基于PLS-DA 方法分析變黃方式對烤煙品質(zhì)的影響

陳飛程，楊懿德，段玉鋒，李生棟，楊 洋，鄢 敏，段衛(wèi)東

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 四川省煙草公司宜賓市公司，四川 宜賓 644000；3. 云南省煙草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655001；4. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450016）

變黃期是烤煙大分子物質(zhì)開始降解轉(zhuǎn)化、致香物形成、品質(zhì)彰顯的重要階段[1]。該時期煙葉外觀發(fā)生巨大轉(zhuǎn)變，內(nèi)在化學(xué)成分劇烈反應(yīng)，進而促進煙葉品質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)化和提升，以及煙葉特征香氣、感官、外觀顏色等品質(zhì)的形成。當(dāng)前烘烤過程中應(yīng)用較為廣泛的變黃方式有低溫低濕變黃、中溫中濕變黃、高溫高濕變黃和高溫保濕變黃等[2-6]。因此，變黃方式的差異會使得煙葉品質(zhì)等到不同程度的彰顯。如翠碧一號以低溫中濕變黃有利于降低細胞壁物質(zhì)含量，烤后煙化學(xué)成分協(xié)調(diào)，感官質(zhì)量總體得分最高[6]。豫煙7、9、10 號配合中溫高濕變黃，其烤后煙化學(xué)成分協(xié)調(diào)，香氣質(zhì)較好、雜氣少且刺激性小，經(jīng)濟性狀、外觀質(zhì)量評價最高，感官質(zhì)量較好[7]。高溫中濕變黃對于K326 上部葉烤后煙品質(zhì)有明顯提升[8]。然而，當(dāng)前關(guān)于烤煙品質(zhì)研究多以化學(xué)成分協(xié)調(diào)性和感官質(zhì)量為主要評價指標(biāo)，指標(biāo)設(shè)計不夠全面，綜合探討變黃方式對烤煙品質(zhì)成分和評價指標(biāo)影響的系統(tǒng)研究較少。為此，設(shè)定現(xiàn)有生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的階段降低濕球、脅迫失水變黃、中溫中濕和高溫保濕4種變黃方式，對烤后煙外觀顏色和感官質(zhì)量進行比較，并對其內(nèi)在的多酚類物質(zhì)、常規(guī)化學(xué)成分、游離氨基酸組分和有機酸組分等煙葉生化成分進行差異分析，同時進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），以獲得不同變黃方式影響烤煙的差異性生化成分。探究變黃方式對烤煙外觀顏色、吸味差異和生化成分的影響，綜合獲得最優(yōu)的烤煙變黃方式，旨在為優(yōu)質(zhì)煙葉的品質(zhì)調(diào)控和標(biāo)準(zhǔn)化烘烤提供理論支持及技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地（34°8′N，113°48′E）進行。試驗材料為云煙116 中部葉，含水率為（84±1）%，采摘時間為2020 年8 月12－19 日。所采煙葉安排在當(dāng)?shù)氐? 層2 路烤房中進行試驗，烤房規(guī)格為2.7 m×8.0 m×3.5 m 的氣流下降式的密集烤房群，裝煙竿數(shù)為360竿。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選取素質(zhì)一致的鮮煙葉進行裝炕，按照同竿同質(zhì)的要求進行編竿裝煙操作，選取其中具有代表性的10 竿煙用于烤后煙葉質(zhì)量指標(biāo)測定。根據(jù)云煙116 的鮮煙素質(zhì)[9]、生化指標(biāo)[10]、烘烤特性[11]，變黃階段設(shè)置階段降低濕球變黃（T1）、脅迫失水變黃（T2）、中溫中濕變黃（T3）、高溫保濕變黃（CK）等4種行業(yè)中應(yīng)用較為廣泛的變黃處理方式。試驗過程中均干燥至葉片含水率45%左右，葉片黃片青筋、凋萎勾尖為止。后續(xù)的定色和干筋期均根據(jù)三段式烘烤工藝[12]進行。試驗重復(fù)3次。

