李心如,張福順,2,邳 植,3

(1.黑龍江大學現代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080； 2.農業(yè)農村部甜菜品質監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱 150080；3.黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150080)

0 引 言

甜菜(Beta vulgaris L.)具有耐寒、耐干旱、耐鹽堿等特點，具有抗逆性強、適應性廣的特性。甜菜是甘蔗以外的一個主要糖來源，屬于我國主要的糖料作物。除此之外，甜菜還可以生產出具有較高綜合利用價值副產物。通過對甜菜的特殊處理可以生產甲醇、乙醇、甘油等，也是制作金霉素等許多醫(yī)藥與輕工業(yè)產品的原料，也可以生產肥料、飼料等[1]。甜菜屬于兩年生作物，傳統(tǒng)的育種自交系的方法具有耗時長、成本高、易受環(huán)境氣候影響的弱點?？梢圆捎蒙锛夹g手段來培育自交系，如花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)、未授粉胚株培養(yǎng)、原生質體培養(yǎng)與融合、離體篩選和誘變育種。其中原生質體培養(yǎng)和細胞融合是細胞工程的重要內容。原生質體是除去細胞壁的植物細胞和細菌細胞，仍有正常細胞的全部功能。原生質體可以用來研究無性雜交、亞細胞定位、目的基因的瞬時表達、遺傳轉化和突變體的選擇。植物的原生質體可以為植物遺傳改良、研究生理過程現象提供理想材料。由于原生質體沒有細胞壁的阻隔，可以通過原生質體的融合進行的體細胞雜交，可以克服雜交不親和的問題，為雜交育種提供了新的手段。

原生質體的首次提取是Klercker[2]在1892年通過機械法在水劍葉葉片中獲取的。原生質體的制備研究真正開始于1960年，由Cocking[3]通過酶解法在番茄的根尖中獲取的大量的高質量原生質體。1972年Rona[4]利用酶解法建立了歐亞槭的原生質體再生體系，進而為木本植物的原生質體的培養(yǎng)提供了開端。目前在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、 煙草(Nicotiana tabacum L.)、水稻(Oryza sativa L.) 、棉花(Gossypium spp.) 、小麥(Triticum aestivum L.) 等植物中，已經建立了非常高效的原生質體瞬時轉化體系，并應用于各項基礎研究中。

甜菜原生質體成功提取在1976年，由Li成功分離出甜菜原生質體；1981年，前蘇聯學者MmolenSkays分離培養(yǎng)出來甜菜原生質體并獲得了細胞團；1985年，Szobados 和Bhat 獲得了甜菜原生質體產生的愈傷組織；國內首次獲得甜菜原生質體愈傷組織在1986年，由中國農業(yè)科學院甜菜研究所邵明文等人獲取；在1988年和1990年荷蘭學者Krens 及其同事兩次報道了成功離體培養(yǎng)了甜菜原生質體，并由此培育出再生植株；此后，1992年李永峰等[5]、1993年的郭九峰[6]及馬有會等[7]相繼報道了由甜菜原生質體培養(yǎng)獲得愈傷組織以及體細胞胚，但是沒有得到再生植株；在1994年郭九峰等[8]初步報道了從甜菜未授粉胚珠或胚的愈傷組織中獲得了原生質體，并得到再生植株，但是沒有重現性。目前，甜菜原生質體的大規(guī)模分離還不夠成功，存在原生質體分離困難、活力較低、完整性較差等問題。本文根據原生質體的制備體系流程，講述影響原生質體提取的因素，并介紹其研究進展，為了進一步完善甜菜原生質體制備體系，對甜菜原生質體的應用進行研究。

