細(xì)胞和病毒活疫苗中支原體污染的PCR檢測方法建立與應(yīng)用

耿仁浩，劉博，王芳，羅玉峰，曲鴻飛，范學(xué)政，秦玉明，丁家波，許冠龍，沈青春，秦愛建

細(xì)胞和病毒活疫苗中支原體污染的PCR檢測方法建立與應(yīng)用

耿仁浩1，2，劉博1，王芳1，羅玉峰1，曲鴻飛1，范學(xué)政1，秦玉明1，丁家波1，許冠龍1，沈青春1，秦愛建2

1中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009

【】在生物學(xué)研究及生物制品生產(chǎn)中易發(fā)生支原體污染，針對(duì)我國當(dāng)前支原體檢驗(yàn)方法在時(shí)效性和敏感性上的不足，建立一種簡便快速、特異敏感的支原體檢驗(yàn)PCR方法。從SILVA數(shù)據(jù)庫下載包含全部細(xì)菌、古菌和真菌的核糖體rRNA小亞基（16S/18S, SSU）參考序列的庫文件SILVA_123_SSURef，從中提取全部支原體序列，經(jīng)去重復(fù)后得到181條（種）支原體（包括139個(gè)已分類的單一種類和42個(gè)未分類的支原體）的16S rRNA序列，經(jīng)比對(duì)后選取高變區(qū)V6到V9為檢測目標(biāo)區(qū)段，設(shè)計(jì)篩選出表現(xiàn)最佳的檢測引物，建立檢測支原體的通用PCR方法。選取12種常見的支原體或2種甾原體作為待檢樣品對(duì)該P(yáng)CR方法進(jìn)行檢測范圍驗(yàn)證；取6種不同動(dòng)物來源的常用傳代細(xì)胞和3種常見細(xì)菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證；選取了5種最常見的支原體和1種甾原體進(jìn)行敏感性試驗(yàn)；并將其與經(jīng)典培養(yǎng)法一同對(duì)17批（種）動(dòng)物病毒活疫苗（分別用于6種動(dòng)物）和24份8種細(xì)胞培養(yǎng)物樣本進(jìn)行對(duì)比檢測以評(píng)價(jià)其實(shí)際應(yīng)用效果。建立了一種通用的支原體PCR檢測方法，檢測引物由2條上游引物（5′-GCAAARCTATRGARAYATAGYVGAG-3′和5′-GCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAG-3′）和1條下游引物（5′- CCARCTCYCATRGTKTGACGG-3′）組成，引物配比為3﹕1﹕4，最佳退火溫度為56℃。采用該P(yáng)CR方法對(duì)14個(gè)較常見的支原體種類進(jìn)行檢測，結(jié)果均能擴(kuò)增出396—413 bp大小的特異性條帶，表明該方法的檢測范圍符合檢測要求；對(duì)6種動(dòng)物傳代細(xì)胞和3種常見細(xì)菌進(jìn)行檢測，結(jié)果均未擴(kuò)增出特異性條帶，表明其特異性良好；靈敏度測定結(jié)果表明該P(yáng)CR方法的檢測下限可達(dá)20—200 CCU的活菌，對(duì)應(yīng)的核酸為1.5—15.0 pg；對(duì)共計(jì)17批病毒活疫苗和24份細(xì)胞樣品的檢測結(jié)果與培養(yǎng)法檢測結(jié)果基本一致，表明本研究建立的支原體PCR檢測方法與培養(yǎng)法有很好的一致性，而且敏感性更高。建立的支原體PCR檢測方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好、簡單快速，為細(xì)胞及病毒活疫苗中可能的支原體污染提供了一種準(zhǔn)確可靠的快速檢測方法。

