劉震坤，陳鮮鑫，任思宇，李世易

（1.四川省樂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 樂山 614000；2.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 萬州 404155）

糞腸球菌是革蘭氏陽性菌，能產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，抑制動物腸道內(nèi)有害微生物的生長繁殖，維持動物腸道微生態(tài)平衡?！讹暳咸砑觿┢贩N目錄（2013）》允許將糞腸球菌添加到動物飼料中。本研究旨在評價豬源糞腸球菌的耐酸能力、耐膽鹽能力和抗氧化能力等益生性能，為相關(guān)微生物飼料添加劑的開發(fā)提供菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料 糞腸球菌菌株SX106 由重慶三峽職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；MRS培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；豬膽鹽購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定 取1 mL 糞腸球菌SX106菌懸液接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧條件下37 ℃振蕩培養(yǎng)，分別于第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、24 h 取適量培養(yǎng)液在600 nm波長下測定OD 值，同時測定培養(yǎng)液的pH值和乳酸含量。以時間為橫坐標(biāo)，以培養(yǎng)液OD值、pH值和乳酸含量為縱坐標(biāo)，分別繪制曲線。

1.2.2 耐酸能力的測定 取1 mL SX106 菌懸液分別接種于pH 值為2.0、3.0、4.0、5.0 的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧條件下37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并計(jì)算存活率。

1.2.3 耐膽鹽能力的測定 取1 mL SX106 菌懸液分別接種于0.1%、0.2%、0.3% 100 mL 豬膽鹽溶液中，厭氧條件下37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h 后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并計(jì)算存活率。

1.2.4 耐藥性的測定 移取100 μL SX106 菌懸液滴至MRS固體培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻后放置藥敏紙片，厭氧條件下37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈是否形成，并精確測量抑菌圈直徑。

1.2.5 DPPH 自由基清除能力的測定 將SX106菌懸液以10 000 r/min 離心2 min，取400 μL 上清液與600 μL 0.2 mmol/L DPPH 溶液（用無水乙醇配制）混合均勻后，室溫下避光反應(yīng)30 min，然后以10 000 r/min離心2 min，取上清液測定OD517nm值（A1）。取400 μL與600 μL 80%甲醇溶液作為對照，按照同樣步驟測定OD517nm值（A2）；取400 μL 80%甲醇溶液與600 μL DPPH 無水乙醇溶液均勻混合后作為空白對照，測定OD517nm值（A0）。

DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線 菌株SX106 在MRS液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24 h后，其生長曲線和產(chǎn)酸曲線見圖1。由圖可見，培養(yǎng)2 h后菌體迅速增長，菌液濃度迅速升高，進(jìn)入對數(shù)生長期；8 h后菌體生長速度逐漸緩慢，12 h 開始進(jìn)入穩(wěn)定期。培養(yǎng)液pH值（初始6.1）在第2 h迅速下降，第12 h降至4.15，第16～24 h pH 值維持在4.05～4.07。乳酸產(chǎn)量隨著時間延長而，不斷增多，在第12 h 乳酸產(chǎn)量就達(dá)到45.56 mmol/L，至第24 h 最高達(dá)到53.21 mmol/L（圖2）。

圖1 糞腸球菌SX106的生長曲線和產(chǎn)酸曲線

圖2 糞腸球菌SX106的產(chǎn)乳酸曲線

2.2 耐酸能力 由圖3可見，在pH值分別為5.0、4.0、3.0、2.0 的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)3 h，菌株的存活率分別為98.9%、75.31%、55.25%、22.43%。表明隨著MRS液體培養(yǎng)基初始pH值的下降，糞腸球菌菌株SX106 的存活率逐漸下降，pH值低于2.0時，生長明顯受到抑制。

圖3 糞腸球菌SX106在不同pH值MRS培養(yǎng)基中的存活率

2.3 耐膽鹽能力 將菌株SX106 分別接種在含0.1%、0.2%、0.3%豬膽鹽的MRS 培養(yǎng)基中，結(jié)果可見：隨著膽鹽濃度升高，菌株存活率略有下降，但均能保持95%以上的存活率。表明菌株SX106能耐受高濃度膽鹽溶液，在其中可以保持良好的生長狀態(tài)（圖4）。

