李 瑩，舒鼎銘，何靜怡，羅威，王艷，陳鵬，蔡曼珊，劉天飛，計堅，羅成龍

（畜禽育種國家重點實驗室&廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室&廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室&廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，廣東廣州 510640）

廣東地處我國南部，擁有豐富的光、熱、水資源。受廣東特殊氣候及“無雞不成宴”等習俗的影響，形成了豐富的地方雞種資源，如清遠麻雞、惠陽胡須雞、陽山雞等。近年來，部分地方雞種資源得到了開發(fā)利用，但也存在種質(zhì)資源混雜的問題。

了解雞種遺傳資源狀況及其親緣關系是有效保護及利用的前提。線粒體DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）結構簡單、進化速率快、無組織特異性，其多態(tài)分析是研究種間或種內(nèi)遺傳多樣性和進化關系的有效途徑之一。目前，國內(nèi)外學者針對不同雞種mtDNA開展了大量研究，2020 年Ahmed 等利用mtDNA D-loop 區(qū)序列分析了706個來自中東、北非和非洲之角的本土家雞的遺傳多樣性。同年，Ayano 等利用mtDNA D-loop 序列和54個微衛(wèi)星DNA 標記對日本國家生物資源中登記的21個試驗雞品系的遺傳特性和多樣性進行了檢測。NCBI 收錄了黃郎雞、桃園雞、雪峰烏骨雞、大圍山微型雞、金湖烏骨雞、如皋雞、狼山雞、溧陽雞、太湖雞、略陽雞、絲羽烏骨雞、盧氏雞和儋州雞等中國地方雞種mtDNA全序列以及大量雞種mtDNA 部分序列，為遺傳多樣性、親緣關系研究積累了豐富資料。

本研究針對廣東3個地方雞種mtDNA D-loop全序列進行PCR 和測序，分析其遺傳多樣性，結合NCBI收錄的地方雞種、紅色原雞及綠頭鴨D-loop全序列信息，分析其親緣關系，為廣東地方雞種的保護和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 在各保種場核心群收集清遠麻雞（29只）、陽山雞（29 只）、惠陽胡須雞（40 只）共98 只母雞血樣。翅靜脈采血1.2 mL/只，加入EDTA 抗凝管后輕輕混勻并置于-20℃保存。從NCBI 下載我國地方雞及紅色原雞mtDNA D-loop 序列，并以綠頭鴨作為計算遺傳距離的參考外群（表1）。

表1 NCBI 中下載的mtDNA D-loop 序列

1.2 引物設計及DNA 提取 根據(jù)GenBank 中紅色原雞mtDNA 序列（GenBank 登錄號：NC_007235）設計引物，上游引物：5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'；下游引物：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'，產(chǎn)物約1 585/1 586 bp。按照全血基因組DNA 制備試劑盒（Magen 公司）提取DNA。

1.3 PCR 反應及測序 PCR 反應體系為50 μL：2×Taq PCR Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，Taq 酶0.5 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 20.5 μL。反應程序為95℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72℃后延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測，合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析 DNA 序列用DNAStar 5.0 拼接并人工校對，用Clustal X 1.8 進行多重比對剪輯，僅留取D-loop全長序列進行后續(xù)分析。用DnaSP 5.0 軟件統(tǒng)計單倍型數(shù)、多態(tài)位點數(shù)、單倍型多樣度（H）、核苷酸多樣度（P）和核苷酸平均差異數(shù)（K），并提取單倍型。以綠頭鴨為外群，利用MEGA 6.0 軟件的 Kimura 2-parameter（K2P）模型計算遺傳距離；并應用鄰接法（NJ）構建系統(tǒng)發(fā)生樹（采用Kimura 雙參數(shù)模型，Bootstrap 抽樣重復1 000 次）。

2 結果

2.1 mtDNA D-loop 區(qū)全長序列 利用PCR 擴增獲得廣東3個地方雞種mtDNA D-loop全序列，產(chǎn)物大小約1 600 bp（圖1）。PCR 產(chǎn)物測序后經(jīng)BLAST 比對，確認獲得了D-loop 序列，測序得到98個樣本的序列用于后續(xù)分析。