細(xì)胞；病毒活疫苗；支原體；16S rRNA；PCR

0 引言

支原體污染是指由一類缺乏硬細(xì)胞壁、能通過除菌濾器的微生物污染細(xì)胞系、生物原材料及制品的現(xiàn)象，泛指柔膜體綱（Mollicutes）微生物污染，以支原體屬成員為主，其次是甾原體屬[1-3]。1956年人類首次在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)支原體污染問題[4]，其后在雞胚、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及以這些基質(zhì)生產(chǎn)的生物制品中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[5]。趙翔等[6]在2003—2017年間對(duì)不同生產(chǎn)或研發(fā)單位送檢的多種生物樣本進(jìn)行了支原體檢查，幾乎每年都會(huì)發(fā)現(xiàn)支原體污染樣本?！狙芯恳饬x】大多數(shù)支原體種類對(duì)人或動(dòng)物有一定的致病性，因此病毒活疫苗或生物活性制品中污染支原體還會(huì)產(chǎn)生一定生物安全風(fēng)險(xiǎn)[7]。支原體是各種醫(yī)用或獸用活疫苗、生物活性制劑及細(xì)胞的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的重要檢驗(yàn)項(xiàng)目，在《中國藥典》（2020版）和《中國獸藥典》（2015版）中均有詳細(xì)規(guī)定[8-9]，兩部藥典均采用了支原體培養(yǎng)法，但該方法有諸多弊端，如檢測周期長達(dá)30日、敏感性差、受培養(yǎng)基質(zhì)量和培養(yǎng)條件等影響較大等。因此，生物制品行業(yè)急需一種簡便快速、準(zhǔn)確適用的支原體檢測方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】支原體的檢測方法主要包括常規(guī)分離培養(yǎng)法、DNA染色法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、PCR技術(shù)。其中DNA染色法被《中國藥典》列為第二種可選方法，檢驗(yàn)周期縮短為4—15 d。該方法原理是對(duì)吸附在細(xì)胞表面的支原體進(jìn)行核酸染色，特異性較差，通常作為輔助方法使用[5,10-11]，LIGASOVá等[12]建立了一種使用熒光顯微鏡檢測支原體的方法，相比于傳統(tǒng)的DNA染色法提高了敏感性，但特異性上沒有明顯改善；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)采用抗體夾心法檢測支原體污染，特異性和靈敏性良好，但可被檢測的支原體種類范圍較窄[13-15]；核酸雜交技術(shù)主要見于一些較早期的文獻(xiàn)報(bào)道[16-18]。PCR檢測方法因其快速、準(zhǔn)確、敏感和特異性好的特點(diǎn)[19-22]，成為當(dāng)前應(yīng)用最多的支原體快速檢測方法，部分機(jī)構(gòu)也開發(fā)出了一些商品化檢測試劑，能很好地檢測到部分支原體種類[23-26]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究針對(duì)上述問題，擬以更科學(xué)的引物設(shè)計(jì)方法為突破點(diǎn)，研究一種可檢測當(dāng)前所有支原體的通用PCR檢測方法。16S rRNA是細(xì)菌特有的分子標(biāo)記，不存在于真核生物細(xì)胞中，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分類和鑒定[27-29]。其全長約1 500 bp，含有9個(gè)明顯的高變區(qū)（V1—V9區(qū)），這些高變區(qū)具有較強(qiáng)的種屬特異性，并作為物種分類依據(jù)應(yīng)用于微生物群落的擴(kuò)增子分析[30-31]。本研究從SILVA數(shù)據(jù)庫中下載了含有716.8萬條16S rRNA序列的SILVA_123_SSURef庫文件，使用Python程序從中提取和去重復(fù)后獲得全部種類的支原體16S rRNA序列。通過序列比對(duì)后設(shè)計(jì)篩選支原體通用引物，優(yōu)化反應(yīng)條件后建立檢測支原體污染的PCR方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確、適用的支原體PCR檢測方法，以部分替代或作為當(dāng)前生物制品和細(xì)胞中支原體檢驗(yàn)方法的補(bǔ)充，解決當(dāng)前支原體檢驗(yàn)的時(shí)效性、準(zhǔn)確性和敏感性方面的問題。

