不同檢測(cè)方法對(duì)甜菜SCoT和DAMD擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性的影響

梁雪梅，吳則東

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2.黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080)

0 引言

食糖除了可以從廣泛種植于熱帶的糖料作物甘蔗中提取，還能從溫帶糖料作物甜菜中獲取，且大約四分之一的食糖都提取自甜菜栽培變種糖甜菜。同時(shí)糖甜菜作為我國(guó)北方的重要經(jīng)濟(jì)作物和糖料作物，其產(chǎn)區(qū)主要集中在新疆、內(nèi)蒙古及黑龍江，總種植面積和總產(chǎn)量約占全國(guó) 90%左右[1]。然而目前我國(guó)幾乎100%的甜菜生產(chǎn)用種都依靠進(jìn)口，國(guó)內(nèi)自主培育生產(chǎn)的品種占市場(chǎng)的比率幾乎可以忽略[2]，國(guó)外進(jìn)口的種子多為經(jīng)過(guò)處理的丸?；N子，且市場(chǎng)上偶有品種張冠李戴或者品種純度不夠等現(xiàn)象發(fā)生，致使品種的品質(zhì)難以保證，會(huì)對(duì)農(nóng)戶生產(chǎn)造成一定的損失，所以發(fā)展快速鑒定甜菜品種真?zhèn)蔚募夹g(shù)，具有重要意義。分子標(biāo)記技術(shù)就是能快速鑒定甜菜品種真實(shí)性的有效手段之一。

目前，分子標(biāo)記技術(shù)經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，已被應(yīng)用于甜菜的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位和遺傳多樣性分析等方面，目前已經(jīng)應(yīng)用于甜菜的分子標(biāo)記技術(shù)包括如RFLP[3]、RAPD[4]、ISSR[5]、SSR[6,7]、InDeL[8]、DAMD[9,10]和SCoT[11]等。而DAMD 和SCoT 作為新型的分子標(biāo)記，近幾年在國(guó)內(nèi)外開(kāi)始應(yīng)用于作物遺傳育種的各個(gè)方面。定向擴(kuò)增小衛(wèi)星DNA (Direct Amplification of Minisatellite DNA by PCR, DAMD) 是Health[12]等在1993年提出的，該標(biāo)記是從野生水稻品種的重復(fù)序列中選擇出來(lái)的，標(biāo)記通常有約20個(gè)核苷酸，多態(tài)性高，重復(fù)性好。該技術(shù)已被運(yùn)用于無(wú)花果[13]、花生[14]、扁豆[15]、黃瓜[16]等植物遺傳育種的各方面的研究中。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記(start condon targeted polymorphism，SCoT)是Collard 和Mackil[17]于2009年提出的，是一種基于翻譯起始位點(diǎn) (ATG) 的目的基因標(biāo)記，多態(tài)性豐富。已在飼用燕麥[18]、甘薯[19]以及小麥[20]等農(nóng)作物的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建等方面得到應(yīng)用。這兩種引物的多態(tài)性都十分豐富，分辨率高，都可用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

早有研究表明不同的凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性存在一定的影響。李新海等[21]首先利用3% 瓊脂糖凝膠和12%的聚丙烯凝膠酰胺電泳對(duì)SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，結(jié)果表明瓊脂糖凝膠電泳更適于遺傳作圖和基因定位的研究，聚丙烯酰胺凝膠電泳則可用于遺傳多樣性和構(gòu)建指紋圖譜的研究；而孫燕紅等[22]利用26條DAMD 引物和12個(gè)甜菜品種，對(duì)比2%的瓊脂糖凝膠和6%聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性的影響時(shí)，則發(fā)現(xiàn)瓊脂糖凝膠電泳與聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性顯現(xiàn)結(jié)果無(wú)顯著差異；謝小燕等[23]采用2%瓊脂糖凝膠電泳和5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)ISSR-PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)了5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳可獲得更可靠的遺傳圖譜，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)更適合前期的ISSR引物的篩選。

