徐麗梅，陳煉紅

(西南民族大學 食品科學與技術(shù)學院，成都 610041)

紫薯(Ipomoeabatatas)，屬于旋花科，又叫黑薯，薯肉呈紫色至深紫色[1]，有豐富的營養(yǎng)價值，且具有抗衰老，降血壓，預防動脈硬化，改善機體功能，降低基因突變的可能性等保健作用[2-4]。人體衰老、心血管病甚至癌癥等疾病的產(chǎn)生與惡化的主要誘因是人體內(nèi)活性氧自由基(包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等)以及其代謝產(chǎn)物的增多[5-6]，生活中，人們攝入適量含有抗氧化劑的食品能一定程度上清除或抑制自由基化合物，減少其對人體的傷害。

多聚糖，又叫多糖，是一類維持生命所需生命有機體、不具有甜味和強還原性的天然的大分子物質(zhì)，具有復雜的生物活性與功能，例如儲存能量、防御功能和抗氧化性等[7-8]，還包括調(diào)節(jié)免疫力[9-11]，協(xié)助消化系統(tǒng)分解食物，保護肝臟[12-13]和調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)等[14-15]保健作用。目前多糖的提取方法主要有酸堿提取法、超聲波輔助提取法[16]、超高壓輔助結(jié)合水提法和酶法等[17-18]。紫薯多糖作為植物多糖，可采用酶法提高提取效率，利用酶在適宜條件下催化水解細胞壁，從而加快多糖釋放的速度。

目前國內(nèi)對于紫薯多糖的研究大多集中于提取方法和對油脂以及動物為試驗體的抗氧化試驗。本試驗則是通過對紫薯多糖的羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)和1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)清除能力的測定，并以相應濃度的抗壞血酸作為對照，對其抗氧化活性進行評價，將為后續(xù)相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫薯：購自河南南陽，放置在55 ℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎，過100目篩，得紫薯粉，在干燥器中保存，備用；纖維素酶(40 U/mg)、果膠酶(BR)、木瓜蛋白酶(2 U/mg)、無水乙醇、苯酚、檸檬酸、三氯乙酸、抗壞血酸、濃硫酸、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)、水楊酸、過氧化氫、丙酮、硫酸亞鐵、Tris-HCl、乙醚、鄰苯三酚：均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TD4A臺式離心機 長沙英豪儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；MP511 pH計 上海三信儀表廠；BCD-243K冰箱 河南新飛電器公司；DHG-9203A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；UV-2102C/PC/PCS紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 復合酶法提取紫薯多糖工藝

工藝流程：紫薯→前處理→溶解→調(diào)節(jié)pH→添加復合酶→酶解→滅酶→離心取上清液→除蛋白→靜置→離心取上清液→醇沉→離心取沉淀→洗滌→烘干→復溶→粗多糖溶液[19-21]。

1.2.2 紫薯多糖含量的測定方法

1.2.2.1 葡萄糖溶液標準曲線的繪制

使用葡萄糖標準溶液作為標準物，采用苯酚-硫酸法[22]，于波長490 nm處測吸光度。以吸光度值OD(A)為縱坐標，葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，制作葡萄糖標準曲線。所得回歸方程為：A=17.177x-0.0223(x為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)，A為吸光度)，R2=0.9981，線性關(guān)系良好。

1.2.2.2 多糖含量的測定

取1.0 mL粗多糖溶液置于帶塞比色管中，加UP水至2.0 mL。將質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL分別用1.0 mL和5.0 mL的移液管加入到帶塞比色管中，10 min室溫靜置，搖勻，放于30 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm波長處測吸光度，并計算樣品中多糖得率。

式中：ω為樣品中多糖得率，%；c為樣液的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容的體積，mL；M為所取紫薯粉末重量，g。

1.2.3 復合酶法提取紫薯多糖單因素試驗

在紫薯多糖提取工藝的基礎(chǔ)上，對提取工藝中的液料比、復合酶添加量、酶解pH、酶解時間、酶解溫度等因素進行工藝優(yōu)化，并通過計算多糖得率確定最佳的工藝參數(shù)，具體單因素試驗設(shè)計見表1。

1.2.4 Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選提取紫薯多糖關(guān)鍵因素

根據(jù)單因素試驗確定5個影響因素復合酶添加量、酶解溫度、液料比、酶解時間、酶解pH值合適的反應范圍，運用Minitab 17軟件進行Plackett-Burman試驗設(shè)計及關(guān)鍵因素篩選試驗[23]，試驗設(shè)計見表2。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計的因素、水平和編碼