1 材料與方法

1.1 菌株和細(xì)胞

支原體菌種：綿羊肺炎支原體（CVCC380）、衣阿華支原體（CVCC364）、精氨酸支原體（CVCC346）、口腔支原體（CVCC379）、萊氏無膽甾原體（CVCC2406）、惰性支原體（CVCC363），雞毒支原體（CVCC353）、雞滑液支原體（CVCC385）、豬鼻支原體（CVCC361）、豬肺炎支原體（CVCC4049）、牛支原體XBY01株、人型支原體HB1株、無黃無膽甾原體338株、鴨支原體BSJ52株。細(xì)菌：沙門氏菌（CVCC2139）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（CVCC1125）、大腸桿菌DH5α。健康細(xì)胞：非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞（Marc145）（CVCCCL32）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）（CVCC CL28）、雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、昆蟲細(xì)胞（Sf9）、豬睪丸細(xì)胞（ST）、昆蟲細(xì)胞（HighFive）、牛腎細(xì)胞（MDBK）、鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）。待檢樣品：人乳腺癌細(xì)胞（BT）、豬腎細(xì)胞（PK15）、小型豬腎細(xì)胞（MPK）、猴胚胎腎細(xì)胞（MA104）、鼠雜交瘤細(xì)胞CA3T3株、倉鼠腎成纖維細(xì)胞（BHK21）、ST、MDBK等細(xì)胞和14個(gè)品種活疫苗樣本（包括雞、鴨、鵝、豬、犬和草魚用活疫苗）。

以上材料中，除大腸桿菌DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司，待檢細(xì)胞來自國內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室外，其余所有材料來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑

Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye）、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；PPOL肉湯、水解乳蛋白、瓊脂糖購自BD公司；支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

本研究實(shí)施時(shí)間為2019年3月至2020年8月，地點(diǎn)位于北京市大興區(qū)慶豐路33號(hào)中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所。

1.4 引物設(shè)計(jì)

通過從Silva數(shù)據(jù)庫（https://www.arb-silva.de/）下載SILVA_123_SSURef的16S rRNA數(shù)據(jù)庫，共716.8萬條16S rRNA序列，使用Python程序從中提取和去重復(fù)獲得支原體16S rRNA序列共計(jì)181條，包括139個(gè)種類的支原體和42個(gè)未分類的支原體16S rRNA序列。甾原體的16S rRNA序列在NCBI上僅有萊氏無膽甾原體PG-8A一株的序列。加入一條大腸桿菌16S rRNA序列（作為參比序列），使用Lasergene 7.0中MegAlign軟件進(jìn)行序列比對(duì)。選取高變區(qū)V6到V9為檢測目標(biāo)區(qū)段，設(shè)計(jì)并篩選得到最佳的檢測引物，包括2條上游引物MF20.1和MF20.2、1條下游引物MR21，其中MF20.1/MR21用于檢測支原體類，MF20.2/MR21檢測甾原體類，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為396—413bp，引物序列和結(jié)合區(qū)域如圖1所示。

圖1 支原體和甾原體的16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果及特異引物結(jié)合區(qū)域

1.5 樣品核酸提取

取1 mL支原體、細(xì)菌、待檢細(xì)胞和疫苗樣本，參照天根生化DNA提取試劑盒說明說書進(jìn)行核酸提取，核酸終體積為100 μL。

1.6 引物的驗(yàn)證

對(duì)豬鼻支原體（CVCC361）、雞毒支原體（CVCC353）、口腔支原體（CVCC379）、萊氏無膽甾原體（CVCC2406）等14種支原體或甾原體和健康細(xì)胞Marc145以及大腸桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系為20 μL，包括2×Taq PCR Mix 10 μL、上下游引物（MF20.1/MF20.2/MR21，濃度比3﹕1﹕4，總濃度20 μmol·L-1）2 μL、dd H2O 6 μL以及2 μL模板DNA。反應(yīng)條件為：95℃/2 min后，95℃/30 s、55℃/30 s、72℃/40 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

1.7 退火溫度的優(yōu)化

以雞毒支原體、雞滑液支原體、豬鼻支原體、大腸桿菌、Marc145細(xì)胞的核酸為模板，使用引物MF20.1/ MF20.2/MR21分別用不同的退火溫度進(jìn)行PCR試驗(yàn)。反應(yīng)體系同1.6，反應(yīng)條件為：95℃/2 min后，95℃/30 s、53—58℃/30 s、72℃/40 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸3 min，以確定最適退火溫度。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

1.8 特異性試驗(yàn)

以MDBK、CEF、Sf9、Marc145、ST、SP2/0等6種常用的動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌、沙門氏菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌等3種常見細(xì)菌培養(yǎng)物，按1.5的方法提取核酸，使用1.6的反應(yīng)體系及優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

1.9 敏感性試驗(yàn)