階段降低濕球變黃（T1）：參照劉勇等[5]的變黃方式，在變黃中期（干球38～39 ℃）穩(wěn)溫過程每隔4 h將濕球溫度降低1 ℃，最終穩(wěn)定在36 ℃；

脅迫失水變黃（T2）：參照魏碩等[13]的變黃方式，在變黃前期通過升高干、濕球溫度至40 ℃來加快煙葉脫水以保證失水的均勻性，期間濕球溫度降低1 ℃，促進失水，用時10 h左右；

中溫中濕變黃（T3）：參照王威威等[6]的變黃方式，在變黃期各穩(wěn)溫階段保持干濕差在2 ℃左右；

高溫保濕變黃（CK）：參照孟智勇等[7]的變黃方式，在變黃前期（38/37 ℃）、變黃中期（42/40 ℃）以較高的干濕球溫度使煙葉快速變黃后失水。

1.3 指標(biāo)檢測方法

1.3.1 多酚類物質(zhì)含量檢測 參照許美玲等[14]的方法測定不同變黃方式下烤后煙樣的多酚類化合物綠原酸（CA）、新綠原酸（NA）、隱綠原酸（CRA）、莨菪亭（CHA）和蕓香苷（R）含量。

1.3.2 常規(guī)化學(xué)成分檢測 以不同變黃方式獲得的烤后煙樣為檢測對象，參照馬一瓊等[15]的方法測定總糖（TS）、還原糖（RS）、煙堿（NIC）、總氮（TN）、淀粉（NS）、鉀（K）和氯（Cl）的含量。

1.3.3 烤后煙氨基酸成分檢測 參考賈保順等[16]的方法，測定不同變黃方式烤后煙樣品中的脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、色氨酸（Trp）、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）共11種游離氨基酸的含量。

1.3.4 烤后煙有機酸成分檢測 參考金永明等[17]的方法，采用硫酸甲酯化－氣相色譜－內(nèi)標(biāo)法測定不同變黃方式的烤后煙樣中非揮發(fā)有機酸。

1.3.5 烤后煙外形顏色屬性檢測 采用WSC-3 型全自動色差計，參考賀帆等[18]的方法測定不同變黃方式的烤后煙外觀顏色指標(biāo)亮度值（L*）、紅度值（a*）、黃度值（b*）、飽和度（C*）和色相角（H*）。

1.3.6 感官評價 由河南中煙技術(shù)中心5名具有卷煙感官評價資格的評委進行感官評價。感官評吸方法為，將烤后煙樣切絲卷制得到的煙支置于（22±1）℃和RH（60±2）%環(huán)境中平衡48 h，參照李生棟等[19]的方法對參比處理的卷煙進行評吸打分。感官總分=（香氣質(zhì)+香氣量）×2.4+（濃度+干凈程度）×1.6+細膩程度+雜氣+刺激性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 2020 分析不同變黃方式下的品質(zhì)成分；應(yīng)用DPS 7.05 分析不同變黃方式下品質(zhì)成分含量間的差異顯著性；利用SIMCA-P 11 對不同變黃方式下的顏色和感官品質(zhì)進行主成分分析，采用PLS-DA 方法對不同變黃方式進行判別分析，再根據(jù)變量投影重要性（VIP）的貢獻權(quán)重分析差異性內(nèi)在化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 變黃方式對烤煙外觀和感官品質(zhì)的影響

2.1.1 烤煙外觀顏色指標(biāo) 不同變黃方式下的烤后煙外觀顏色方面（圖1），CK 處理的烤后煙亮度L*值顯著高于T1、T2 和T3 處理（P＜0.05）。紅度a*值表現(xiàn)為T1=T2＞T3＞CK，T2 處理的黃度b*值和飽和度C*值最高。CK 處理外形亮度較高，其原因可能是高溫高濕作用導(dǎo)致煙葉干物質(zhì)消耗過多，煙葉身份較薄，增強了葉面的光反射。因此，從煙葉外觀亮度L*值、紅度a*值和黃度b*值來看，T2 處理烤后煙的顏色最接近國際色卡橘黃色的色度標(biāo)準(zhǔn)（85，10，95），CK 處理的烤后煙外觀顏色則較接近于檸檬黃的色度標(biāo)準(zhǔn)（90，0，80）。