由于前人相關(guān)的甜菜DAMD[22,24]和SCoT[11]的實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)中既有使用6%和8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，也有利用2%瓊脂糖凝膠的，因此并不確定哪種凝膠電泳方法及濃度檢測(cè)DAMD和SCoT擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性的效果最好。且至今國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)同時(shí)利用不同濃度瓊脂糖凝膠電泳，以及不同濃度非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)甜菜DAMD-PCR和SCoT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。因此，試驗(yàn)在前人的基礎(chǔ)上以8個(gè)不同的甜菜品種對(duì)7條DAMD引物和15條SCoT 引物進(jìn)行篩選，選出多態(tài)性最好，分辨率最高的核心引物；再利用不同濃度的瓊脂糖凝膠和非變性聚丙烯酰胺凝膠兩種電泳方法對(duì)甜菜基因組擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性的影響進(jìn)行對(duì)比分析，選出甜菜DAMD和SCoT引物擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性檢測(cè)的最優(yōu)方法，為甜菜品種指紋圖譜構(gòu)建以及高效、快速地對(duì)甜菜品種真實(shí)性鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選擇8個(gè)來(lái)自法國(guó)SES VanderHave 公司、美國(guó)BETASEED公司、丹麥Maribohillesh?g ApS公司、德國(guó)KWS SAAT SE 公司以及中國(guó)吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的甜菜登記品種作為供試材料，甜菜品種具體信息見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)材料Tab.1 Test materials

試驗(yàn)所選擇多態(tài)性較好的7條DAMD引物和15條SCoT 引物來(lái)自黑龍江大學(xué)甜菜分子實(shí)驗(yàn)室，是在前人研究的基礎(chǔ)上確定的。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，經(jīng)過(guò)HAP純化，引物稀釋為10 μmol/L，備用。具體序列見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)所選引物名稱與序列Tab.2 Primer names and sequences selected for the test

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

將所選的8個(gè)甜菜品種種植在黑龍江大學(xué)甜菜育種改良中心，待其幼苗生長(zhǎng)出2片真葉，即可進(jìn)行DNA提取。參考王宇晴等[25]改良的CTAB法提取甜菜品種的基因組DNA，測(cè)定完DNA的純度和濃度后，用ddH2O將其濃度稀釋為10 ng/μL，備用。

1.2.2 引物擴(kuò)增體系與程序

PCR擴(kuò)增的總體系為5 μL，其中包含正反向引物0.4 μL(10 pmol/L)，2×MIX(2*Rapid Taq Master Mix)2.5 μL，ddH2O 1.1 μL，模板DNA 1 μL(10 ng/μL)。

DAMD引物和SCoT引物的PCR 程序都是 Touchdown程序：程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)一次；94℃變性15 s，65℃～56℃變溫退火15 s，72℃延伸30 s(65℃～56℃變溫期間，每降1℃循環(huán)2次，共循環(huán)20次)；接著再進(jìn)行94℃變性 15 s，55℃固定退火 15 s，72℃延伸30 s，循環(huán) 20次；72℃再延伸 5 min；16℃保存。

1.2.3 凝膠電泳檢測(cè)

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，利用6%、 8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠和1%、2%的瓊脂糖凝膠電泳分別進(jìn)行檢測(cè)，6%和 8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳時(shí)，然后在0.5×TBE緩沖液中進(jìn)行恒壓180 V，90 min電泳。用無(wú)毒，高效的G-red核酸染料進(jìn)行泡染顯影，接著用Syngene G: BOX 凝膠成像儀觀察、照相記錄，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

以人工觀察讀帶的方法，在相同遷移率的位置上，有條帶記為“1”，無(wú)條帶為“0”，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算多態(tài)性條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜SCoT 和DAMD核心引物篩選

