高效液相色譜法同時測定飲料中7種防腐劑和2種甜味劑

摘 要：目的：建立同時測定飲料中7種防腐劑2種甜味劑的高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）分析方法。方法：選用有代表性的果汁類飲料、碳酸飲料、含乳飲料共3種基質(zhì)，用甲醇水溶液（70%）提取后，定容過濾，蛋白含量較高的樣品中加入蛋白沉淀劑凈化后定容過濾待上機(jī)。選用Shimadzu VP-ODS（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）色譜柱，用20 mmol/L乙酸銨和甲醇為混合流動相;檢測波長為245 nm;進(jìn)樣量為20 μL;流速為1.5 mL/min，用優(yōu)化后的色譜梯度條件進(jìn)行洗脫。結(jié)果：7種防腐劑和2種甜味劑在0.5～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R>0.999 9），方法檢出限為0.3～2.0 mg/kg，樣品加標(biāo)實驗回收率在85.3%～98.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～4.5%。結(jié)論：優(yōu)化后的方法簡便、快速、準(zhǔn)確和可靠，達(dá)到方法學(xué)和食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)限量的要求，適用于飲料樣品中防腐劑和甜味劑的同時檢測。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;飲料;防腐劑;甜味劑

Rapid Detection Method of Multiple 7 Preservatives and 2 Sweeteners in Beverages by High Performance Liquid Chromatography

YANG Feifan

（Shanghai Chongming Institutes for Food and Drug Control （Chongming Food Safety Testing Center）， Shanghai 202150， China）

Abstract： Objective： A High performance liquid chromatography （HPLC） method was developed for rapid determination of 7 preservatives and 2 sweeteners in beverage. Method： Fruit juice， carbonated drink and milk beverage were chosen as experiment materials. The samples were extracted by 70% methanol solution with protein precipitator. Then the liquid was analyzed by HPLC. The analytes were separated on Shimadzu VP-ODS （150 mm×

4.6 mm， 4.6 μm） column using methanol and 20 mmol/L ammonium acetate as mobile phase for gradient elution at 245 nm wave length. And the injection volume was 20 μL. Result： The results showed that the 7 preservatives and 2 sweeteners had good linearity （R>0.999 9） between 0.5～50 μg/mL， the limits of detection range from

0.3 mg/kg to 2.0 mg/kg. The recoveries range from 85.3% to 98.5%. The relative standard deviations range from 2.2% to 4.5%. Conclusion： The optimized method is simple， rapid， accurate and reliable， which can meet the requirements of methodology and national food safety standards. It is suitable for the simultaneous determination of preservatives and sweeteners in beverage samples.

Keywords： high performance liquid chromatography; beverage; preservatives; sweeteners

食品添加劑是現(xiàn)代食品工業(yè)發(fā)展的產(chǎn)物，食品添加劑的使用對改善食品品質(zhì)、便于食品加工及延長食品貨架期具有重要作用。其中化學(xué)防腐劑由于能高效抑制食品中微生物活動、防止食品腐敗變質(zhì)且價廉、方便而應(yīng)用廣泛[1]。應(yīng)用范圍最廣的當(dāng)屬酸類防腐劑中的山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸及鹽類防腐劑中的山梨酸鉀、苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉和酯類防腐劑中的羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯[2]。甜味劑也是食品添加劑中的重要分支，合理應(yīng)用甜味劑能夠協(xié)調(diào)平衡食品風(fēng)味、掩蔽異味、增強(qiáng)口感，在飲料中應(yīng)用較為廣泛的有糖精鈉和安賽蜜。