圖1 廣東3個地方雞種DNA D-loop全序列PCR 擴增結果

2.2 mtDNA D-loop 區(qū)堿基組成 本研究獲得了1 586/1 585 bp 目的序列，包括部分tRNA Pro、D-loop 和部分tRNA Phe序列，留取1 231/1 232 bp mtDNA D-loop全序列用于后續(xù)分析。3個地方雞種A、T、C 和G 堿基含量分別為26.5%～26.7%、33.5%～33.6%、26.4%～26.6%和13.3%～13.4%，各雞種對應堿基含量差異不大，平均G+C 含量為39.8%，明顯低于A+T 含量20.2%（表2）。

表2 mtDNA D-loop 序列堿基含量

2.3 mtDNA D-loop 序列多樣性 98個個體mtDNA D-loop 序列檢測到44個變異位點，其中單一多態(tài)位點6個、簡約信息位點38個，轉換率（81.82%）遠大于顛換率（22.22%）。98個個體具有34個單倍型（Hap 1～Hap 34），單倍型平均多樣度（H）為0.923±0.018，清遠麻雞單倍型數(shù)最多，惠陽胡須雞最少；核苷酸平均多樣度（P）為0.007 43，核苷酸平均差異數(shù)（K）為9.142。由表3 可知，各群體H為0.659～0.953，清遠麻雞>陽山雞>惠陽胡須雞；P為0.001 28～0.008 30，K 為1.578～10.219，陽山雞>清遠麻雞>惠陽胡須雞。

表3 mtDNA D-loop 基因序列堿基多態(tài)

2.4 mtDNA D-loop 的遺傳結構 3個地方雞種mtDNA D-loop 區(qū)的44個變異位點中定義了34 種單倍型（Hap 1～Hap 34）（表4），清遠麻雞有17個單倍型，各單倍型含有1～4個個體，其中Hap 1 和Hap 6 均含有4個個體；陽山雞有11個單倍型，各單倍型含有1～5個個體，其中Hap 7 和Hap 8 均含有5個個體；惠陽胡須雞有10個單倍型，其中Hap 26 含有23個個體，為優(yōu)勢單倍型，占該群體的57.5%。

表4 mtDNA D-loop 區(qū)的單倍型及其序列突變位點

根據(jù)Liu 等對家雞世系的劃分方法，廣東3個地方雞群體有6個世系類型（A、B、C、D、E 和H），C 世系為優(yōu)勢世系，包含的樣本數(shù)最多，占比46.94%（46/98），包括惠陽胡須雞（40個）、陽山雞（5個）和清遠麻雞（1個）；其次為B 世系，占24.49%（24/98），包括清遠麻雞（18個）和陽山雞（6個）。A 世系包含13個樣本，包括陽山雞（11個）和清遠麻雞（2個）；D、E 和H 世系包括樣本數(shù)均較少（3～7個）。陽山雞、清遠麻雞和惠陽胡須雞的優(yōu)勢世系分別為A、B 和C 世系（表5）。

表5 3個地方雞種群體的世系歸類

2.5 不同雞種之間的進化分歧 29個雞種分歧值分布在0.002～0.016 之間，其中63.68% 的雞種分歧值在0.002～0.01 之間，36.32%的雞種分歧值為在0.011～0.016之間，29個雞種與外群綠頭鴨的分歧值均大于0.660（表6）。與陽山雞、清遠麻雞、惠陽胡須雞遺傳距離較近（分歧值均為小于0.01）的雞種分別有21個、20個和12個；陽山雞與安義瓦灰雞、崇仁麻雞、絲羽烏骨雞分歧值最?。?.007）；清遠麻雞與安義瓦灰雞、崇仁麻雞、岑溪三黃雞的分歧值最?。?.004）；惠陽胡須雞與雪峰烏骨雞、綠耳烏雞和廣西麻雞的分歧值最?。?.002），廣東3個地方雞種與尼西雞、騰沖雪雞和藏雞的分歧值較大（0.011～0.013）。