利用8個(gè)來(lái)自5個(gè)育種公司的甜菜品種，對(duì)選用的7條DAMD引物和 15 條 SCoT引物進(jìn)行檢測(cè)篩選，對(duì)兩種核心引物的篩選都遵循擴(kuò)增條帶清晰，多態(tài)性豐富且易識(shí)別的原則，最終確定最優(yōu)的DAMD引物4條，分別為URP1F、URP2R、URP6R、URP17R；SCoT引物2條，分別為SCoT12和SCoT13，核心引物擴(kuò)增產(chǎn)物詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

2.2 不同濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳效果對(duì)比

DAMD和SCoT 共6條核心引物，分別用6%和8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)它們擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)利用不同濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)不同的引物，甚至同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，它們的條帶總數(shù)、條帶多態(tài)性和帶型等方面的差異都十分顯著，見(jiàn)圖 1。

在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)中顯示，這6條核心引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶中最多的有30條，最少的也有12條，擴(kuò)增產(chǎn)物總條帶為131條，其中有130條多態(tài)性條帶，總的多態(tài)性條帶占比為99.2%，見(jiàn)表3。其中引物URP1F、URP2R、URP6R對(duì)8個(gè)甜菜品種進(jìn)行擴(kuò)增后，產(chǎn)物在非變性聚丙烯電泳效果如圖1所示，其中URP2R 擴(kuò)增出16條條帶清晰易識(shí)別，全為多態(tài)性條帶。但8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，產(chǎn)物難以分離，條帶聚集，難分辨。由此可知，濃度為6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠比濃度為8%的更適用于甜菜SCoT和DAMD擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性的檢測(cè)。

圖1 引物URP1F、URP2R、URP6R對(duì)8份甜菜品種擴(kuò)增圖注：左為6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，右為8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，M：DM 50 bp DNA Markers，1～8為品種編號(hào)，同表1Fig.1 Amplification of primers URP1F, URP2R, and URP6R on 8 sugar beet varietiesNote:The left panel shows 6% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, the right panel shows 8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, M:DM 50 bp DNA Markers, and 1～8 are variety numbers, same as Table 1.

表3 核心引物擴(kuò)增產(chǎn)物信息Tab.3 Information of core primer amplification

2.3 不同濃度瓊脂糖凝膠電泳效果對(duì)比

分別利用1%和2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)選出的6條DAMD和SCoT的核心引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。結(jié)果表明，用濃度不同的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)不同引物或同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，其顯示的產(chǎn)物分辨率、多態(tài)性和條帶亮度等均有一定的差異性，見(jiàn)圖2。其中用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)6條核心引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性時(shí)，擴(kuò)增總條帶為57條，其中多態(tài)性條帶有43條，總的多態(tài)性占比為75.4%，各個(gè)引物多態(tài)性占比范圍在62.5%～85.7%，其中URP2R的多態(tài)性條帶占比最高為85.7%，SCOT12的最低為62.5%，見(jiàn)表3。而1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)產(chǎn)物的條帶圖雖能顯示一定的多態(tài)性，但條帶分離較差，出現(xiàn)重疊的情況。所以使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)甜菜SCoT和DAMD擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性時(shí)，2%的瓊脂糖凝膠比1%的瓊脂糖凝膠更好。

圖2 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 6條核心引物對(duì)8份甜菜品種擴(kuò)增圖注：A為1%瓊脂糖凝膠電泳，B為2%瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳，M: DM 2000bp DNA Markers，1～8為品種編號(hào)，同表 1Fig.2 Amplification map of 8 sugar beet varieties using agarose gel electrophoresis detection with 6 core primersNote: A is 1% agarose gel electrophoresis, B is 2% agarose gel electrophoresis gel electrophoresis, M: DM 2000bp DNA Markers, 1～8 are variety numbers, same as Table 1

2.4 兩種凝膠電泳效果對(duì)比

同時(shí)利用瓊脂糖和非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)6 條核心引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)兩種凝膠電泳方法均能分離出清晰的條帶，但分離顯現(xiàn)出的總條帶和多態(tài)性帶的數(shù)量不同。以6%非變性聚丙烯酰胺凝膠和2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)效果進(jìn)行對(duì)比可知，非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)出的總條帶和多態(tài)性帶的數(shù)量均比瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的高，見(jiàn)表 3，原因在于DAMD和 SCoT的PCR擴(kuò)增特性以及兩種凝膠的分辨率。6 條核心引物擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中共分離出57條條帶，43條多態(tài)性條帶，總的多態(tài)性占比為75.4%；而在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測(cè)出總條帶數(shù)為131條，其中130條為多態(tài)性條帶，總的多態(tài)性條帶占比為99.2%。

