎng)及保存

病原菌分離采用常規(guī)組織分離法[15]，用無菌手術(shù)刀片在枝條及樹皮刮取5×5(mm)含有典型腐爛病病征的組織塊，然后用75%的乙醇消毒30s，0.1%升汞消毒30s，無菌水反復(fù)浸洗3次，將組織塊置于無菌濾紙晾干后移至準(zhǔn)備好的PDA平板上(每個(gè)平板放3～5塊組織塊)。于25℃恒溫光暗交替培養(yǎng)3 d，待長出菌落后，純培養(yǎng)，獲得純化菌株。接種于PDA斜面試管中，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)性狀觀察

將接種純化菌株的PDA平板置于25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。從第2 d開始每天定點(diǎn)觀察菌落的顏色、形狀、菌絲生長量、及菌絲氣生情況，記錄產(chǎn)孢體的形成時(shí)間、大小、數(shù)目及分布，采用十字交叉法測量菌落生長速度。

1.2.3 致病性測定

參考臧睿等[17]的接種方法加以改動(dòng)。在塔里木大學(xué)校園內(nèi)選取1～2年生健康的蘋果枝條，截成15～20 cm的小段，自來水沖洗干凈后用75%的乙醇浸泡10 min，用無菌水沖洗。將枝條表皮用燒熱的打孔器(直徑5 mm)間隔一定距離燙傷。從已在PDA平板上生長3 d的各分離株菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，將帶有菌絲的一面貼在燙傷處并將枝條放置在裝有少量無菌水的錐形瓶中。每個(gè)錐形瓶中3根枝條，每根枝條上2個(gè)接種點(diǎn)，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，以無菌PDA餅作為對照。將錐形瓶置25℃恒溫培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)，于第5、10和15 d觀察記錄發(fā)病情況，采用十字交叉法測量病斑擴(kuò)展速度。

1.2.4 菌株DNA提取

1.2.4.1 藥品及試劑

(1)PD培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，制作方法同PDA培養(yǎng)基，高壓滅菌后室溫保存。

(2)0.5 mol/L EDTA(乙二胺四乙酸，pH 8.0)：將18.61 g Na2EDTA·2H2O溶于70 mL ddH2O，滴加10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，用ddH2O定容至100 mL，高壓滅菌后室溫保存。

(3)2.0 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)：將24.20 g Trisbase溶于80 L ddH2O，滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0，用ddH2O定容至100 mL，高壓滅菌后室溫保存。

(4)2%(w/v)CTAB提取緩沖液(十六烷基三甲基溴化銨)：將2 g CTAB溶于50 mL ddH2O，分別加入5 mL 2.0 mol/L Tris-HCl、4 mL 0.5 mol/L EDTA、28 mL 5.0 mol/L NaCl溶液，然后定容至100 mL，封裝后高壓滅菌。

(5)TE緩沖液(pH 8.0)：0.5 mL 2.0 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.2 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)，定容至100 mL，封裝后高壓滅菌。

(6)1.4 mol/L NaAc(醋酸鈉)：將11.48 g NaAc溶解于80 mL ddH2O，然后定容至100 mL，封裝后高壓滅菌。

(7)5.0 mol/L NaCl溶液：將29.22 g NaCl溶于90 mL ddH2O，全部溶解后定容至100 mL。

(8)苯酚：氯仿：異戊醇(V/V/V=25∶24∶1)溶液：將50 mL苯酚、48 mL氯仿、2 mL異戊醇相溶，棕色玻璃瓶避光保存。

(9)氯仿：異戊醇(V/V=24∶1)溶液：將96 mL氯仿、4 mL異戊醇相溶，棕色玻璃瓶避光保存。

1.2.4.2 菌絲提取

將分離的菌株接種在PDA平板上，在25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后，用直徑5 mm的打孔器打取菌餅轉(zhuǎn)接到含有100 mL PD培養(yǎng)液的錐形瓶中，置于25℃恒溫?fù)u床160 r/min震蕩培養(yǎng)5 d。之后用4層滅菌紗布過濾菌絲體，再用無菌水沖洗3遍，用滅菌的吸水紙吸出多余水分，并用烘干箱烘干，將烘干的菌絲轉(zhuǎn)移到離心管，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 菌株基因組DNA提取