1 原生質體的分離

1.1 制備材料的選擇

選擇制備材料時需要考慮到材料的品種、組織類型以及生理狀態(tài)等因素的影響。原生質體分離的原始材料可以從植物的葉片、根、莖、果實、花等器官中分離獲取，也可以從愈傷組織、胚性愈傷組織、腫瘤組織、懸浮細胞、雌雄配子體等中分離制備。通過大量研究發(fā)現，采用懸浮細胞分離原生質體，在實驗過程中存在操作難的問題，并且懸浮細胞處于未分化的階段，由此得到的原生質體不適合進行下一步的研究。在進行實驗時，要十分注意保持材料的培養(yǎng)條件的相對穩(wěn)定性。

目前以報道的甜菜原生質體制備主要以愈傷組織、子葉、懸浮細胞、保衛(wèi)細胞等材料，并且通常選擇生長數周的幼嫩子葉的切段作為實驗材料。如1993年馬友會等[7]初次報道成功分離甜菜原生質體采用是甜菜子葉的切段。

1.2 材料的預處理

很多研究表明，酶解過程對于原生質體來說是有害的。在進行實驗前對材料進行預處理，可以改變細胞核、細胞壁的生理狀態(tài)，避免損傷細胞膜，既可以提高酶解效率，同時又能減少破壞原生質體，提高原生質體的產量，增強原生質體的活力以及保持原生質體的完整性[9]。對材料的預處理可以采用暗處理、冷處理、物理破壞組織、真空滲透處理、預先質壁分離處理等方式。郭九峰等[6]在酶解前將愈傷組織經過一定時間的低溫處理。馬有會等[7]在酶解前將子葉置于黑暗、4℃的條件下24 h，并且將子葉切條后放入CPW11M高滲溶液中先預質壁分離6h。劉巧紅等[10]在酶解前先將子葉切條，然后放入CPW12M高滲溶液進行4 h的預質壁分離。除此之外，在實驗中通常會將子葉切成1mm寬的小條，在進行酶解，這樣增加了實驗材料與酶溶液的接觸面積，可以提高酶解的效率。

1.3 原生質體分離方法

分離植物原生質體的方法主要是機械分離法和酶解分離法，目前在使用中酶解分離法更為常用。

1.3.1 機械分離法

機械分離法是將植物細胞放在高滲糖溶液中使材料發(fā)生質壁分離，待原生質體收縮成球后，與細胞壁進行脫離，之后使用剪刀等器具破壞細胞壁，將完整的原生質體從傷口釋放出來。機械法可以避免酶制劑對原生質體的破壞作用，有利于開展生理生化研究。一般只有在薄壁組織排列松散、細胞間接觸點很少時，用機械法分離葉肉細胞才能取得成功，如洋蔥球莖鱗片、蘿卜根、甜菜根組織等。但是機械法具有操作困難、產量不高、活性較低的缺點，只是在用酶解法酶解細胞壁時有很多副作用時，可采用此法。同時分生組織和液泡化程度不高的細胞不適合使用機械法。因此，現在很少人使用機械法對植物細胞進行分離。

1.3.2 酶解分離法

現在對于分離原生質體最常用的方法是酶解分離法。酶解法是指將材料放入能夠降解細胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時間，在酶液的作用下，細胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質體的方法。酶解法首次使用是Cocking[3]在1960年利用纖維素酶粗制劑從番茄的根尖中分離出大量的高質量原生質體。酶解法分為振蕩酶解和靜置酶解。振蕩酶解是將材料放在振蕩器或者搖床進行酶解；靜置酶解是在合適的溫度下，將酶液處于靜止狀態(tài)對細胞進行酶解。采用的酶主要有纖維素酶、離析酶、果膠酶、半纖維素酶和崩潰酶等。植物細胞的細胞壁主要成分為纖維素和果膠，因此在分離植物原生質體時，纖維素酶和果膠酶最為必要。纖維素酶主要起到去除植物細胞壁的纖維素的作用；果膠酶可以加快細胞間隙的果膠質的分解，促使細胞相互分離；離析酶可以消化細胞骨架的果膠質成分，可以分離粘連在一起的植物細胞。其中果膠酶對于植物原生質體的傷害較大，因此可以選擇屬于果膠酶類的離析酶來代替果膠酶進行試驗。馬有會等[7]在對甜菜雙豐10號子葉分離原生質體時采用的是2%的纖維素酶R-10、1%的離析酶R-10和0.5%的崩潰酶。由于不同研究中使用的酶的種類和濃度不同，實驗中酶制劑的選擇要根據材料的不同而定。