從6%非變性聚丙烯酰胺凝膠擴(kuò)增的總條帶數(shù)比2%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出的總條帶數(shù)多了近2.3倍，而在總多態(tài)性占比中，6%非變性聚丙烯酰胺凝膠是2%瓊脂糖凝膠的3倍?？煽闯銮罢呔哂械姆直媛矢?，而后者則無(wú)法顯現(xiàn)部分DNA條帶。說(shuō)明6%非變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)分離DAMD和 SCoT擴(kuò)增產(chǎn)物的效果更好，能更準(zhǔn)確地反映甜菜品種的遺傳信息。

3 討論與結(jié)論

利用不同濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳，分別對(duì)甜菜DAMD-PCR和SCoT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，由于不同濃度凝膠的分辨能力不同。所以本研究中利用6%和8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，以及1%和2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)出的條帶結(jié)果出現(xiàn)顯著差異性，6%非變性聚丙烯酰胺凝膠和2%瓊脂糖凝膠擴(kuò)增出的條帶總數(shù)和條帶多態(tài)性都比對(duì)比濃度的更好。

不同的電泳方法的分辨率也存在差異，有研究表明聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，具有比瓊脂糖凝膠電泳更高的分辨率和靈敏性，能更準(zhǔn)確地反映研究對(duì)象的遺傳信息。葉春秀等[26]在利用2.5%瓊脂糖凝膠和 6%的聚丙烯酰胺凝膠分析這兩種電泳方法在新陸早系列材料 SSR 分析不同階段使用效果的可行性時(shí)，發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出的總條帶數(shù)較多，能更加準(zhǔn)確，完整地反映 SSR 標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的信息；張彥蘋(píng)等[27]以兩種電泳方法檢測(cè)石榴 RAPD 擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果顯示聚丙烯酰胺凝膠電泳的總條帶數(shù)比瓊脂糖凝膠電泳多1.5倍。本試驗(yàn)中6%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)的總條帶數(shù)比2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出的總條帶數(shù)多了近2.3倍，總多態(tài)性占比中，6%非變性聚丙烯酰胺凝膠是2%瓊脂糖凝膠的3倍，可看出前者的分辨率更高，而后者則無(wú)法顯現(xiàn)部分DNA條帶。因此可以確定利用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法比2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)對(duì)甜菜DAMD和 SCoT擴(kuò)增產(chǎn)物的效果更好，更能準(zhǔn)確地反映甜菜品種的遺傳多樣性信息。

品種真實(shí)性鑒定以及遺傳差異分析需要準(zhǔn)確的遺傳多樣性信息，而非變性聚丙烯酰胺凝膠更易獲得更多數(shù)量的 DAMD和 SCoT條帶，具有高多態(tài)性比率的特點(diǎn)，因此在甜菜的品種真實(shí)性鑒定方面優(yōu)于瓊脂糖凝膠電泳。但瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)和便于觀察等優(yōu)點(diǎn)，常用于擴(kuò)增產(chǎn)物分析檢測(cè)[28]，可又因其每次檢測(cè)樣本數(shù)量少和分辨率較低，不能用于大量樣品檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)中。因此可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)的要求，選擇更適合的電泳檢測(cè)方法，對(duì)于利用DAMD和 SCoT引物構(gòu)建甜菜品種指紋圖譜構(gòu)建，這種需要檢測(cè)樣品數(shù)量大，且需獲得更準(zhǔn)確地遺傳信息的研究，更適合選用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，提高檢測(cè)效率。

致謝

基金項(xiàng)目：“財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助(CARS-170111)”。