高雪琴，劉航江，張雨菁，付 麗

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州)

牛肉是優(yōu)質(zhì)且重要的肉類食物，牛肉中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而牛肉中的脂肪和膽固醇含量卻比豬肉等肉類低[1]。中醫(yī)認(rèn)為，牛肉有補(bǔ)中益氣、滋養(yǎng)脾胃、強(qiáng)健筋骨、化痰息風(fēng)等功效，是食補(bǔ)佳品。

我國(guó)肉牛業(yè)經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，已基本形成獨(dú)立的產(chǎn)業(yè)，在畜牧業(yè)中占比越來(lái)越大[2]。隨著居民生活水平不斷提高，人民的膳食結(jié)構(gòu)有了很大改善，牛肉也因其豐富的蛋白質(zhì)、維生素含量和較低的脂肪與膽固醇，越來(lái)越受到大眾的歡迎。

雖然我國(guó)肉牛生產(chǎn)呈現(xiàn)良好的發(fā)展態(tài)勢(shì)，但牛肉質(zhì)量卻沒(méi)有快速提高。我國(guó)高檔牛肉的份額還不到牛肉總產(chǎn)量的5%。牛肉的加工一直沿用傳統(tǒng)的工藝，產(chǎn)品口感堅(jiān)韌、肉質(zhì)較老、纖維較粗，牛肉嫩度欠佳，嚴(yán)重影響到牛肉的食用品質(zhì)[3]。國(guó)內(nèi)餐廳所需的高檔牛肉大都源于國(guó)外進(jìn)口。

在提高牛肉品質(zhì)的各個(gè)因素中，牛肉的嫩度影響很大，也是消費(fèi)者評(píng)定肉質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。牛肉的嫩化方法有很多種，如機(jī)械嫩化法、超高壓嫩化法、超聲波嫩化法、電刺激嫩化法、碳酸鹽嫩化法、鹽酸半胱氨酸嫩化法、多聚磷酸鹽嫩化法、蛋白酶嫩化法、激素嫩化法等[4]。蛋白酶作為一種綠色、安全且高效的酶制劑廣泛應(yīng)用于肉制品加工行業(yè)，在提高肉制品嫩度、提升肉制品品質(zhì)以及改善肉制品的風(fēng)味上發(fā)揮著重要作用[5]。蛋白酶使用技術(shù)的發(fā)展也為肉制品的工藝優(yōu)化、革新提供了技術(shù)支持?，F(xiàn)在食品行業(yè)中應(yīng)用較為普遍的酶有木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶等。

不同蛋白酶具有較強(qiáng)的專一性。謝正林等[6]通過(guò)提取菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶，并對(duì)其進(jìn)行嫩化對(duì)照處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明其提取的菠蘿蛋白酶嫩化效果比木瓜蛋白酶好。Ha[7]研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶、生姜蛋白酶、中華獼猴桃蛋白酶和菠蘿蛋白酶四種植物蛋白酶都能有效地水解牛肉中的肌原纖維和膠原蛋白，其中木瓜蛋白酶水解肌原纖維蛋白質(zhì)的效果較好，而生姜蛋白酶對(duì)結(jié)締組織降解效果最好。李雨林等[8]通過(guò)相差顯微鏡鏡檢無(wú)花果蛋白酶和木瓜蛋白酶嫩化后的牛肉細(xì)胞的變化，并以剪切力為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)無(wú)花果蛋白酶的嫩化效果明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶，并對(duì)無(wú)花果蛋白酶的嫩化工藝進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化工藝為在濃度0.01%、pH7.0、溫度50 ℃的條件下嫩化處理2 h。徐靜等[9]以剪切力為指標(biāo)，對(duì)蛋白酶進(jìn)行篩選后復(fù)配，最終篩選出無(wú)花果蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶進(jìn)行復(fù)配，添加量分別為0.06%、0.1%、0.06%，并采用響應(yīng)面分析數(shù)據(jù)得出最佳工藝：復(fù)合蛋白酶在添加量為0.04%，pH8.5，溫度45 ℃，處理時(shí)間35 min的條件下，牛肉的剪切力達(dá)到最小值，此時(shí)牛肉嫩度最佳，牛肉的形態(tài)保持也相對(duì)完整，復(fù)合蛋白酶嫩化效果明顯好于單一蛋白酶。