對(duì)雞毒支原體、豬鼻支原體、衣阿華支原體、精氨酸支原體、口腔支原體、萊氏無膽甾原體等6種支原體培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果均為108CCU/ml。各取1ml培養(yǎng)物按照1.5的方法進(jìn)行DNA提取，再用TE溶液對(duì)DNA進(jìn)行10倍比稀釋至10-6后，使用1.6的反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

1.10 支原體PCR檢測方法的應(yīng)用和比較

對(duì)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存的8種健康細(xì)胞（Vero、CEF、Sf9、Mac145、ST、HighFive、鼠源雜交瘤細(xì)胞、LMH）和16株其他實(shí)驗(yàn)室送檢的BT、PK15、MPK、ST、CA3T3、BHK21、MA104、MDBK細(xì)胞以及17批動(dòng)物疫苗樣品，使用以上支原體PCR檢測方法進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí)對(duì)以上樣品按照《中國獸藥典》2015版使用培養(yǎng)法進(jìn)行支原體檢測，比較兩種方法的符合度。將PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果上傳至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 引物驗(yàn)證

雞毒支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾原體、口腔支原體等14種支原體核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，14種支原體均有良好的特異性擴(kuò)增條帶，而大腸桿菌和Marc145細(xì)胞的擴(kuò)增產(chǎn)物均為陰性，表明引物MF20.1/MF20.2/ MR21可作為支原體PCR檢測引物。

2.2 退火溫度優(yōu)化

退火溫度為53—56℃時(shí)，對(duì)雞毒支原體、雞滑液支原體、豬鼻支原體3種支原體核酸均有良好的特異性擴(kuò)增，57—58℃時(shí)，擴(kuò)展產(chǎn)物條帶亮度明顯下降，大腸桿菌和Marc145細(xì)胞的核酸均無明顯的擴(kuò)增條帶，如圖3，因此確定56℃作為支原體PCR檢測體系的退火溫度。

a-f：分別為退火溫度53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃的PCR檢測結(jié)果。M：DL2000 Marker；1：雞毒支原體；2：雞滑液支原體；3：豬鼻支原體；4：大腸桿菌；5：非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞

2.3 特異性試驗(yàn)

6種不同動(dòng)物來源的常用細(xì)胞和3種常見細(xì)菌的核酸，經(jīng)支原體PCR檢測方法擴(kuò)增，結(jié)果均無特異性條帶，如圖4，表明該P(yáng)CR檢測方法特異性良好。

試驗(yàn)的PCR陽性對(duì)照選用的是口腔支原體（CVCC379），對(duì)其PCR產(chǎn)物鏈接T載體后進(jìn)行了序列分析，結(jié)果如圖5。將其上傳NCBI網(wǎng)站進(jìn)行blast比對(duì)，其與口腔支原體NCTC10112株相匹配部分（33—397 bp）同源性為99.45%。

2.4 敏感性試驗(yàn)

雞毒支原體、豬鼻支原體、衣阿華支原體、精氨酸支原體、口腔支原體、萊氏無膽甾原體6種支原體提取核酸后，測定其濃度分別為75.9、83.2、77.3、68.9、82.5和63.3 μg·mL-1。1%凝膠電泳顯示，將6種支原體核酸稀釋到10-4—10-5均能擴(kuò)增出396—413 bp大小特異性條帶（圖6）。由此可見，使用引物MF20.1/MF20.2/MR21在上述反應(yīng)條件下，對(duì)支原體的檢測敏感性良好。以上支原體的培養(yǎng)物活菌數(shù)均為108CCU·mL-1，則該P(yáng)CR方法的檢測下限可達(dá)到20—200 CCU，對(duì)應(yīng)支原體核酸檢測下限估值為1.5— 15.0 pg，考慮基因組大小的因素，敏感性與一些多重PCR方法相當(dāng)[32-33]。

1：DL2000 Marker；2：陽性對(duì)照；3：陰性對(duì)照；4：MDBK細(xì)胞；5：CEF細(xì)胞；6： Sf9細(xì)胞；7：Marc145細(xì)胞；8：ST細(xì)胞；9：SP2/0細(xì)胞；10：大腸桿菌DH5α；11：沙門氏菌（CVCC2139）；12：產(chǎn)氣莢膜梭菌（CVCC1125）

