“痛風(fēng)關(guān)節(jié)康”對(duì)高尿酸血癥和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型動(dòng)物干預(yù)作用的機(jī)制研究

何婧琳 楊麗萍 朱瀟旭 段小花

（云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500）

痛風(fēng)是嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致血中尿酸升高引起的一組臨床癥候群，是一種常見的關(guān)節(jié)炎疾病，主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)劇痛、紅腫發(fā)熱[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，痛風(fēng)的患病率約2%，在40歲以上伴有代謝綜合征的男性中尤其常見[2]。痛風(fēng)發(fā)作時(shí)疼痛劇烈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來，痛風(fēng)患病人數(shù)正逐年增加，不僅造成醫(yī)療成本增加，也加劇了社會(huì)成本消耗[3]。臨床將持續(xù)高水平的尿酸狀態(tài)定義為高尿酸血癥，目前認(rèn)為高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)生的基礎(chǔ)[4]。高水平的尿酸導(dǎo)致不溶性尿酸鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)處沉積，形成痛風(fēng)石，當(dāng)痛風(fēng)石晶體脫落，誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致劇烈的疼痛[5]。

目前痛風(fēng)的治療藥物有針對(duì)痛風(fēng)發(fā)作期的藥物和降尿酸藥物。前者主要為抗炎鎮(zhèn)痛藥，如秋水仙堿、非甾體抗炎藥和激素類藥物，這類藥物消炎止痛快，但沒有降尿酸的作用，且大多數(shù)藥物不良反應(yīng)明顯；后者如別嘌呤醇、苯溴馬隆等藥物，這類藥物可以通過抑制尿酸產(chǎn)生或促進(jìn)尿酸排泄而實(shí)現(xiàn)降尿酸的作用，但對(duì)急性發(fā)作的關(guān)節(jié)炎不僅無(wú)益，還會(huì)加重癥狀或延長(zhǎng)病程，亦伴隨不同程度的不良反應(yīng)[6-7]。盡快終止急性關(guān)節(jié)炎發(fā)作、降低血尿酸水平，是目前國(guó)內(nèi)外臨床治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的基本策略。因此，研發(fā)同時(shí)能抗炎鎮(zhèn)痛又能改善血尿酸代謝的藥物，是目前痛風(fēng)藥物研究的重要方向之一。

痛風(fēng)關(guān)節(jié)康是云南少數(shù)民族地區(qū)民族民間醫(yī)生治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的常用經(jīng)驗(yàn)方，長(zhǎng)期臨床實(shí)踐表明該方兼具安全性和有效性。本實(shí)驗(yàn)建立高尿酸血癥和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，研究痛風(fēng)關(guān)節(jié)康治療痛風(fēng)的作用機(jī)制，為痛風(fēng)關(guān)節(jié)康的臨床應(yīng)用以及后續(xù)進(jìn)一步開發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半。SPF級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量（18±22）g，雌雄各半。大小鼠均購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（川）2013-24。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均符合《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》要求和云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑和藥物 痛風(fēng)關(guān)節(jié)康藥物組成：羌活10 g、獨(dú)活10 g、威靈仙10 g、雞血藤30 g、鉤藤15 g、絡(luò)石藤15 g、海風(fēng)藤15 g，上述藥物分別加相當(dāng)于藥材量7倍、5倍和3倍量的冷水，第一次浸泡30 min后依次煮沸45 min、35 min和25 min，合并3次濾液，濃縮備用，由云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。酵母（英國(guó)OXOID公司，批號(hào)1173143）；苯溴馬隆（宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1108003）；秋水仙堿片（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：11BF）；尿酸鈉（Sigma，批號(hào)：BCBF1330V）；尿酸（UA）測(cè)試盒（貨號(hào)：C012-2），黃嘌呤氧化酶（XOD）測(cè)試盒（貨號(hào)：A002-1），肌酐（Cr）測(cè)試盒（貨號(hào)：C011-2），尿素氮（BUN）測(cè)試盒（貨號(hào)：C013-2），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；大鼠骨保護(hù)素（OPG）Elisa試劑盒（貨號(hào)：CKE30510R），大鼠白介素-6（IL-6）Elisa試劑盒（貨號(hào)：CK-E30646R），大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）Elisa試劑盒（貨號(hào)：CK-E30635R），大鼠白介素-1β（IL-1β）Elisa試劑盒（貨號(hào)：CK-E30419R），均購(gòu)自蘇州卡爾文生物科技有限公司；小鼠瘦素（LEP）Elisa試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號(hào)：CK-E20015M）。