改善牛肉嫩度成為近年來(lái)學(xué)者研究的熱點(diǎn)，在眾多方法中，外源酶嫩化法因具有操作簡(jiǎn)單、不需要額外增加設(shè)備、基本不改變生產(chǎn)工藝、顯著提高牛肉嫩度等優(yōu)點(diǎn)，受到肉類研究者的重視[10]。目前關(guān)于蛋白酶嫩化肉制品效果的研究大多集中在單一蛋白酶上。不同的蛋白酶嫩化處理有各自的缺點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)，并受周邊環(huán)境的影響，而復(fù)合蛋白酶的嫩化效果可以彌補(bǔ)單一蛋白酶的缺點(diǎn)，比單一蛋白酶的嫩化效果更明顯。但復(fù)合蛋白酶對(duì)牛肉嫩化效果的影響研究較少。

基于前人的研究，本實(shí)驗(yàn)以牛里脊肉為原料，選取木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶這三種嫩化效果較好的蛋白酶，對(duì)它們進(jìn)行復(fù)合，以牛肉的剪切力、持水度、蒸煮損失為指標(biāo)，研究最佳復(fù)合添加量配比及其最佳工藝條件，為復(fù)合蛋白酶嫩化肉制品的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)材料與來(lái)源

1.2 主要儀器

如表2所示。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牛肉的預(yù)處理

選用新鮮的牛里脊肉，去除牛肉表面的脂肪、筋膜、軟骨等物質(zhì)，然后對(duì)牛肉進(jìn)行切塊、修整，使每塊牛肉重量為50 g，且按照肌纖維方向切塊，牛肉的大小形狀保持一致。然后用自來(lái)水沖洗掉淤血，放入不銹鋼盤(pán)子中瀝去表面水分備用。

表2 實(shí)驗(yàn)儀器與來(lái)源

1.3.2 牛肉的嫩化處理

根據(jù)濃度要求用緩沖溶液配制成30 mL的酶液置于蒸煮袋中，放入預(yù)先處理好的牛肉塊，使牛肉在酶液中酶解均勻，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，置于一定溫度的恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解。

1.3.3 蛋白酶的復(fù)配

在pH值為7.0，水浴溫度40 ℃，酶解90 min的條件下，根據(jù)前人研究結(jié)果，從三種蛋白酶的酶添加量中選3個(gè)水平：菠蘿蛋白酶添加量0.02%、0.03%、0.04%[11]；木瓜蛋白酶添加量0.02%、0.03%、0.04%[12]；無(wú)花果蛋白酶添加量0.01%、0.02%、0.03%[8]。設(shè)計(jì)三因素(三種酶)三水平(添加量)的正交實(shí)驗(yàn)，以剪切力為指標(biāo)，摸索復(fù)合蛋白酶的最佳添加量配比。

1.3.4 復(fù)合蛋白酶單因素實(shí)驗(yàn)

以剪切力為指標(biāo)，固定其它三個(gè)嫩化因素不變，分別對(duì)復(fù)合蛋白酶的添加量、處理時(shí)間、處理溫度、處理pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，得出每個(gè)單因素的最優(yōu)水平，每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)不少于3個(gè)平行，并與空白組進(jìn)行對(duì)照。

1)酶添加量的影響

將處理好的牛肉塊分別浸泡于添加量為0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%的pH7.0酶液中，在40 ℃條件下，酶解1.5 h，測(cè)剪切力值。