圖5 陽性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物測序

1、8、15：DL2000Marker；圖a，2—7：雞毒支原體10-1— -6倍稀釋；9—14：豬鼻支原體10-1— -6倍稀釋；16—21：衣阿華支原體10-1— -6倍稀釋。圖b：2—7：精氨酸支原體10-1— -6倍稀釋；9—14：口腔支原體10-1— -6倍稀釋；16—21：萊氏無膽甾原體10-1— -6倍稀釋

2.5 PCR檢測方法應(yīng)用和比較

8種健康細(xì)胞均為支原體檢驗(yàn)陰性；其他實(shí)驗(yàn)室送檢的8種16株細(xì)胞中小鼠雜交瘤細(xì)胞CA3T3株、ST（F20）、MA104（F08）、MA104（F25）、MA104（F25 2008）、MA104（F29）共6株能擴(kuò)增出396—413 bp大小特異性條帶。培養(yǎng)法只檢測出ST（F20）、MA104（F08）、MA104（F25 2008）、MA104（F29）等4株陽性，其余為陰性，結(jié)果詳見表1。

對(duì)MA104（F25）和MA104（F08）細(xì)胞10 mL經(jīng)10 000×離心20 min，取沉淀再次用《中國獸藥典》2015版培養(yǎng)法檢測，結(jié)果為陽性，表明該P(yáng)CR檢測方法的靈敏度高于培養(yǎng)法。取以上6株檢測結(jié)果為陽性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送公司測序，NCBI上序列比對(duì)結(jié)果顯示6種陽性產(chǎn)物均來自人口腔支原體，推測污染原因?yàn)榈痛畏N細(xì)胞猴胚胎腎細(xì)胞MA104（F08）存在口腔支原體污染，導(dǎo)致高代次MA104細(xì)胞和同時(shí)操作的ST及雜交瘤細(xì)胞污染。

對(duì)10家國內(nèi)獸藥疫苗企業(yè)共計(jì)17批活疫苗樣本（包括雞、鴨、鵝、豬、犬和草魚用活疫苗）同時(shí)采用培養(yǎng)法和PCR方法進(jìn)行支原體檢驗(yàn)，培養(yǎng)法結(jié)果均為陰性，PCR方法出現(xiàn)1批陽性結(jié)果，測序比對(duì)結(jié)果為雞滑液支原體。17個(gè)疫苗品種的生產(chǎn)原材料包括了雞胚、鴨胚和Vero、PK-15、ST、Marc145、MDCK及草魚胚胎等細(xì)胞系，涵蓋了常見生物制品的活性原材料，表明該P(yáng)CR方法具有較廣的適用范圍。

表1 采用支原體檢驗(yàn)PCR方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)檢測獸用活疫苗的檢測

a括號(hào)中表示經(jīng)過離心濃縮后，再次用培養(yǎng)法檢驗(yàn)的結(jié)果

aIt indicates that the data is got from a repeat test by cultivation method after centrifuge concentration of the samples

3 討論

支原體污染是當(dāng)前困擾生物相關(guān)的科研單位和企業(yè)的一個(gè)比較常見的問題，污染主要來源包括細(xì)胞和毒種，以及血清、雞胚、原代細(xì)胞等動(dòng)物性原材料和操作者本身。支原體污染可引起細(xì)胞生長抑制、DNA片段化及碳水化合物、核酸和蛋白質(zhì)的合成受阻[34]，進(jìn)而影響生物制品的質(zhì)量，受支原體污染的細(xì)胞極難再凈化，最經(jīng)濟(jì)的辦法是無害化處理[35-36]。部分支原體種類對(duì)人和動(dòng)物有致病性，存在一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，因此，支原體檢驗(yàn)也是生物制品行業(yè)規(guī)定的必檢項(xiàng)目。