1.2.5 響應面優(yōu)化復合酶法提取紫薯多糖

在單因素試驗及關(guān)鍵因素篩選設(shè)計試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)置酶解溫度、液料比、酶解時間、復合酶添加量為試驗變量，將多糖得率設(shè)置為響應值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理，并運用Design-Expert 8.0.2 軟件設(shè)計出試驗組，從而開展四因素三水平響應面設(shè)計試驗，并對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)整理和分析，得出復合酶法紫薯多糖最佳提取工藝參數(shù)[24]。其中，響應面設(shè)計因素與水平見表3。

表3 響應面設(shè)計因素與水平Table 3 The factors and levels of response surface design

1.2.6 紫薯多糖的抗氧化活性試驗

運用體外抗氧化活性研究的方法，測定紫薯多糖對·OH、O2-·及DPPH·的清除能力，并在一定條件下與抗壞血酸做對比來評價紫薯多糖的抗氧化活性。

1.2.6.1 紫薯多糖對·OH清除能力的測定

分別取濃度為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的多糖溶液2.0 mL，依次加入9 mmol/L水楊酸-乙醇2 mL，9 mmol/L FeSO42 mL，在37 ℃下，添加8.8 mmol/L H2O22 mL，反應時間0.5 h，以加入UP水為空白對照組，以相同質(zhì)量濃度的Vc溶液作為對照，在510 nm下測量吸光度?！H自由基清除率(Q，%)計算公式如下：

Q(%)=[1-(HX-HX0)/H0]×100%。

式中：H0為空白組的吸光度；HX為試驗組的吸光度；HX0為UP水代替H2O2溶液作為參比的吸光度。

1.2.6.2 紫薯多糖對DPPH·清除能力的測定

分別取2.0 mL濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的多糖溶液，依次加入2.0 mL 0.1 mmol/L 濃度DPPH溶液，混勻后暗室靜置40 min，以蒸餾水作空白，用相同質(zhì)量濃度的Vc溶液作為對照，在波長517 nm處測定吸光度值。DPPH·自由基清除率(Q，%)計算公式如下：

Q(%)=[1-(HX-HX0)/H0]×100%。

式中：H0為空白組的吸光度；HX為試驗組的吸光度；HX0為參比的吸光度。

1.2.6.3 紫薯多糖對O2-·清除能力的測定

分別取濃度為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的多糖溶液，加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)，置于25 ℃恒溫水浴鍋中，水浴20 min，再加入0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液混勻后于25 ℃水浴中靜置5 min；以蒸餾水作空白試驗，以相同質(zhì)量濃度的Vc溶液作為對照，測定其在325 nm處的吸光度值。O2-·清除率(Q，%)計算公式如下：

Q(%)=[1-(HX-HX0)/H0]×100%。

式中：H0為空白組的吸光度；HX為試驗組的吸光度；HX0為參比的吸光度。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同液料比對紫薯多糖提取率的影響

由圖1可知，當液料比在20∶1～30∶1之間時，多糖提取率隨之增加而增加，超過30∶1(mL/g)時，提取率逐漸下降，即在30∶1(mL/g)處達到最大值2.701%。導致該現(xiàn)象的原因可能是液料比的增大，短時間達到多糖提取的平衡點；相反，當液料比過小時，所有多糖未充分溶出而呈現(xiàn)上升趨勢。因此，由液料比單因素試驗可知，將液料比設(shè)置為30∶1(mL/g)時紫薯多糖的提取效果最佳。

圖1 不同液料比對紫薯多糖提取率的影響

2.1.2 不同復合酶添加量對紫薯多糖提取率的影響

由圖2可知，酶的添加量低于4%時，紫薯多糖得率緩慢上升，4%時達到頂峰，為2.739%。酶的添加量超過4%時，紫薯多糖得率略下降，可能是由于酶分子過飽和，影響酶分子與底物結(jié)合。因此，通過復合酶添加量的單因素試驗結(jié)果可得，若想得到紫薯多糖最佳提取率，則復合酶添加量為4%。

圖2 復合酶添加量對紫薯多糖提取率的影響

2.1.3 不同酶解溫度對紫薯多糖提取率的影響

由圖3可知，35～45 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，多糖得率逐漸上升；45～60 ℃范圍內(nèi)，多糖得率出現(xiàn)大幅度下降；酶解溫度為45 ℃時，多糖得率最大，為2.752%。這也許是由于酶解溫度過低，使多糖不能有效溶出；隨著酶解溫度升高，反應速度加快，酶的活性增強，多糖溶出量增大，多糖得率升高；當酶解溫度高于一定范圍，部分酶發(fā)生變性而失去活力，同時部分多糖可能被降解為單糖，使多糖得率隨之降低。因此通過單因素試驗可得，最佳酶解溫度為45 ℃。