2)酶解時(shí)間的影響

將處理好的牛肉塊浸泡在最佳酶添加量制成的30 mL酶液中，在40 ℃、pH值為7.0條件下酶解0.5、1、1.5、2、2.5 h，測(cè)剪切力值。

3)酶解溫度的影響

將處理好的牛肉塊浸泡在最佳酶添加量制成的30 mL、pH值為7.0的酶液中，在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃條件下水浴到最佳時(shí)間后，測(cè)剪切力值。

4)酶解pH值的影響

將處理好的牛肉塊浸泡在最佳酶添加量制成的30 mL酶液中，調(diào)節(jié)酶液pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在最佳溫度下酶解最佳時(shí)間，測(cè)剪切力值。

1.3.5 復(fù)合蛋白酶的工藝條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上以牛肉的剪切力大小、牛肉持水度、蒸煮損失為指標(biāo)，選取復(fù)合蛋白酶添加量、處理時(shí)間、處理溫度、處理pH四個(gè)因素，每個(gè)因素取三水平設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以綜合平衡法進(jìn)行分析，研究復(fù)合蛋白酶的優(yōu)化工藝。

1.3.6 牛肉剪切力測(cè)定

參考付麗等[13]的方法并稍作改動(dòng)。將嫩化處理后的牛肉，放入蒸煮袋中，盡量將袋中空氣排出，放入80 ℃恒溫水浴鍋中加熱，直至牛肉中心溫度達(dá)到70 ℃后，保持10 min，取出牛肉，冷卻至室溫后，按肌纖維方向切成大小為1.5 cm×1.5 cm×2 cm的樣品，質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定TAP質(zhì)構(gòu)分析，每個(gè)樣品測(cè)定3次，計(jì)算剪切力的平均值，并以沒(méi)有嫩化處理的牛里脊肉作為對(duì)照。

質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定參數(shù)：使用TA32/1000探頭，TA-VBJ咬斷夾具，測(cè)定TAP質(zhì)構(gòu)分析，探頭運(yùn)行方式為循環(huán)2次，下行速度5 mm/s，返回速度為5 mm/s，目標(biāo)距離10.00 mm。

1.3.7 牛肉持水度測(cè)定

參考?？颂m[14]的方法并稍作改動(dòng)，使用加壓濾紙法進(jìn)行測(cè)定。取10 g嫩化后的牛肉，用濾紙吸干表面水分后，對(duì)其重量W1進(jìn)行精確稱量，然后取干凈紗布將肉樣包裹兩層，上下分別使用16層干燥濾紙將其夾住，置于肉品系水力測(cè)定儀加壓平臺(tái)上，加壓50 kg，保持5 min，立即取出，精確稱取重量W2，按照(式2-1)計(jì)算持水度。

持水度/%=(W1-W2)/W1×100

(式2-1)

式中：W1為肉樣加壓前的質(zhì)量/g；W2為肉樣加壓后的質(zhì)量/g。

1.3.8 牛肉蒸煮損失度的測(cè)定

稱取一定量嫩化好的牛肉，用濾紙吸干其表面水分，精確稱量其質(zhì)量m1，放于蒸煮袋中，在80 ℃水浴鍋中加熱。當(dāng)牛肉的中心溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，保持10 min，取出樣品，冷卻至常溫，用濾紙擦干表面水分，然后精確稱量其質(zhì)量m2。蒸煮損失度按(式2-2)計(jì)算。

蒸煮損失度/%=(m1-m2)/mL×100

(式2-2)

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶復(fù)合的正交實(shí)驗(yàn)

蛋白酶復(fù)合的正交實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表3、表4。

表3 蛋白酶復(fù)合正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表4 蛋白酶復(fù)合正交實(shí)驗(yàn)表