酶解法中，除了酶液的組成、濃度以外，酶液的pH值、酶解時的溫度和時間、酶解滲透壓以及轉速都會影響著原生質體的產量和活力。其中酶液的pH值影響著酶的活性和質膜的穩(wěn)定性，過高或者過低的pH值會改變細胞結構，破壞原生質體的形態(tài)。酶解液pH值一般和植物最適生長pH值相符，一般在5.4～5.8之間，甜菜原生質體分離實驗中pH值一般為5.7或5.8。同時在酶液中可以添加適量的MES，可以維持酶解期間的pH值穩(wěn)定性。酶解時的溫度對原生質體的分離產生多樣的影響，溫度升高會加快酶解反應的速度，但溫度過高會導致酶失去活性。因此，在酶解時要注意選擇適宜的溫度。酶解溫度一般控制在25～30℃的范圍內，甜菜原生質體分離實驗中酶解時溫度一般控制在25～27℃范圍內。酶解時間在不同植物種類、材料中是不同的，一般在4～24 h之間，酶解的時間過長會影響原生質體的活性，酶解時間過短會導致分離出的原生質體數量太少。甜菜葉片的酶解時間一般在10～14 h之間。

在酶解液中一般會添加入一定濃度的質膜穩(wěn)定劑和滲透壓穩(wěn)定劑，可以有效防止游離出來的原生質體發(fā)生破裂。經常用的滲透穩(wěn)定劑主要分為鹽溶液(如KCl、KH2PO4)和糖溶液(如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖)[11]。其中最常用的滲透壓調節(jié)劑是甘露醇，甘露醇為代謝惰性，不被植物細胞吸收利用[12]，濃度一般在0.4～0.6 mol/L，可以保持原生質體較高的活性。在酶解過程中可以通過搖床加速原生質體的分離，轉速通?？刂圃?0～50 rad/min，可以有效防止原生質體機械損傷。此外，在進行酶解時，光照可能會損傷細胞質膜，導致原生質體活力下降，因此在原生質體酶解實驗時一般選擇黑暗或者弱光的環(huán)境。

2 原生質體的純化與活力檢測

2.1 原生質體的純化

經過酶解的處理之后，還需要進一步的對原生質體提純，以此來獲得高活力的高純度的原生質體。純化原生質體是很有必要的，因為酶解后得到的是含有原生質體、未分解的細胞、細胞碎片、原生質體碎片等復雜成分的溶液，里面的雜質會污染后續(xù)的實驗。原生質體純化的方法主要有離心沉降法、漂浮法和界面離心法[13]。最常用到的是離心沉降法，原理是因原生質體性質較大，通過離心可將原生質體沉于底部，便于進一步的收集，這種方法操作方便，損失也少，但是純度不高[14]；通過漂浮法純化的原生質體純度高，但是收率較低[15]；通過界面離心法得到的原生質體大小均勻，但是收率比較低[16]。馬有會等[7]在對甜菜原生質體的提純中采用了離心沉降法，將濾液放入500 rpm速率下的離心機進行3～5 min的離心，然后去除上層的雜質，采集底部的原生質體。

2.2 原生質體活力的檢測

檢測原生質體活性常用的方法有熒光素二乙酸(FDA)染色法，酚藏花紅染色法、臺盼蘭染色法、熒光增白劑染色法等[17]。熒光素二乙酸(FDA)染色法是檢測原生質體活性最常用的方法，FDA本身是沒有熒光的，是可以穿過細胞膜自由出入細胞的，在活細胞中FDA 經酯酶可以分解為熒光素，在鏡檢時顯示黃/綠色熒光，死細胞顯示紅色熒光或者是不發(fā)熒光的[18]。劉巧紅等[10]采用2.0%Evans blue 染色測定原生質體活力。