表6 29個雞種及綠頭鴨的進化分歧估計值

分析98 條檢測序列與NCBI 下載的33 條D-loop序列，共同獲得51個單倍型（Hap 1～Hap 51）。Hap 24 為惠陽胡須雞的主要單倍型（占比57.5%）；清遠麻雞與陽山雞具有多個單倍型，各自主要單倍型分別為Hap 1、Hap 13、Hap 6 和Hap 4、Hap 7、Hap 8。網(wǎng)絡下載資源中有18個資源分別獨立形成單倍型（表7）。

表7 29個雞種及綠頭鴨單倍型及分布

利用Mega5.10 軟件，基于單倍型構建系統(tǒng)發(fā)生樹。由圖2 可知，Hap 42（綠頭鴨）獨為一類，29個地方雞種和紅原雞聚為一大類，符合外群獨立分支規(guī)律；紅原雞（Hap 39、Hap 40、Hap 51）、斗雞（吐魯番雞、大圍山微型雞）（Hap 34）、尼西雞（Hap 44）、仙居雞（Hap 50）等原雞或雜交選育程度不足的雞種聚為一個分支（A）；其他雞種可以歸為一個分支，該分支形成了3個小的分支（B、C 和D），包括了廣東3個地方雞種和19個其他地方雞種。與群體H結果一致，97.5%（39/40）的惠陽胡須雞聚集在C 分支；與雞種間進化分歧結果一致，惠陽胡須雞與雪峰烏骨雞（Hap 49）、綠耳烏雞（Hap 3）和廣西麻雞（Hap 3）聚在一起。陽山雞和清遠麻雞在B、C 和D 分支中均有一個數(shù)量的分布，其中B 分支包括了較多的陽山雞（17/29）和清遠麻雞（20/29）個體。

圖2 基于29個雞種及綠頭鴨mtDNA D-loop全序列構建的NJ 系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討 論

本研究獲得了廣東3個地方雞種共98個個體mtDNA D-loop全長序列，堿基組成相似，A、T、C和G 堿基平均含量分別為26.6%、33.6%、26.5% 和13.3%，平均A+T 含量為60.2%，明顯高于G+C 含量39.8%，表明該區(qū)域內(nèi)堿基組成具有偏倚性，這與家雞mtDNA D-loop 區(qū)為非編碼區(qū)、富集A/T 堿基的結論一致。mtDNA D-loop全長序列共檢測到1個插入/缺失和44個單核苷酸多態(tài)位點，其中轉換率為81.82%、顛換率為22.22%，符合脊椎動物堿基組成特征，這與

mtDNA 在進化中轉換發(fā)生率高于顛換的規(guī)律一致，與前人研究結果相似。

遺傳多樣性是物種進化和適應環(huán)境的基礎，也是遺傳資源選擇和選育的關鍵。mtDNAH和P是衡量群體多態(tài)和變異程度的重要指標，數(shù)值越高，群體多態(tài)性越高。遺傳多樣性高的群體可有效應對環(huán)境變化，具備進化潛力和適應能力。本研究檢測的98個個體定義了34個單倍型，樣本中H由高到低依次為清遠麻雞（0.953±0.020）、陽山雞（0.909±0.024）、惠陽胡須雞（0.659±0.081）；P平均為0.007 43，由高到低依次為陽山雞（0.008 30±0.000 59）、清遠麻雞（0.005 94±0.000 60）、惠陽胡須雞（0.001 28±0.000 74）。3個雞種中清遠麻雞具有最高的H和較高的P，高于多數(shù)已報道的國內(nèi)地方雞種，如黑狼山雞H=0.464、P=0.004 31，茶花雞H=0.476、P=0.003 01，貴妃雞H=0.538、P=0.005 90，鹿苑雞H=0.549、P=0.002 37，略陽雞H=0.549、P=0.002 37，儋州雞H=0.571、P=0.005 37，白狼山雞H=0.618、P=0.004 60，溧陽H=0.632、P=0.004 15，大圍山微型雞H=0.685、P=0.004 43，香爐山雞H=0.814、P=0.004 47和壽光雞H=0.864、P=0.005 30等；低于阿貝藏雞3個系（H為0.989～0.997，P為0.106～0.108）。陽山雞H和P處于較為豐富的狀態(tài)，而惠陽胡須雞遺傳多樣性相對較低，略高于狼山雞、茶花雞、貴妃雞、鹿苑雞、略陽雞、儋州雞和溧陽雞等。屠云潔等基于線粒體基因研究發(fā)現(xiàn)清遠麻雞H=0.583 3、P=0.003 69；黃勛和等也基于該基因發(fā)現(xiàn)清遠麻雞H=0.819、P=0.003 92，陽山雞H=0.842、P=0.004 31，惠陽胡須雞H=0.825、P=0.004 31。邢文麗等利用14個微衛(wèi)星標記分析清遠麻雞平均雜合度為0.501，本研究中清遠麻雞和陽山雞多樣性高于前人研究結果，而惠陽胡須雞多樣性低于前人研究結果。針對同一品種出現(xiàn)研究結果不一致的情況，主要影響因素包括檢測方法、樣本來源及檢測個體數(shù)量等。