本實(shí)驗(yàn)以剪切力為指標(biāo)，判斷牛肉嫩度的大小，由表4可知，極差的大小為C>A>B，所以對(duì)牛肉嫩度影響力的強(qiáng)度為：菠蘿蛋白酶對(duì)嫩度品質(zhì)的影響最大，其次是無(wú)花果蛋白酶，木瓜蛋白酶對(duì)牛肉嫩度的影響相對(duì)較小。由于剪切力越小，牛肉的嫩度越好，根據(jù)k值的大小，可以看出復(fù)合蛋白酶嫩化牛肉的最佳配比為：A2B1C1，即復(fù)合蛋白酶的配比為：無(wú)花果蛋白酶添加量為0.02%、木瓜蛋白酶添加量為0.02%、菠蘿蛋白酶添加量為0.02%。

2.2 復(fù)合蛋白酶的單因素分析

2.2.1 復(fù)合蛋白酶添加量的影響

如圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)牛肉嫩化效果產(chǎn)生一定的影響。隨著復(fù)合蛋白酶添加量的增加，牛肉的剪切力顯著下降，當(dāng)復(fù)合蛋白酶添加量為0.06%時(shí)，牛肉的嫩化效果較好，但隨著復(fù)合蛋白酶添加量的增加，牛肉的剪切力變化雖然有所下降但是變化不大，且添加量過(guò)高時(shí)，牛肉形態(tài)有一定損壞。綜合考慮，選擇0.06%為復(fù)合蛋白酶的最佳添加量。

圖1 復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)牛肉嫩度的影響

2.2.2 復(fù)合蛋白酶嫩化時(shí)間的影響

如圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶的酶解時(shí)間對(duì)牛肉的嫩化效果具有一定的影響，隨著復(fù)合蛋白酶酶解時(shí)間的增加，牛肉的剪切力逐漸下降，嫩度較好，當(dāng)嫩化時(shí)間為2.5 h時(shí)，牛肉的剪切力最小，并且還有下降趨勢(shì)，但此時(shí)牛肉形態(tài)完整性較差，組織松散，綜合考慮較為適宜的嫩化時(shí)間為1～2 h。

2.2.3 復(fù)合蛋白酶嫩化溫度的影響

如圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶嫩化時(shí)的溫度對(duì)牛肉嫩度具有一定的影響。隨著溫度的上升，牛肉的平均剪切力逐漸下降，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，牛肉的平均剪切力值最低，此時(shí)嫩度最好，但隨著溫度的上升，酶活性受到影響，牛肉的平均剪切力逐漸有所回升，超過(guò)50 ℃以后，變化較為明顯。復(fù)合蛋白酶嫩化最適溫度為45 ℃。

圖2 復(fù)合蛋白酶嫩化時(shí)間對(duì)牛肉嫩度的影響

圖3 復(fù)合蛋白酶嫩化時(shí)溫度對(duì)牛肉嫩度的影響

2.2.4 pH對(duì)復(fù)合蛋白酶嫩化效果的影響

如圖4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶嫩化時(shí)pH對(duì)嫩化效果也有一定的影響。隨著pH值的增加，牛肉的平均剪切力逐漸下降。當(dāng)pH值為8.0時(shí)，復(fù)合蛋白酶平均剪切力最低，說(shuō)明接近復(fù)合蛋白酶的最適pH，當(dāng)pH為9.0時(shí)，平均剪切力有所回升。所以選pH8.0為復(fù)合蛋白酶最適pH。

圖4 復(fù)合蛋白酶嫩化時(shí)pH對(duì)牛肉嫩度的影響

2.3 復(fù)合蛋白酶工藝條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響的因素作為正交實(shí)驗(yàn)的因素，并在最優(yōu)水平的基礎(chǔ)上，選取上下兩個(gè)有嫩化意義的水平，進(jìn)行下一步的正交實(shí)驗(yàn)，如表5、表6。

表5 復(fù)合蛋白酶嫩化條件正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表6 復(fù)合蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表7可知，不同的因素對(duì)三種指標(biāo)的影響程度是有一定差異的，不同指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的優(yōu)化方案也是不同的，因此需要對(duì)此次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行綜合平衡，分析如下：