2.1.2 烤煙整體感官品質(zhì) 變黃方式對烤后煙的香氣、煙氣和口感等感官評價指標(biāo)均影響顯著（表1）。香氣方面，T2處理烤后煙香氣質(zhì)最佳，香氣量足且雜氣較少，透發(fā)性得分最高。煙氣方面，T1和T2處理濃度和勁頭得分均顯著高于其他處理，煙氣細膩同時成團性好，尤其以T2 處理最佳?？诟蟹矫?，CK處理烤后煙刺激性較小、得分最高，煙氣干燥感較好，煙氣較為純凈，但是回甜感略差，而T2處理則與之相反。整體感官品質(zhì)總分表現(xiàn)為T2＞T1＞T3＞CK，即T2處理最有利于高品質(zhì)烤后煙的形成。

表1 不同變黃方式烤后煙的感官質(zhì)量指標(biāo)得分Tab.1 Score of sensory quality of tobacco after curing with different yellowing methods

2.2 變黃方式對烤煙生化品質(zhì)成分的影響

2.2.1 烤煙多酚類物質(zhì)含量 由圖2 可知，變黃方式對烤煙多酚類物質(zhì)指標(biāo)中的綠原酸和蕓香苷含量有顯著影響（P＜0.05），表現(xiàn)為T2＞T1＞T3＞CK，蕓香苷含量表現(xiàn)為T2＞T1＞CK＞T3。各處理烤后煙的新綠原酸、隱綠原酸和莨菪亭含量均較小。

圖2 不同變黃方式烤后煙的多酚類含量Fig.2 Polyphenol content of tobacco after curing with different yellowing methods

2.2.2 烤煙常規(guī)化學(xué)成分含量 不同變黃方式的烤后煙化學(xué)成分如圖3所示，TS和RS含量由大到小為T3、T1、T2、CK，說明T3 和T1 處理的中溫變黃環(huán)境有利于煙葉中總糖和還原糖的形成。TN 和NIC的含量以T2 處理最高，T1 和T3 處理次之，CK 處理最低。NS 含量表現(xiàn)為T3＞T2＞CK＞T1，且各處理間差異顯著（P＜0.05），說明高溫環(huán)境有利于煙葉中的淀粉降解。T2處理的K含量顯著高于其他處理（P＜0.05），Cl含量表現(xiàn)為CK＞T3＞T1＞T2。

圖3 不同變黃方式烤后煙的常規(guī)化學(xué)成分含量Fig.3 Chemical composition of tobacco after curing with different yellowing methods

2.2.3 烤煙氨基酸含量 由圖4 可以看出，各氨基酸組分中以中性氨基酸脯氨酸的含量最高，天冬酰胺和谷氨酰胺次之，芳香族氨基酸和酸性氨基酸中以苯丙氨酸、色氨酸和谷氨酸、天冬氨酸含量相對較多，堿性氨基酸的含量相對較少。此外，變黃方式對氨基酸各組分含量有顯著影響（P＜0.05），脯氨酸、精氨酸、谷氨酸、組氨酸等氨基酸的含量均以T2處理最高，天冬酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的含量均以CK 處理最高，T1處理次之。脯氨酸、精氨酸、組氨酸和谷氨酸含量表現(xiàn)為T2＞T1＞CK＞T3，且各處理間有顯著差異（P＜0.05）。T3 處理的賴氨酸含量顯著高于其他處理（P＜0.05），天冬氨酸則以T1處理含量最高（P＜0.05）。由此可知，高溫變黃環(huán)境促進脯氨酸、賴氨酸、精氨酸和色氨酸生成，但是高溫高濕環(huán)境對脯氨酸和天冬酰胺的生成又有所抑制，并且促進苯丙氨酸的生成。

圖4 不同變黃方式烤后煙的中性氨基酸（a）、芳香族氨基酸（b）、堿性氨基酸（c）和酸性氨基酸（d）含量Fig.4 The content of neutral amino acids（a），aromatic amino acids（b），alkaline amino acids（c），and acidic amino acids（d）in tobacco after curing with various yellowing methods