參考唐俊煜等[18]采用改良的CTAB法提取腐爛病菌株基因組總DNA。將CTAB緩沖液放置于65℃水浴鍋預(yù)熱1 h，將異戊醇和NaAc置于-20℃的冰箱內(nèi)預(yù)冷。將菌絲體放入研缽中，加入液氮將菌絲體快速研磨成粉，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。將預(yù)熱完成的CTAB緩沖液加入到離心管中并充分震蕩搖勻，置于65℃水浴40～60 min，期間輕搖3～4次；加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)，震蕩搖勻10 min，4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液；加入等量氯仿：異戊醇(24∶1)，震蕩搖勻10 min，4℃、13 000 r/min離心5 min，取上清液；加入1/10體積的1.4 mol/L NaAc和等體積的異丙醇，將離心管置于-20℃冰箱中沉淀2 h；沉淀完成后4℃、13 000 r/min離心5 min，取沉淀，用75%的乙醇洗滌2～3次，加入適量的TE緩沖液溶解沉淀。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.4 基因片段的PCR擴(kuò)增

選取β-tubulin和EF-1α2個(gè)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，β-tubulin基因的擴(kuò)增選用通用引物Bt2a(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′)和Bt2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)，EF-1α基因的擴(kuò)增選用引物EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)和EF-986R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)。2種基因片段的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照唐俊煜[18]的方法進(jìn)行：β-tubulin 基因PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，共38個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min,終止反應(yīng);EF-1α基因PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，終止反應(yīng)。將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物送至上海生工科技股份有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

獲得β-tubulin和EF-1α序列后，在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上BLAST進(jìn)行同源性對比及分析，并下載同源序列。利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法[19](Neighbor-Joining，NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDA培養(yǎng)3 d菌落形態(tài)差異

研究表明，從病樣的典型病斑處經(jīng)過分離、純化出11個(gè)真菌菌株。根據(jù)培養(yǎng)3 d時(shí)的菌落顏色可分為淡黃色和乳白色兩類菌株，其中淡黃色菌株有7個(gè)，分別為：HQP2-1、HQP2-2、HQP2-3、HQP2-4、YLC3-1、YLC3-2，占63.64%；乳白色菌株有4個(gè)，分別為：HQP3-1、YLC1-1、YLC1-2、YLC2-1，占36.36%。圖1

圖1 PDA培養(yǎng)3 d時(shí)的菌落形態(tài)

2.2 兩類菌株培養(yǎng)性狀比較

2.2.1 培養(yǎng)性狀

研究表明，15 d時(shí)的菌落顏色主要以黃褐色為主；各菌落平均生長速度為20 mm/d，且2 d時(shí)的菌落直徑存在一定的差異淡黃色菌落平均生長速率高于乳白色菌株；淡黃色菌落為放射狀，乳白色菌落為羽毛狀，且均未產(chǎn)生氣生菌絲。在阿克蘇地區(qū)以無氣生菌絲的蘋果樹腐爛病菌為主要種。表2

表2 兩類菌株培養(yǎng)性狀

2.2.2 致病性關(guān)系比較

研究表明，分離出的11株菌株均可使健康蘋果枝條發(fā)病，在接種3 d后開始出現(xiàn)明顯的水漬狀病斑，發(fā)病部位皺縮且內(nèi)陷，與健康部位交界處有明顯的界限。在接種15 d后病斑蔓延至整根枝條，表皮下的組織全部呈褐色，且有酒糟味。乳白色菌株接種的枝條上出現(xiàn)明顯的黑色點(diǎn)狀物，淡黃色菌株接種的枝條均未產(chǎn)生黑色點(diǎn)狀物，2種類型的菌株致病性存在一定的差異。從各個(gè)發(fā)病枝條上再分離得到與原來相同的菌株。其中只有2株產(chǎn)生黑色點(diǎn)狀物，占18.18%，說明不產(chǎn)生黑色點(diǎn)狀物的菌株為優(yōu)勢種。圖2