因素A：在三個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)中A因素均為較次要因素。相比較之下，A因素對(duì)持水度的影響稍大，僅次于D因素，且A因素和D因素極差值相近，明顯大于B因素和C因素，A因素的三個(gè)水平相差較大。而在剪切力和蒸煮損失度這兩個(gè)指標(biāo)中，A因素的影響力明顯靠后，且各水平間相差不大。所以選取A1。

因素B：對(duì)于這三個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)而言，都是以B3為最佳水平，所以B因素取B3。

因素C：對(duì)于持水度和蒸煮損失率這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，都是取C1為佳，而且對(duì)于蒸煮損失率這個(gè)指標(biāo)，C因素是最主要的因素，在確定最優(yōu)水平時(shí)應(yīng)著重考慮。對(duì)于剪切力來(lái)說(shuō)，取C3為好，從Ki(ki)可以看出，C因素取C1和C3時(shí)，剪切力相差不大，而且從極差值來(lái)看，C因素為較為次要的因素。所以根據(jù)多數(shù)傾向和C因素對(duì)不同指標(biāo)的重要程度，選取C1。

表7 復(fù)合蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

因素D：對(duì)于剪切力和持水度這兩個(gè)指標(biāo)，D因素均為最主要影響因素，且都是取D2好。對(duì)于蒸煮損失率，D因素的k1、k2值分別為43.29和43.39，可以看出D取D1、D2時(shí)，蒸煮損失率相差不大，且從極差來(lái)看，D為較次要因素。所以綜合多數(shù)據(jù)影響的因素，D值取D2。

綜合上述分析，優(yōu)方案為A1B3C1D2，即復(fù)合蛋白酶添加量為0.06%(無(wú)花果蛋白酶0.02%(100 U/g)、木瓜蛋白酶0.02%(20 U/g)、菠蘿蛋白酶0.02%(20 U/g))、嫩化時(shí)pH值為9.0、嫩化時(shí)溫度40 ℃、嫩化時(shí)間2 h。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，將木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶進(jìn)行復(fù)配，研究出復(fù)合蛋白酶的最佳添加量配比，即無(wú)花果蛋白酶0.02%(100 U/g)、木瓜蛋白酶0.02%(20 U/g)、菠蘿蛋白酶0.02%(20 U/g)。再對(duì)復(fù)合蛋白酶進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明復(fù)合蛋白酶的添加量、嫩化時(shí)溫度、pH值、嫩化時(shí)間均對(duì)復(fù)合蛋白酶的嫩化效果產(chǎn)生影響。當(dāng)復(fù)合蛋白酶添加量為0.06%時(shí)，牛肉剪切力達(dá)到最低；嫩化時(shí)間為2 h時(shí)，綜合剪切力與組織狀態(tài)達(dá)到最好水平；當(dāng)pH值為8時(shí)，牛肉剪切力達(dá)到最低；當(dāng)嫩化溫度為45 ℃時(shí)，剪切力達(dá)到最低水平。

復(fù)合蛋白酶的正交實(shí)驗(yàn)與未經(jīng)嫩化處理的對(duì)照組相比，復(fù)合蛋白酶對(duì)牛肉嫩化效果具有明顯影響。嫩化處理的時(shí)間對(duì)牛肉的剪切力以及持水度影響最大，當(dāng)嫩化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)牛肉的形態(tài)完整性受到破壞，因此牛肉失水較多，持水力差。處理溫度對(duì)烹飪損失影響最大，溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，會(huì)影響到酶的活性，從而對(duì)牛肉的剪切力、持水度、烹飪損失產(chǎn)生影響。

通過(guò)綜合平衡法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，復(fù)合蛋白酶的最佳工藝條件為：在添加量為0.06%、40 ℃、pH值為9.0的條件下，嫩化2 h。