1.3 主要儀器 全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀（VaricsKar）；超 純 水 機(jī)Smart 2 Pure UV/VF（美 國(guó)Thermofisher）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾Primo R）；混合器（江蘇省海門市實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備及給藥方法 按照隨機(jī)數(shù)字表法將48只Wistar大鼠分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和痛風(fēng)關(guān)節(jié)康低、中、高劑量組，每組8只，雌雄各4只。正常對(duì)照組灌胃給予生理鹽水，其余各組大鼠分別灌胃給予秋水仙堿（28 mg/kg）、痛風(fēng)關(guān)節(jié)康（生藥量分別為9.9、29.7、49.5 g/kg），連續(xù)灌胃4 d后，除正常對(duì)照組外的其余各組大鼠在右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉晶體（5 mg/只），正常對(duì)照組則注射無(wú)菌生理鹽水，5 h后取血檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.2 高尿酸血癥小鼠模型制備及給藥方法 按照隨機(jī)數(shù)字表法將48只昆明種小鼠分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和痛風(fēng)關(guān)節(jié)康低、中、高劑量組，每組8只，雌雄各半。正常對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃，其余各組小鼠每日灌胃給予酵母（20 g/kg），于灌胃的第4日開始，各給藥組同時(shí)分別灌胃給予苯溴馬?。?0 mg/kg）及痛風(fēng)關(guān)節(jié)康（生藥量分別為14.3、42.9、71.5 g/kg），各組繼續(xù)灌胃4 d后取血檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.3 生化及免疫檢測(cè) 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠和小鼠，腹主動(dòng)脈取血后1000×g離心15 min，取上清液，-20 ℃分裝冷藏，分別按相應(yīng)的試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組動(dòng)物血清中UA、XOD、Cr、BUN、LEP、OPG、IL-6、TNF-α和IL-1β水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 痛風(fēng)關(guān)節(jié)康對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的影響

3.1.1 各組大鼠血清UA和XOD水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清UA和XOD水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組和痛風(fēng)關(guān)節(jié)康中、高劑量組大鼠血清UA水平明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），各給藥組大鼠血清XOD水平均明顯低于模型組（P＜0.01）；痛風(fēng)關(guān)節(jié)康中、高劑量組大鼠血清XOD水平明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。上述指標(biāo)痛風(fēng)關(guān)節(jié)康各劑量組組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清UA和XOD水平比較（x-±s）

3.1.2 各組大鼠腎功能指標(biāo)水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清Cr和BUN水平顯著升高（P＜0.01）；各給藥組大鼠Cr和BUN水平均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；痛風(fēng)關(guān)節(jié)康高劑量組大鼠BUN水平明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）。上述指標(biāo)痛風(fēng)關(guān)節(jié)康各劑量組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清Cr和BUN水平比較（x-±s）

3.1.3 各組大鼠血清LEP、OPG、IL-6、TNF-α和IL-1β水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠LEP、IL-6、TNF-α和IL-1β水平均顯著升高，OPG水平顯著下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各給藥組大鼠血清LEP、IL-6、TNF-α、IL-1β水平均明顯低于 模 型 組（P＜0.05，P＜0.01），OPG水平明顯高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；痛風(fēng) 關(guān)節(jié)康中、高劑量組大鼠血清LEP和TNF-α水平明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）；痛風(fēng)關(guān)節(jié)康高劑量組大鼠血清TNF-α水平明顯低于低、中劑量組（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清LEP、OPG、IL-6、TNF-α和IL-1β水平比較（x-±s）