2.2.4 烤煙中性有機酸成分含量 由表2 可知，不同的變黃方式對烤煙中性有機酸成分中草酸、乙酰丙酸、蘋果酸、亞油酸和油酸+亞麻酸均有顯著影響（P＜0.05）。草酸含量以T2 處理最高，CK 處理最低；丙二酸含量以CK 處理最高，T2 處理次之，T1 處理最低；乙酰丙酸含量表現(xiàn)為T1＞T2＞T3＞CK；蘋果酸含量表現(xiàn)為T3＞T2＞T1＞CK；檸檬酸含量以T3 處理最高，CK 處理最低；棕櫚酸含量表現(xiàn)為T1＞T2＞CK＞T3；亞油酸含量表現(xiàn)為CK 處理最高，T3 處理最低；油酸和亞麻酸總量表現(xiàn)為T1＞T3＞T2＞CK。由此可知，高溫高濕的變黃環(huán)境會促進草酸、乙酰乙酸、檸檬酸、棕櫚酸、油酸和亞麻酸的降解，而高溫環(huán)境變黃會促進蘋果酸和亞油酸的形成。

表2 不同變黃方式烤后煙的中性有機酸成分含量Tab.2 Content of neutral organic acids in tobacco after curing with different yellowing methodsmg/g

2.3 基于PLS-DA方法分析變黃方式對烤煙生化成分的影響

為進一步分析獲取4種變黃方式下的差異性內(nèi)在化合物，基于烤煙44 種內(nèi)在化合物以PLS-DA 方法為手段分析4種變黃方式對烤后煙內(nèi)在化合物的影響。由圖5a 可以看出，數(shù)據(jù)的分類算法效果較好，可使4種變黃方式樣本點完全分開，且沒有樣品出現(xiàn)交叉的情況，說明4 種變黃處理方式下的烤后煙內(nèi)在生化成分存在一定的差異。通過PLS-DA 模型下的變量投影重要性排序（VIP＞1）獲得了12種區(qū)分烤煙變黃方式的差異內(nèi)在化合物（圖5b），分別為還原糖、煙堿、總氮、鉀、綠原酸、蕓香苷、脯氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酸、蘋果酸、乙酰丙酸，其中VIP＞1.5 的物質(zhì)有煙堿、脯氨酸和綠原酸。綜上，這些差異性內(nèi)在化合物含量的不同導(dǎo)致4種變黃方式下烤煙品質(zhì)的差異。因此，在烤煙烘烤過程中，可通過調(diào)控這些貢獻權(quán)重較大的品質(zhì)成分以獲得較優(yōu)品質(zhì)的烤后煙。

圖5 不同變黃方式PLS-DA模型二維得分（a）、VIP值（b）Fig.5 2D score（a），VIP value（b）of PLS-DA model of different yellowing methods