圖3 酶解溫度對紫薯多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction yield of polysaccharides from purple sweet potato

2.1.4 不同酶解時間對紫薯多糖提取率的影響

由圖4可知，當酶解時間在0.5～1 h之間時，多糖提取率隨之增加而增加，超過1.5 h時，提取率逐漸下降，即在1.5 h處達到最大值。導致該現(xiàn)象的原因可能是酶解時間繼續(xù)延長，多糖和復合酶可能在熱作用下發(fā)生分解，多糖得率降低。這可能是由于隨著時間的延長，有越來越多的細胞被破壞，多糖溶出；超過1.5 h后，已經(jīng)被釋放出的多糖可能有部分被水解，從而導致多糖得率下降。因此，通過酶解時間單因素試驗可知，將酶解時間設(shè)置為1.5 h時紫薯多糖的提取效果最佳。

圖4 酶解時間對紫薯多糖提取率的影響

2.1.5 不同酶解pH對紫薯多糖提取率的影響

由圖5可知，隨著酶解pH值的升高，多糖的提取率也明顯增加；當pH值為加入復合酶后的原液pH(5.71±0.2)時，多糖得率最大，為2.721%；之后隨著pH值的進一步增加，紫薯多糖得率下降。pH值是影響酶活性的一個重要因素，pH值升高影響酶與底物的親和力，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，活性遭到破壞，使得多糖提取率降低。因此，最佳酶解pH值為原液pH(5.71±0.2)。

圖5 酶解pH對紫薯多糖提取率的影響

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計及篩選關(guān)鍵因素結(jié)果

采用Minitab 17軟件對表2進行試驗設(shè)計及結(jié)果效應評價[25]，結(jié)果見表4和表5。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應值 Table 4 The design and response values of Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman試驗設(shè)計各因素效應評價Table 5 The effect evaluation of various factors of Plackett-Burman experimental design

由表5可知，影響多糖得率因素最強的是P1(液料比)，其余因素的強弱排序是P3(酶解時間)>P2(復合酶添加量)>P4(酶解溫度)>P5(酶解pH)。因此，選擇酶解時間、酶解溫度、復合酶添加量和液料比這4個因素進一步做響應面法優(yōu)化試驗設(shè)計和分析。根據(jù)單因素試驗，將酶解pH定在較好水平上，即酶解pH為復合酶添加后pH(5.71±0.2)進行后續(xù)試驗。

2.3 響應面優(yōu)化復合酶法提取紫薯多糖試驗結(jié)果

由Design-Expert軟件將上述4個因素分析后設(shè)計出29組試驗方案，根據(jù)軟件給出的試驗順序進行試驗，試驗方案及其結(jié)果見表6。

表6 紫薯多糖提取的響應面試驗方案及結(jié)果Table 6 Response surface design scheme and experimental results of polysaccharides from purple sweet potato

續(xù) 表

2.4 響應面法分析試驗數(shù)據(jù)

2.4.1 模型方程的建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0.2軟件，通過對表6中紫薯多糖提取試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得多糖得率對編碼自變量的回歸方程：

Y=2.63+0.16A+0.12B+0.040C-0.086D-0.053AB+0.018AC-0.12AD-2.500E-003BC+0.050BD+0.12CD-0.56A2-0.28B2-0.24C2-0.13D2。

(2)

對模型進行方差分析，見表7。

表7 擬合二次多項式模型的方差分析Table 7 Analysis of variance (ANOVA) for the fitted quadratic polynomial model

續(xù) 表

由表7方差分析結(jié)果可知，該試驗二次模型擬合性極顯著(P模型<0.0001<0.001)，表明模型極顯著；而粗多糖得率失擬項不顯著(P模型失擬項=0.7451>0.05)，表明無失擬因素存在，此結(jié)果說明數(shù)據(jù)與模型的擬合程度較高，試驗誤差小，所得二次回歸模型合適。對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗，分析表明一次項A、B、D差異極顯著(P<0.01)，即酶解溫度、酶解時間和液料比對紫薯多糖得率有顯著影響；交互項AD、CD差異顯著(P<0.05)，即液料比和酶解溫度的交互作用以及復合酶添加量和酶解溫度的交互作用對紫薯多糖得率有顯著影響；二次項A2、B2、C2、D2差異極顯著(P<0.01)，即酶解溫度的二次項、復合酶添加量的二次項、酶解時間的二次項和液料比的二次項對紫薯多糖得率有顯著影響。