此外，以往有關雞線粒體多態(tài)性的研究主要集中在D-loop 高變區(qū)，本團隊前期以D-loop 高變區(qū)研究了2個清遠麻雞群體（H為0.882～0.767，P為0.008 49～0.011 67）、陽山雞群體（H=0.753，P=0.009 29）的遺傳多樣性，本研究進一步證實線粒體D-loop 高變區(qū)研究信息不能完全覆蓋D-loop 區(qū)全部突變位點，建議采用D-loop全序列進行雞品種遺傳多樣性分析和系統(tǒng)進化研究，以整合更全面的信息、得到更準確的結果。

近年大量研究進一步證實了家雞的多母系起源，Liu 等根據(jù)所檢測的834 份家雞和66 份紅色原雞的mtDNA 控制區(qū)序列構建系統(tǒng)發(fā)生樹，將世界范圍的家雞和紅色原雞劃分為A～I 共11個世系，其中A 和B 世系主要分布在東亞和東南亞地區(qū)，C 世系為東亞特有世系，E 主要在中東、歐洲和印度，F(xiàn)、G 和H 世系為云南及鄰近地區(qū)（廣西、越南等）特有世系。本研究中清遠麻雞可分為A、B、C、D 和E 5個母系世系，其中B世系占優(yōu)勢（62.07%），E 為其特有世系（24.14%）；陽山雞具有A、B、C、D 和H 5個母系世系，其中A世系占優(yōu)勢（37.93%），H 為其特有世系（17.24%）；惠陽胡須雞僅有1個母系世系（C）。相對應的，綜合29個雞種mtDNA D-loop全序列構建的NJ 系統(tǒng)發(fā)生樹，清遠麻雞相對應的單倍型分布A、B、C 和D 分支，且B 分支為優(yōu)勢分支，占比達68.96%；陽山雞對應的單倍型分布在B、C 和D 分支；惠陽胡須雞全部分布于C分支；與單獨利用上述3個廣東地方雞種進行母系來源分析結果相一致。上述研究結果表明本研究檢測的清遠麻雞和陽山雞可能有4個母系來源，而惠陽胡須雞僅有1個母系來源。

由此可知，清遠麻雞和陽山雞表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，開發(fā)前景廣闊；惠陽胡須雞是廣東地方品種中開發(fā)利用程度較高的品種，本研究檢測群體多樣性相對較低可能與其固有或與經(jīng)過一定的保種世代有關，針對該群體建議定期從原產(chǎn)地引進原種或開展不同保種群的交流，以保持較高的遺傳多樣性。

4 結 論

本研究檢測的廣東3個地方雞種mtDNA D-loop 區(qū)全長1 231～1 232 bp，清遠麻雞和陽山雞具有豐富的多樣性，惠陽胡須雞多樣性中等，所有個體可歸類到A、B、C、D、E 和H 共6個世系，在進化過程中清遠麻雞和陽山雞存在4個母系來源，惠陽胡須雞僅1個母系來源，本研究結果為后續(xù)地方雞種的保護與開發(fā)利用提供了參考。