3 結(jié)論與討論

脅迫失水變黃處理烤后煙的顏色最接近國際色卡橘黃色的色度標(biāo)準(zhǔn)，且橘黃色的飽和度高，葉面光澤而不顯纖薄，顏色分布均勻，色差較小。其原因是變黃期階段的高溫高濕環(huán)境促進了煙葉的水分遷移，隨后濕球溫度逐漸降低，使過氧化物酶及多酚氧化酶失活，以及葉內(nèi)的葉綠素得以分解，煙葉在濕熱空氣中過渡時間更短，從而在一定程度抑制了煙葉的褐變。高溫保濕變黃處理的烤后煙外觀顏色則較接近于檸檬黃的色度標(biāo)準(zhǔn)，說明較高的濕度與長時間干燥的共同作用造成煙葉干物質(zhì)的減少，葉片透薄，進而出現(xiàn)較低的亮度值和紅度值。高溫保濕變黃處理的高溫保濕操作使得煙葉初始升溫過快，細胞破損嚴(yán)重，容易導(dǎo)致煙葉發(fā)生褐變[20-21]。且烤煙處于高濕環(huán)境中時間較長，加上較長的烘烤時長為酶促棕色化反應(yīng)產(chǎn)物的形成提供了充足的時間，這也導(dǎo)致該處理烤黑煙比例較高，類似的現(xiàn)象在香菇[22]的干燥中也有報道。脅迫失水變黃處理階段的高溫高濕與后續(xù)階段降低濕球操作共同作用既保證煙葉變黃與失水的協(xié)調(diào)，又促進葉內(nèi)揮發(fā)性香氣物質(zhì)的充分釋放，故而香氣質(zhì)、香氣量最佳，評吸感官最好。變黃期的高溫環(huán)境可有效增加淀粉酶和蛋白酶活性，促進煙葉烘烤過程中淀粉和蛋白質(zhì)的熱解[23]。脅迫失水變黃處理為變黃期提供了較為穩(wěn)定的溫濕度條件，各化學(xué)成分轉(zhuǎn)化較為徹底，故烤后煙化學(xué)成分較為協(xié)調(diào)且符合優(yōu)質(zhì)煙葉標(biāo)準(zhǔn)。長時間的高濕環(huán)境變黃會促進淀粉熱裂解[24]，故高溫保濕變黃處理在高溫高濕環(huán)境中變黃其淀粉含量低于其他處理。氨基酸是構(gòu)成烤煙感官香氣特性的重要成分，可通過與羥基化合物（還原糖、多酚等）發(fā)生美拉德反應(yīng)參與烤煙香氣的形成[25]。長時間的高溫變黃會促進蛋白質(zhì)類的熱裂解反應(yīng)，導(dǎo)致氨基酸含量較高；且高濕環(huán)境抑制了氨基酸的脫氨脫羧反應(yīng)[26]。因此，與高溫保濕變黃處理相比，脅迫失水變黃和階段降低濕球變黃處理中性氨基酸含量較高，而芳香族氨基酸含量較低。

揮發(fā)性有機酸是卷煙主流煙氣中一類重要的香味成分[27]。高溫變黃環(huán)境下，蘋果酸脫氫酶活性升高，促進草酰乙酸向蘋果酸的轉(zhuǎn)化[28]，且進一步促進葉片溫度的上升，導(dǎo)致過氧化物酶類活性的上升，加快揮發(fā)性有機酸的降解[29]，故高溫保濕變黃處理的有機酸含量低于脅迫失水變黃處理。

持續(xù)的高溫高濕環(huán)境通過濕熱空氣的傳導(dǎo)加速了葉溫的升高[30]，增加了多酚類的熱降解反應(yīng)，葉溫升速相對較快，導(dǎo)致葉內(nèi)酶促反應(yīng)在變黃階段持續(xù)進行，多酚類物質(zhì)進一步氧化、裂解，綠原酸和蕓香苷等主要多酚物質(zhì)含量相對較低[31-32]。脅迫失水變黃和階段降低濕球變黃處理均是側(cè)重控制煙葉水分確保變黃，變黃階段需適時排濕以保證煙葉滿足變黃期的排濕要求，此類變黃方式有利于煙葉中酚糖苷的裂解，促進了多酚類物質(zhì)的形成。2種變黃方式下的多酚類物質(zhì)含量均顯著高于其他處理，尤其是脅迫失水變黃處理。因此，烘烤變黃階段適時排濕，有利于減少綠原酸和蕓香苷的損失。

變黃方式的不同造成了烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分、酚類物質(zhì)、致香物質(zhì)、游離氨基酸和有機酸間的差異，進而影響煙葉的品質(zhì)。周平等[33]研究發(fā)現(xiàn)，變黃階段對烤煙常規(guī)化學(xué)成分和致香物質(zhì)的貢獻率較大，分別達56%、52%。馬一瓊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)化學(xué)成分對感官品質(zhì)的貢獻率最大，其中的煙堿對感官因子的貢獻率為53.62%，這與本研究中PLS-DA 模型下變量投影重要性排序煙堿為首位的結(jié)果一致。本研究中，綠原酸和鉀以較高的貢獻權(quán)重作為不同變黃方式的標(biāo)志性化合物，與許自成等[34]的研究結(jié)果相符，而脯氨酸作為第二貢獻權(quán)重值成分以區(qū)分變黃方式的不同，這與脯氨酸與感官評吸和外觀質(zhì)量直接相關(guān)的研究結(jié)果[26-28，35]一致。