2.4.2 復合酶法紫薯多糖提取的響應面分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.2軟件擬合所得方程做二維等高線圖和三維圖來直觀展示各因素的交互作用，并分析交互作用的影響程度。在二維等高線圖中，若最內(nèi)側(cè)等高線為圓形，表明圖中兩個因素的交互作用不明顯，最內(nèi)側(cè)等高線為橢圓形則表明相互影響較大[26]。得到響應面三維圖及其等高線，見圖6～圖11。

從響應面三維圖像中可直觀地看出各因素對響應值的影響，圖6～圖11的響應面圖和等高線圖以及表7的擬合二次多項式模型的方差分析表明，4個因素中對紫薯多糖提取率影響最大的是液料比，影響最小的是復合酶添加量。復合酶法提取紫薯多糖的最佳提取工藝響應值最大為2.743%，此時工藝參數(shù)為酶解時間95.00 min，酶解溫度43.75 ℃，復合酶添加量4.04%，液料比30.96∶1(mL/g)。

2.4.3 驗證試驗

為驗證模型的可預測性，同時綜合考慮最佳提取工藝參數(shù)下，即酶解溫度43.75 ℃，酶解時間95.00 min，復合酶添加量4.04%，液料比30.96∶1(mL/g)，在操作可行的基礎(chǔ)上，最終將復合酶法紫薯多糖最佳提取工藝條件修正為：酶解溫度44 ℃，酶解時間95 min，液料比31∶1(mL/g)，復合酶添加量4%，對模型所得到的最佳工藝條件進行檢驗和驗證。所得平均多糖得率為2.759%，與理論值2.743%相比，相對誤差為0.016%，說明回歸方程可以較真實地反映各因素對響應值的影響，證明運用響應面優(yōu)化復合酶法提取紫薯多糖工藝的回歸模型可以使用。

2.5 紫薯多糖抗氧化性試驗結(jié)果

2.5.1 紫薯多糖對·OH的清除能力

由圖12可知，紫薯多糖濃度越高，對·OH的清除能力越大。相同濃度抗壞血酸對羥自由基的清除率高于紫薯多糖，在0.5 mg/mL時清除率為80.1%，而紫薯多糖為59.5%。結(jié)果表明，紫薯多糖能高效去除羥自由基且濃度越高清除率越大，但效果低于同樣濃度下的抗壞血酸。

圖12 紫薯多糖對·OH的清除能力Fig.12 The scavenging ability of polysaccharides from purple sweet tomato on ·OH

2.5.2 紫薯多糖對DPPH·的清除能力

由圖13可知，在濃度為0.5 mg/mL時，抗壞血酸對1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)的清除率為95.4%。而紫薯多糖對1,1-二苯基-2-苦肼基的清除率隨濃度增大而逐步增強，在濃度為0.5 mg/mL時，紫薯多糖對DPPH·的清除率為61.8%。結(jié)果表明，紫薯多糖對1,1-二苯基-2-苦肼基具有一定的清除能力，但其清除效果較相同濃度下的抗壞血酸弱。

圖13 紫薯多糖對DPPH·的清除能力Fig.13 The scavenging ability of polysaccharides from purple sweet tomato on DPPH·

2.5.3 紫薯多糖對O2-·的清除能力

由圖14可知，在濃度為0.5 mg/mL時，抗壞血酸對超氧陰離子自由基(O2-·)清除率為95.3%。而紫薯多糖對超氧陰離子自由基的清除率隨濃度增大而逐步增強，在濃度為0.5 mg/mL時，紫薯多糖對O2-·的清除率達到最大，為46.3%。結(jié)果表明，紫薯多糖對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力，但其清除效果較相同濃度下的抗壞血酸弱。

圖14 紫薯多糖對O2-·的清除能力Fig.14 The scavenging ability of polysaccharides from purple sweet tomato on O2-·

3 結(jié)論

在復合酶配比預試驗與單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計進行關(guān)鍵因素篩選試驗，從而依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，運用響應曲面分析法展開四因素三水平試驗，得到紫薯多糖提取工藝的較優(yōu)提取參數(shù)為：液料比31∶1(mL/g)，酶解時間95 min，復合酶添加量4%，酶解溫度44 ℃。

經(jīng)體外抗氧化活性試驗，結(jié)果顯示：紫薯多糖能顯著清除·OH、DPPH·、O2-·，且與多糖濃度呈正相關(guān)，存在一定的抗氧化活性。本試驗對紫薯多糖復合酶法的最優(yōu)提取參數(shù)與抗氧化活性進行了初步探究，為紫薯多糖的深入研究奠定了基礎(chǔ)，并為多糖開發(fā)與利用提供了一定的參考意義。