這9種食品添加劑經(jīng)常同時應(yīng)用于各類飲料制品，而對以上7種防腐劑和2中甜味劑的檢測方法中，現(xiàn)行有效的就包括《飲料中乙?；前匪徕浀臏y定》（GB/T 5009.140—2003）[3]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）[4]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）[5]及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《出口乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯類防腐劑的測定 高效液相色譜法》（SN/T 4262—2015）[6]這4種方法，其中樣品凈化、目標(biāo)物提取、儀器測定條件和流動相設(shè)置等各有差異，同時測定以上項目需要人員多、時間長，工作效率低。因此近年來，檢測工作者對幾種食品添加劑的同時測定進(jìn)行了大量研究。目前，測定防腐劑和甜味劑的方法主要有液相色譜法[7]、液相質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、氣相色譜法[9]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10]等，但仍然存在同時測定項目少、儀器適用性窄、成本較高等問題。為有效整合資源、提高檢測速率，本文采用高效液相色譜探索一個可同時測定飲料中9種食品添加劑的檢測方法，以期實現(xiàn)對飲料類產(chǎn)品中食品添加劑的高通量測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A：果汁類、B：碳酸飲料、C：含乳飲料共3種（均為市售）。山梨酸、苯甲酸、糖精鈉混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：濃度1 000 μg/mL（北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司）;脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.5%（ChemService）;安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.40%;對羥基苯甲酸甲酯：純度99.73%;對羥基苯甲酸乙酯：純度99.02%;對羥基苯甲酸丙酯：純度98.70%;對羥基苯甲酸丁酯：純度99.90%（Dr.E）。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司;離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司;渦旋振蕩器，賽默飛世爾科技有限公司;超聲機(jī)，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;配有二級管陣列檢測器的高效液相色譜儀，島津儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑配制

亞鐵氰化鉀（92 g/L）：稱取10.6 g亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6·3H2O]，加入適量水溶解，用水定容至100 mL。

乙酸鋅溶液（183 g/L）：稱取22 g乙酸鋅[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加入3 mL冰乙酸，用水定容至100 mL。

乙酸銨溶液（20 mmol/L）：稱取1.54 g乙酸銨（CH3COONH4），加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

分別稱取安賽蜜、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用水定容至10 mL，配制成濃度為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;分別稱取4種對羥基苯甲酸酯類10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成濃度為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取安賽蜜、脫氫乙酸、山梨酸苯甲酸糖精鈉混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、4種對羥基苯甲酸酯類各1 mL，用水定容至10 mL，配得9種食品添加劑濃度均為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別移取5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL和500 μL，用水定容至1 mL，配制得標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3.3 樣品提取及凈化

（1）果汁飲料。準(zhǔn)確稱取樣品5 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入30 mL甲醇水溶液（70%），渦旋振蕩10 min，4 000 r/min離心5 min后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度?；靹蚝筮^0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

（2）碳酸飲料。將樣品超聲20 min除去氣泡，消除定容誤差和氣泡對高效液相色譜的影響。準(zhǔn)確稱取樣品5 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入30 mL甲醇水溶液（70%），渦旋振蕩10 min，4 000 r/min離心5 min后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。混勻后過0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

（3）含乳飲料。準(zhǔn)確稱取樣品5 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入30 mL甲醇水溶液（70%），渦旋振蕩10 min，加入蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）1 mL和乙酸鋅溶液（183 g/L）1 mL混勻，將樣品在4 000 r/min離心10 min，沉淀蛋白和可溶性糖類等雜質(zhì)。取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。于固體殘渣中加入水10 mL，渦旋振蕩5 min，于4 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至同一50 mL容量瓶，并用水定容至刻度，混勻后過0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

1.3.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Shimadzu VP-ODS柱（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）;二極管陣列檢測器檢測波長245 nm;進(jìn)樣量20 μL;流速1.5 mL/min。

流動相：A相為20 mmol/L乙酸銨溶液;B相甲醇（色譜純）。通過調(diào)整兩項洗脫條件，獲取良好的峰形和基線分離。梯度洗脫條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇/乙腈流動相體系常見于多種食品添加劑的分離。經(jīng)過本試驗比較，甲醇-乙酸銨溶液體系進(jìn)行分離時，各組分峰型對稱分布，且分離度高，實現(xiàn)了各目標(biāo)峰之間和雜質(zhì)的有效分離。同時出于檢測成本及試驗人員人身安全性及環(huán)境保護(hù)廢棄物處理等原因，選擇20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇體系。