3.2 痛風(fēng)關(guān)節(jié)康對(duì)高尿酸血癥小鼠的影響

3.2.1 各組小鼠血清UA和XOD水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清UA和XOD水平均顯著升高（P＜0.01）；各給藥組小鼠血清UA和XOD水平均明顯低于模 型 組（P＜0.05，P＜0.01）；痛風(fēng)關(guān)節(jié)康各劑量組小鼠上述指標(biāo)均明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）；上述指標(biāo)痛風(fēng)關(guān)節(jié)康各劑量組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠血清UA和XOD水平比較（x-±s）

3.2.2 各組小鼠腎功能指標(biāo)水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清Cr和BUN水平均顯著升高（P＜0.01）；各給藥組小鼠血清Cr、BUN水平均顯著低于模 型 組（P＜0.05，P＜0.01）；痛風(fēng)關(guān)節(jié)康高劑量組小鼠血清BUN水平顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）；痛風(fēng)關(guān)節(jié)康高劑量組小鼠Cr和BUN水平顯著低于低、中劑量組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠血清Cr、BUN水平比較（x-±s）

3.2.3 各組小鼠血清LEP、OPG、IL-6、TNF-α和IL-1β水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清OPG含量顯著降低（P＜0.01），LEP、IL-6、TNF-α、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；各給藥組小鼠上述指標(biāo)均較模型組顯著改善（P＜0.05，P＜0.01）；痛風(fēng)關(guān)節(jié)康低、高劑量組小鼠血清IL-6水平，痛風(fēng)關(guān)節(jié)康各劑量組小鼠血清IL-1β水平均明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）；痛風(fēng)關(guān)節(jié)康高劑量組小鼠血清IL-6水平顯著低于低、中劑量組（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠血清LEP、OPG、IL-6、TNF-α和IL-1β水平比較（x-±s）

4 討論

高尿酸血癥是痛風(fēng)的重要臨床特征，長(zhǎng)期高尿酸血癥可引發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、指趾關(guān)節(jié)畸形或痛風(fēng)性腎病等。降低UA在整個(gè)痛風(fēng)治療過程中，對(duì)防止痛風(fēng)發(fā)作和防止惡化方面具有重要意義。本研究我們采用酵母灌胃復(fù)制了高尿酸血癥小鼠模型，探討痛風(fēng)關(guān)節(jié)康對(duì)高尿酸血癥的影響；采用在踝關(guān)節(jié)處注射尿酸鈉晶體建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，研究痛風(fēng)關(guān)節(jié)康對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用。由于在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)于小鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉晶體存在注射失敗率高、模型成功率低的問題，因此本研究中急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型采用大鼠作為研究對(duì)象。研究結(jié)果表明，高尿酸血癥模型小鼠血清UA和XOD水平顯著高于正常對(duì)照組，表明高尿酸血癥模型建立成功；急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)顯著紅腫，且血清炎癥因子水平明顯高于正常對(duì)照組，說明模型建立成功。

高尿酸血癥本身無(wú)癥狀，但其附帶有嚴(yán)重的腎臟損傷[8]。血清BUN、Cr是衡量腎功能的主要指標(biāo)，可直接反映腎小球的濾過功能和腎小管的重吸收功能。本研究結(jié)果顯示，痛風(fēng)關(guān)節(jié)康可呈劑量依賴地降低高尿酸血癥和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型動(dòng)物血清BUN和Cr水平，說明其具有一定程度的腎臟保護(hù)作用。UA水平還與XOD活性密切相關(guān)，XOD在UA生成過程中發(fā)揮著重要的作用，能夠催化次黃嘌呤核苷酸發(fā)生連續(xù)氧化反應(yīng)，使次黃嘌呤繼續(xù)氧化為黃嘌呤，最終生成尿酸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，痛風(fēng)關(guān)節(jié)康的降尿酸作用與XOD活性調(diào)節(jié)有關(guān)。且在兩個(gè)動(dòng)物模型中，痛風(fēng)關(guān)節(jié)康對(duì)XOD的抑制作用顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥苯溴馬隆或秋水仙堿。