《中國藥典》2020版和《中國獸藥典》2015版的支原體檢查法均采用了培養(yǎng)法[8-9]，能很好地檢測生物制品或細(xì)胞中的支原體活菌，仍是當(dāng)前公認(rèn)的支原體檢驗(yàn)金標(biāo)準(zhǔn)[1, 20]，但檢測時(shí)效性差；《中國藥典》的通則3301中支原體檢驗(yàn)還規(guī)定了第二法——指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）作為培養(yǎng)法的補(bǔ)充，檢驗(yàn)周期為4—15日，原理是將供試品接種于指示細(xì)胞中培養(yǎng)富集后用特異熒光染料染色，如供試品污染支原體，在熒光顯微鏡下可見附在細(xì)胞表面的支原體DNA著色。但有些支原體種類并不適應(yīng)指示細(xì)胞培養(yǎng)物中生長，從而容易造成假陰性，死亡細(xì)胞釋放出的核酸干擾結(jié)果觀察而容易造成假陽性。藥典方法的陽性對(duì)照均采用支原體活菌，容易成為污染源，因而不適于在細(xì)胞和病毒研究相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

相比藥典規(guī)定的培養(yǎng)法和DNA染色法，支原體PCR方法無需使用支原體活菌樣品作為陽性對(duì)照，從而杜絕了對(duì)照樣品污染實(shí)驗(yàn)室的風(fēng)險(xiǎn)。PCR方法在檢測到陽性樣品后，可通過測序分析，進(jìn)一步確認(rèn)其是否為支原體核酸及污染支原體的種類，從而方便了支原體污染問題的快速溯源和解決，這是其他檢測方法無法實(shí)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)。PCR方法于1993年首次應(yīng)用于細(xì)胞的支原體污染檢測[3, 37]，隨后國內(nèi)外學(xué)者對(duì)該類方法開展了各種研究試驗(yàn)并取得了良好的檢測效果。

目前所發(fā)現(xiàn)的污染性“支原體”種類，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要包括6種支原體（分別為精氨酸支原體、人型支原體、豬鼻支原體、人口腔支原體、牛支原體和發(fā)酵支原體）和1種甾原體（萊氏無膽甾原體）[1]，考慮到獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用，筆者在此基礎(chǔ)上增加了7種，包括雞毒支原體、豬肺炎支原體、綿羊肺炎支原體、衣阿華支原體、雞滑液支原體、無黃無膽甾原和鴨支原體，共14個(gè)種類。本研究的是在保證良好的特異性同時(shí)，最大范圍檢測各種支原體，在通用檢測引物設(shè)計(jì)篩選中引入較多的兼并堿基，并增加一條上游引物，擴(kuò)增范圍包括了現(xiàn)有全部支原體種類和甾原體，其中萊氏無膽甾原體和無黃無膽甾原體也被認(rèn)為是生物制品支原體污染的重要種類[38]。當(dāng)前建立的PCR方法從敏感性、特異性以及比對(duì)檢測結(jié)果看，均達(dá)到較為滿意的效果，但由于當(dāng)前能獲得的支原體和甾原體菌株仍不能覆蓋所有種類，其他稀有種類支原體是否也能得到良好的擴(kuò)增仍需試驗(yàn)驗(yàn)證。

關(guān)于生物制品中是否可以存在“死亡”支原體仍還有爭議，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測結(jié)果為陰性，而分子生物學(xué)或免疫學(xué)方法檢測結(jié)果為陽性的樣品，有可能是存在死亡的支原體，也有可能是培養(yǎng)法不能培養(yǎng)出該種類支原體。《中國藥典》支原體檢驗(yàn)第二法——指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法），采用先富集培養(yǎng)后染色，從而可以確保檢測到的為活支原體，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用先培養(yǎng)富集后用PCR方法檢測支原體活菌的方法[20, 23]。本研究建立的PCR方法未對(duì)樣品中是否存在“死亡”支原體進(jìn)行考慮，從嚴(yán)格的質(zhì)量控制而言，有活性的生物制品或原材料就不應(yīng)該檢測出支原體成分。