3 當前存在的問題

近年來，關于植物原生質體研究得到了快速的發(fā)展，有更多的植物種類通過原生質體得到了再生植株，有一些的植物建立了比較完善原生質體制備體系。但是甜菜原生質體分離的報道較少，還處在不斷探索的階段。在甜菜原生質體分離中還存在著原生質體分離困難、原生質體活力不高、效率低等問題。

對于分離材料而言，在現有對于原生質體分離的研究中，每次研究往往只選取一個品種來探索原生質體分離條件，且材料單一，導致具有一定的局限性。在目前對于甜菜原生質體分離材料中主要是選擇愈傷組織或者子葉。一些報道選擇甜菜子葉為分離材料時，原生質體分離的難度較小，但是葉片表面蠟質層相對較厚，導致分離出的原生質體較少。選擇胚性懸浮細胞或愈傷組織作為甜菜原生質體分離實驗材料時，原生質體的產量較高、活力較強，分離出的原生質體也有易培養(yǎng)、易分化的優(yōu)點，但是培養(yǎng)懸浮細胞系周期較長。

對于酶解條件而言，已有的報道中主要采用的纖維素酶、離析酶和果膠酶對甜菜原生質體進行分離實驗，但是不同報道中酶解液的成分和比例是不同的，所用的材料也是不同的。因此，得到的最適組合是不同的，需要綜合考慮酶液的pH值、酶解時的溫度和時間、酶解滲透壓以及轉速等多種因素的影響。在對于酶解時間的選擇上，馬有會等[7]認為酶解10 h得到的效果更好，而劉巧紅等[10]認為酶解12 h得到的效果更好，說明不同的實驗條件下，實驗條件的優(yōu)化要具有針對性。

對于原生質體應用而言，現有的甜菜原生質體制備中，實驗要經過一系列的操作才能分離出原生質體，在實驗中原生質體容易受到化學損傷和機械損傷，降低原生質體活力，加大了原生質體培養(yǎng)的難度，致使成活率低，阻礙了原生質體的應用。因此，需要建立一種簡便高效的甜菜原生質體制備體系，便于研究無性雜交、亞細胞定位、目的基因的瞬時表達、遺傳轉化和突變體的選擇等。

4 研究展望

甜菜原生質體高效分離體系尚未完善，近年來，對于甜菜原生質體制備的研究較少。甜菜原生質體研究應用的基礎是可以輕易得到大量活力高的原生質體。根據已有研究表明，原生質體制備的第一步是選擇合適的分離材料。再者是酶解時選擇合適的酶液種類、濃度、酶液的pH值、酶解時的溫度和時間、酶解滲透壓以及轉速，以此獲得的原生質體產量更大、活力更高。影響原生質體分離效率的因素很多，可以通過正交實驗對不同品種不同類型的材料進行實驗，從而明確單個因素對結果的影響水平，進而優(yōu)化實驗參數，確定甜菜原生質體制備所需的最佳條件，構建甜菜原生質體分離體系。鄒彰毅等[19]通過單因素試驗和正交實驗研究發(fā)現菌齡、溶壁酶濃度、酶解時間、酶解溫度、pH5個因素對姬松茸原生質體制備及再生的影響，進而建立了姬松茸原生質體分離體系，以提高姬松茸原生質體產量和再生率；楊成蘭等[20]以青稞幼葉為材料設計4因素3水平的正交實驗，包括甘露醇濃度、酶解時間、離心速度和不同苗齡因素，對青稞原生質體制備進行優(yōu)化。

甜菜原生質體制備還存在一定的困難，甜菜原生質體的成功制備可以更好的研究甜菜在體細胞雜交、亞細胞定位、無性雜交、基因轉化和誘導突變體等，可以進一步的加快有關甜菜遺傳學、生理生化等實驗技術的發(fā)展，對于甜菜的遺傳育種具有重要意義。