在體內(nèi)，過量的尿酸主要以鈉鹽的形式沉積在關(guān)節(jié)腔、軟組織、軟骨和腎臟等處，形成尿酸鹽結(jié)晶，尿酸鹽結(jié)晶通過激活吞噬細(xì)胞、炎性體、TOLL樣受體等途徑參與痛風(fēng)性炎癥反應(yīng)，與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，尿酸鹽結(jié)晶能夠刺激血液和關(guān)節(jié)液中單核細(xì)胞釋放大量IL-1β，IL-1β被認(rèn)為是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的重要炎性介質(zhì)之一，在炎癥的發(fā)生和消退中起著非常關(guān)鍵的作用，曾有研究者提出以IL-1β抑制為目的，開發(fā)專一的IL-1β抑制劑進(jìn)行痛風(fēng)治療[10-11]。IL-1β大量釋放后激活NF-κB信號(hào)通路，引起大量TNF-α、IL-6、IL-1等促炎因子的表達(dá)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[12]。其中IL-6是參與大多數(shù)骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的前炎癥因子，通過刺激B細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，研究表明IL-6的含量與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病情密切相關(guān)[13]。而TNF-α水平在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病早期會(huì)出現(xiàn)明顯升高，刺激下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，激發(fā)巨噬細(xì)胞釋放IL-1β和IL-1，導(dǎo)致炎癥范圍進(jìn)一步擴(kuò)大[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，痛風(fēng)關(guān)節(jié)康在實(shí)現(xiàn)抗痛風(fēng)作用的過程中，IL-1β、TNF-α和IL-6介導(dǎo)了其調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的過程，這可能是痛風(fēng)關(guān)節(jié)康的抗痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)中，痛風(fēng)關(guān)節(jié)康對(duì)炎癥因子的作用沒有呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴，特別是對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，這可能與中藥復(fù)方多成分作用的結(jié)果有關(guān)。

高尿酸導(dǎo)致的長(zhǎng)期微炎癥環(huán)境可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和成熟，導(dǎo)致骨形成和吸收失衡，引發(fā)骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松是導(dǎo)致痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)畸形和致殘的主要因素之一[15]。研究表明，LEP可作用于成骨細(xì)胞而抑制骨形成，加重炎癥，從而導(dǎo)致急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病或加重[16]。OPG是對(duì)抗骨質(zhì)疏松的重要因子，可抑制破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡和病態(tài)骨吸收，增加骨密度。本研究結(jié)果顯示，高尿酸血癥模型和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型動(dòng)物血清中LEP水平升高，OPG水平降低，痛風(fēng)關(guān)節(jié)康能夠調(diào)節(jié)兩者水平，提示痛風(fēng)關(guān)節(jié)康也通過干預(yù)骨代謝的過程而發(fā)揮抗痛風(fēng)的作用。

綜上，本研究通過建立高尿酸血癥小鼠模型和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，評(píng)價(jià)了痛風(fēng)關(guān)節(jié)康的抗痛風(fēng)作用。結(jié)果顯示，痛風(fēng)關(guān)節(jié)康可通過保護(hù)腎功能、調(diào)節(jié)XOD的活性而改善高尿酸血癥，同時(shí)可以通過抑制IL-1β等炎癥因子的生成、改善骨形成來發(fā)揮抗痛風(fēng)的作用。研究結(jié)果表明，痛風(fēng)關(guān)節(jié)康對(duì)兩種動(dòng)物模型的作用與陽(yáng)性對(duì)照藥苯溴馬隆和秋水仙堿相比，具有類似或更強(qiáng)的效果。本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物水平上研究了痛風(fēng)關(guān)節(jié)康作為抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和降尿酸藥物的可行性，并初步探討了其作用機(jī)制，為痛風(fēng)關(guān)節(jié)康在少數(shù)民族地區(qū)的使用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為新型抗痛風(fēng)藥物的開發(fā)提供思路。由于本研究只探討了痛風(fēng)關(guān)節(jié)康水提物對(duì)痛風(fēng)的作用，而復(fù)方成分復(fù)雜，作用具有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，對(duì)痛風(fēng)關(guān)節(jié)康作用的有效組分和內(nèi)在機(jī)制研究將是我們下一步的方向。