圖4 糞腸球菌SX106在不同膽鹽濃度的MRS培養(yǎng)基中的存活率

2.4 藥敏性 采用紙片擴(kuò)散法測定菌株SX106對16 種藥物的敏感性（表1），結(jié)果可見：該菌株對氟苯尼考和多西環(huán)素敏感；對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、氧氟沙星、阿莫西林和恩諾沙星中度敏感；對青霉素、鏈霉素、甲氧氨芐嘧啶、氨芐西林、阿奇霉素、卡那霉素和慶大霉素不敏感。

表1 糞腸球菌SX106藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

2.5 DPPH自由基清除能力 通過計(jì)算得出，菌株SX106對DPPH自由基的清除率為88.24%。

3 討論

3.1 生長特點(diǎn) 微生物生長曲線包括遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個時期。糞腸球菌SX106在MRS液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)2 h后即進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體生長迅速，菌液濃度迅速升高，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。糞腸球菌能夠利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸。在對數(shù)期，隨著時間延長，乳酸產(chǎn)量逐漸升高，pH值降低，進(jìn)入穩(wěn)定期后趨于平穩(wěn)。

3.2 耐酸能力 胃酸是成年動物胃液的主要成分之一，pH 值為0.5～1.5。動物攝取食物和飲水后，胃液被稀釋，pH 值升高；另外，一部分食物具有一定的系酸力，能夠中和一部分胃酸，因此胃內(nèi)容物pH 值通常保持在2.0～3.0。高濃度的胃酸具有抑制或殺死胃內(nèi)細(xì)菌的作用。因此，乳酸菌要到達(dá)大腸發(fā)揮作用，必須通過胃酸的腐蝕，具有較高的存活率。菌株SX106 在pH 值3.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，其存活率超過50%；pH值2.0時，存活率下降至22.43%。

3.3 耐膽鹽能力 膽鹽能改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，最終造成細(xì)菌死亡［1］。因此，能否耐受高濃度膽鹽也是衡量益生菌優(yōu)劣的重要指標(biāo)。小腸內(nèi)膽鹽的濃度通常在0.03%～0.3%［2-3］。本試驗(yàn)將菌株SX106 接種于含有0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，以此衡量該菌株的膽鹽耐受能力。結(jié)果顯示：該菌株在0.3%膽鹽中培養(yǎng)3 h仍能保持95%以上的存活率。

3.4 藥敏性 糞腸球菌作為革蘭氏陽性菌的耐藥指示菌，其耐藥機(jī)制復(fù)雜，存在對某些抗菌藥物的固有耐藥性及獲得性耐藥［4-6］。益生菌的耐藥性是評價其安全性的重要內(nèi)容。本試驗(yàn)研究了SX106對16種常見藥物的敏感性，結(jié)果表明其對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、氧氟沙星、阿莫西林和恩諾沙星中度敏感；對青霉素、鏈霉素、甲氧氨芐嘧啶、氨芐西林、阿奇霉素、卡那霉素和慶大霉素不敏感。這與一些研究報道不一致［7］，可能是因?yàn)椴煌瑏碓吹募S腸球菌在耐藥性方面存在差異。

3.5 抗氧化能力 研究表明，乳酸菌能夠清除動物腸道內(nèi)的活性氧分子，具有一定的抗氧化能力。評價其抗氧化能力的重要指標(biāo)之一是對DPPH自由基的清除率［9-11］。菌株SX106對DPPH自由基的清除率達(dá)到88.43%，表明該菌株具有較強(qiáng)的抗氧化能力，但與部分文獻(xiàn)報道［12］不同，原因可能是不同菌株間的差異造成的。

4 結(jié)論

本研究得出：糞腸球菌SX106 能夠在低pH環(huán)境下（3.0）有50%以上的存活率，在高濃度膽鹽環(huán)境中存活率達(dá)到95%以上；對氟苯尼和多西環(huán)素敏感；具有良好的DHHP 自由基清除能力。對該菌株的其他益生性能后續(xù)將作進(jìn)一步研究。