2.2 目標(biāo)化合物檢測波長

利用二極管陣列檢測器（Photo-Diode Array，PDA）對濃度為1 μg/mL的9種目標(biāo)化合物在波長190～400 nm范圍內(nèi)掃描，各目標(biāo)化合物最大吸收波長如表2所示。通過分析比對，在245 nm數(shù)據(jù)采集時間段內(nèi)基線漂移程度較低，噪音小，且9種目標(biāo)化合物響應(yīng)較高，色譜圖見1。因此選取245 nm作為數(shù)據(jù)采集通道。適用于配備二級管陣列檢測器（Diode Array Detector/Photo-Diode Array，DAD/PDA）及可變波長紫外檢測器（Variable Wavelength Ultraviolet?Detector，VWD）的高效液相色譜儀對9種化合物同時分析，提高方法適用度。

2.3 方法精密度、線性關(guān)系、檢出限

取濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次。通過計算各目標(biāo)峰峰面積RSD評定方法精密度，各化合物精密度在0.35～0.70%，結(jié)果表明優(yōu)化后的方法穩(wěn)定，可有效實現(xiàn)分離。用優(yōu)化后的色譜條件對濃度為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL和50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以各目標(biāo)峰響應(yīng)與濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。9種目標(biāo)化合物在0.5～50 μg/mL線性良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999 9。

根據(jù)儀器噪音3倍確定飲料中9種目標(biāo)化合物的檢出限在0.3～2.0 mg/kg，詳見表3。

2.4 方法回收率與精密度

2.4.1 果汁飲料中7種防腐劑及2種甜味劑加標(biāo)回收

取20份果汁樣品，分別添加低水平（5 mg/kg）、中水平（10 mg/kg）、高水平（100 mg/kg）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份，依照優(yōu)化后的方法處理后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明果汁中9中目標(biāo)化合物的回收率在85.3%～97.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）在2.5%～4.2%?；厥章屎拖鄬?biāo)準(zhǔn)偏差均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[11]。優(yōu)化后的方法能夠準(zhǔn)確定量果汁樣品中9中添加劑的含量，詳見表4。

2.4.2 碳酸飲料中7種防腐劑及2種甜味劑加標(biāo)回收

取20份碳酸飲料樣品，分別添加低水平（5 mg/kg）、中水平（10 mg/kg）、高水平（100 mg/kg）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份，依照優(yōu)化后的方法處理后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明果汁中9中目標(biāo)化合物的回收率在88.6%～98.5%，RSD為2.7%～4.2%?；厥章屎拖鄬?biāo)準(zhǔn)偏差均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008），優(yōu)化后的方法能夠準(zhǔn)確定量碳酸飲料樣品中9中添加劑的含量，詳見表5。

2.4.3 含乳飲料中7種防腐劑及2種甜味劑加標(biāo)回收

取20份含乳飲料樣品，分別添加低水平（5 mg/kg）、中水平（10 mg/kg）、高水平（100 mg/kg）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份，依照優(yōu)化后的方法處理后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明果汁中9種目標(biāo)化合物的回收率在85.6%～98.0%，RSD為2.2%～4.5%?；厥章屎拖鄬?biāo)準(zhǔn)偏差均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008），優(yōu)化后的方法能夠準(zhǔn)確定量含乳飲料樣品中9種食品添加劑的含量，詳見表6。

3 結(jié)論

本試驗探討了高效液相色譜法同時測定飲料中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯共9種添加劑的方法。通過對前處理方式和液相色譜分析條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了7種防腐劑和2種甜味劑同時測定，提高了檢測效率，做到資源最大化利用。通過二極管陣列檢測器多通道采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行提取分析后，選擇245 nm作為唯一檢測波長，使該方法同時適用于只配備紫外檢測器的高效液相色譜儀，提高了方法的適用性。經(jīng)過方法學(xué)驗證，說明優(yōu)化后的方法能夠準(zhǔn)確實現(xiàn)飲料樣品中9中食品添加劑的定量分析，方法靈敏度好、準(zhǔn)確度高。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）以上9種食品添加劑在果汁類飲料、碳酸飲料、含乳飲料的最大用量為25～1 000 mg/kg的規(guī)定，且以上添加劑在飲料產(chǎn)品中的廣泛使用，因此該試驗方法在飲料產(chǎn)品檢驗檢測中推廣實用性更強(qiáng)。

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作者簡介：楊飛帆（1993—），男，上海人，本科，助理工程師。研究方向：食品、化妝品、飲用水等方面檢驗檢測。