圖2 致病性

2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 β-tubulin序列

研究表明，HQP2-1、HQP2-2、HQP2-3、HQP2-4和V.ceratosperma(KC840674.1)及其無性型C.sacculus(KP195740.1、KP195741.1)聚為一枝，相似度為100%，以上4個(gè)菌株均為V.ceratosperma親緣關(guān)系很近的生理小種。YLC3-1，YLC1-1、YLC1-2和YLC2-1分別與登錄號(hào)為KT934370.1、KT934367.1的V.mali聚為一枝，相似度分別為93%和87%，這4個(gè)菌株均為與V.mali具有一定遺傳分化的小種。圖3

圖3 β-tubulin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ)

2.3.2 EF-1α序列

研究表明，HQP3-1，YLC1-1、YLC1-2、YLC3-1、YLC3-2，HQP2-1、HQP2-2、HQP2-3、HQP2-4與V.mali及其無性型C.mali不同登錄號(hào)聚為一枝，相似度分別為100%、99%、95%，以上9個(gè)菌株均為與V.mali親緣關(guān)系較近或具有一定遺傳分化的小種。圖4

圖4 EF-1α序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ)

2.3.3 病原鑒定結(jié)果

研究表明，共鑒定出10個(gè)菌株，4個(gè)乳白色菌株和2個(gè)淡黃色菌株鑒定結(jié)果為V.mali，占60%，說明V.mali在PDA上的培養(yǎng)性狀具有不同類型，且以乳白色類型為主；其余4個(gè)淡黃色菌株鑒定結(jié)果為V.ceratosperma，占40%。表3

表3 蘋果樹腐爛病菌鑒定

3 討 論

根據(jù)菌株類型及在PDA上培養(yǎng)性狀發(fā)現(xiàn)，研究與郭開發(fā)[20]對V.mali和V.ceratosperma的研究結(jié)果一致，但是殼囊孢屬Cytospora種類較多，分布范圍廣，種間的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀具有很高的相似性，僅依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)準(zhǔn)確鑒定十分困難。因此，研究結(jié)合β-tubulin、EF-1α序列分析對病原菌進(jìn)行鑒定。但2種分析方法在結(jié)果上也存在一定的差異，僅通過β-tubulin或EF-1α一種序列分析無法鑒定病原菌到具體的種類，每種序列片段分析存在一定的局限性，在研究系統(tǒng)發(fā)育時(shí)需要采用多基因序列分析法，才能使結(jié)果的準(zhǔn)確性得到提高。

鑒定得各菌株為V.mali或V.ceratosperma，且V.mali為天山南簏蘋果樹腐爛病主要致病種，這與臧睿[17]和桂騰茸[13]等的研究結(jié)果一致。杜琴[14]和郭開發(fā)[20]均在新疆蘋果樹上分離得到V.malicola，且劉應(yīng)敏等[15]證實(shí)V.malicola的無性型C.schulzeri可使新疆蘋果樹發(fā)病。研究并未分離出V.malicola，其余結(jié)果與杜琴及郭開發(fā)等研究結(jié)果一致。V.malicola在杜琴和郭開發(fā)分離出的菌株中占比未達(dá)1%，該菌在新疆的分布少，由于采集地點(diǎn)不同和研究樣品數(shù)量較少導(dǎo)致研究未能分離得V.malicola。

4 結(jié) 論

淡黃色菌株為V.mali或V.ceratosperma，乳白色菌株為V.mali。故天山南簏蘋果樹腐爛病菌為黑腐皮殼屬V.mali(無性型C.mali)和V.ceratosperma(無性型C.sacculus)，其中V.mali為天山南簏的主要致病種，在PDA上存在不同類型的培養(yǎng)性狀。