自上世紀(jì)八十年代，我國對(duì)醫(yī)用和獸用生物制品企業(yè)制訂并執(zhí)行了越來越嚴(yán)格的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（Good Manufacture Practice, GMP）管理制度和相關(guān)法規(guī)，國內(nèi)生物制品企業(yè)生產(chǎn)管理水平和生產(chǎn)條件不斷提升，終產(chǎn)品中檢出支原體污染的報(bào)道越來越少見[39]。從本研究的PCR檢測方法應(yīng)用和比較結(jié)果來看，獸用疫苗產(chǎn)品中出現(xiàn)1批PCR結(jié)果陽性而培養(yǎng)結(jié)果陰性，當(dāng)前只能以培養(yǎng)法結(jié)果為準(zhǔn)。在研究領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)室支原體污染問題不容樂觀，本研究的應(yīng)用部分的實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞樣品均來自國內(nèi)具有一定技術(shù)水平的實(shí)驗(yàn)室，16株送檢的待檢細(xì)胞（8種）中6株結(jié)果陽性，支原體污染比例高達(dá)37.5%，盡管該結(jié)果只能代表少數(shù)實(shí)驗(yàn)室的情況，但也說明我國部分實(shí)驗(yàn)室控制支原體污染方面仍存在問題。實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（Good Laboratory Practice，GLP），在我國又叫藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范，已在醫(yī)藥研究開發(fā)相關(guān)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)室推行多年[40]，隨著GLP未來在獸醫(yī)及生物學(xué)研究領(lǐng)域的全面推行實(shí)施和檢測技術(shù)的不斷完善，支原體污染問題必將得到全面控制和有效解決。

4 結(jié)論

本研究建立的支原體PCR檢測方法具有安全、快速、敏感高、特異強(qiáng)的特點(diǎn)，為生物學(xué)研究和生物制品生產(chǎn)等工作中免受支原體的干擾提供一種可靠的快速檢測手段。

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Establishment and Application of PCR Assay for Mycoplasma Contamination in Cell Culture and Live Virus Vaccine

1China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081;2College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu

【】Mycoplasma contamination is prone to occur in biological research and productions. Aimed at the shortage of time-effectiveness and sensitivity of current Pharmacopoeia detection methods, a simple, rapid, specific and sensitive PCR method for mycoplasma was established.【】All the sequences of mycoplasmas were extracted from the datasets file SILVA_123_ SSUReffrom SILVA database, which contained aligned small (16S/18S, SSU) ribosomal RNA (rRNA) sequences for all three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya). 181 16S rRNA unique sequences of Mycoplasma (including 139 classified species and 42 unclassified Mycoplasma) were obtained by deduplication of the sequences. After alignment, the hypervariable regions V6 to V9 were selected as the detection target regions, and the detection primers were designed to establish a universal PCR method for mycoplasma detection. 12 kinds of mycoplasmas or 2 kinds of acholeplasmas were selected to verify the detection range of the PCR method; 6 kinds of passage cells from different animal and 3 kinds of common bacteria were selected for specific verification; 5 kinds of mycoplasmas and a kind of acholeplasma were selected for sensitivity test. In order to evaluate the performance of the assay in clinical application, 17 batches of animal live virus vaccines ( for 6 kinds of animals) and 24 samples of 8 kinds of cell cultures were subjected to test, which were compared with the classical culture method for mycoplasmas.【】A general PCR method for mycoplasma was established. The detection primers were composed of 2 upstream primers (5'-GCAAARCTATRGARAYA TAGYVGAG-3' and 5'- GCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAG-3') and a downstream primer (5'- CCARCTCYCATRGTKTGA CGG - 3'), and the mixing ratio of the primers was 3:1:4. The optimal annealing temperature was 56℃. The PCR method was used to detect 14 mycoplasma species, and the results showed that 396 bp-413 bp specific bands had been amplified, which indicated that the detection range of the PCR method satisfied the detection requirements; No specific bands were amplified from 6 kinds of animal cells and 3 kinds of common bacteria with the PCR assay. The results of sensitivity test showed that the detection limit of the PCR method was 20-200 CCU, and the corresponding nucleic acid was 1.5-15.0 pg. The detection results of 17 batches of live virus vaccines and 24 cell samples were almost consistent with those of culture method, which indicated that the PCR method established in this study was consistent with culture method well, and was more sensitive.【】The PCR assay established in this study was specific, sensitive, easy and fast, suitable for rapid detection of mycoplasma contamination in cells and live virus vaccine.

cell; live virus vaccine;; 16S rRNA; PCR

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.07.016

2021-02-08；

2021-06-21

國家“十三五”重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFF0208601）

耿仁浩，E-mail：18705279737@163.com。通信作者沈青春，E-mail：sqcwlx@sina.com。通信作者秦愛建，E-mail：aijian@yzu.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）