蝮蛇咬傷患者程序性死亡因子-1和T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

姚洪鋒 呂彩萍 郭瑜佳 陳文泱 駱方軍 何玉領(lǐng)

我國每年蛇咬傷患者10～30萬人次，有較高的致殘率及致死性［1］。本地區(qū)地理環(huán)境適宜蛇類生長，尤以蝮蛇居多，每年發(fā)生蛇咬傷患者較多。蝮蛇咬傷后主要是蛇毒毒素或酶激活炎癥細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)并引起過度炎癥反應(yīng)，引起機(jī)體損傷，炎癥因子C反應(yīng)蛋白（CRP）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）等明顯升高［2］。過度的炎癥反應(yīng)引起機(jī)體生理、病理變化的同時(shí)，也影響機(jī)體的免疫平衡。目前關(guān)于蝮蛇咬傷患者免疫狀態(tài)變化及相應(yīng)機(jī)制的報(bào)道較少，但在類似的中毒反應(yīng)時(shí)可見淋巴細(xì)胞功能異常［3］。程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）作為免疫調(diào)控抑制因子，在感染、炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用［4］。但在蝮蛇咬傷患者中PD-1的表達(dá)及與嚴(yán)重程度變化尚不清楚，本文探討蝮蛇咬傷患者T淋巴細(xì)胞亞群、PD-1的表達(dá)變化及在評估病情嚴(yán)重程度與預(yù)后中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年3月至2019年8月本院蝮蛇咬傷患者106例，根據(jù)《2018年中國蛇傷救治專家共識》［5］蛇咬傷嚴(yán)重度評分表分為輕度蝮蛇咬傷組75例與中、重度蝮蛇咬傷組31例；其中中、重度組中有23例患者經(jīng)治療康復(fù)后14 d隨訪復(fù)查。另選取同期本院體檢中心健康體檢者30例作為健康對照組。三組受試者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《2018年中國蛇傷救治專家共識》診斷標(biāo)準(zhǔn)，明確為蝮蛇咬傷，常規(guī)予以清創(chuàng)局封、季德勝蛇藥及抗蝮蛇毒血清治療；②在蛇咬傷后12 h內(nèi)入院；③未在外院就診，包括使用抗蛇毒血清等。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①有自身免疫性疾病、細(xì)菌性感染、病毒性感染及其它可引起炎癥的基礎(chǔ)疾??；②合并有多器官功能障礙、昏迷、嚴(yán)重心、肝、腎、血液等系統(tǒng)疾病以及精神疾病。本項(xiàng)目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）標(biāo)本采集：蝮蛇咬傷患者于入院時(shí)直接采集2支2 mL EDTA抗凝血，其中1支立即3,500 r/min，離心10 min分離血漿并保存于-70℃冰箱內(nèi)，用于CRP、SAA、IL-6、IL-10、TNF-α檢測；另1支EDTA抗凝血立即完成T淋巴細(xì)胞亞群與PD-1分析。隨訪患者于隨訪當(dāng)日空腹采集2支2 mL EDTA抗凝血。（2）血清CRP、淀粉樣蛋白A（SAA）檢測：均采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測，根據(jù)試劑說明書要求設(shè)置檢測參數(shù)；儀器為日立7600全自動(dòng)生化分析儀，試劑：SAA為浙江愛康生物科技有限公司；CRP為安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司。（2）IL-10、IL-6、TNF-α：采用流式熒光法檢測，按試劑說明書要求檢測，儀器為BD Canto II，使用Diva軟件進(jìn)行結(jié)果分析。試劑：江西諾德醫(yī)療器械有限公司的人Th1/Th2亞群檢測試劑盒。（4）CD3+、CD4+、CD8+：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，儀器：BD Canto II，試劑：BD 貨號。將全血50μL和抗體試劑20μL加入到BD管中，混勻后室溫靜置孵育15 min，加入500μL溶血?jiǎng)?，震蕩混勻后靜置5 min，上機(jī)檢測。使用BD Canto軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析。（5）PD-1檢測：將獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液以1×106/μL分裝于試管中，在單克隆抗體（20μL）和熒光素的共同作用下室溫培養(yǎng)20 min。檢測T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+細(xì)胞上CD279+表達(dá)量即為PD-1水平。所使用的CD3/CD4/CD8/CD279熒光單克隆抗體及其同型對照均購自美國BD Biosciences公司。加入500μL溶血?jiǎng)?，震蕩混勻并靜置5min，然后，細(xì)胞在1,500 r/min下離心5 min，用美國BD公司的 FACS CantoII流式細(xì)胞儀分析，BD FACS Diva 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蝮蛇咬傷患者一般資料 見表1。

表1 蝮蛇咬傷患者一般資料

2.2 炎癥因子、T淋巴細(xì)胞亞群及PD-1結(jié)果分析 見表2、圖1。

表2 蝮蛇咬傷患者免疫功能分析（±s）

表2 蝮蛇咬傷患者免疫功能分析（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與輕度組比較，#P＜0.05

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2.3 各指標(biāo)水平與蝮蛇咬傷患者SSS評分的相關(guān)性 CD4+/CD8+比值與蝮蛇咬傷嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，CRP、SAA、IL-6、TNF-α、IL-10、CD4+PD-1+均 與蝮蛇咬傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 各指標(biāo)水平與腹蛇咬傷SSS評分相關(guān)性分析

3 討論

蝮蛇咬傷，主要表現(xiàn)為皮下出血、瘀斑，咬傷部位腫脹、疼痛，造成細(xì)胞破壞、組織壞死，肢體殘廢，嚴(yán)重者出現(xiàn)心功能不全、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）甚至多器官功能障礙綜合征（MODS）［6］。其中IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子釋放增加，且可用于臨床嚴(yán)重程度及療效評估［7］，這與本資料結(jié)果一致。SANTHOSH等［8］發(fā)現(xiàn)通過毒蛇毒液誘導(dǎo)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，IL-6、TNF-α水平均升高，同時(shí)，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)；在藏紅花預(yù)處理后的實(shí)驗(yàn)組中，可見IL-6、TNF-α水平降低，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)減弱。

在正常生理?xiàng)l件下，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比例處于動(dòng)態(tài)平衡，而在外界刺激下，CD4+/CD8+的平衡被打破，導(dǎo)致機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境紊亂。本資料結(jié)果顯示，蝮蛇咬傷患者CD4+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低，CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)升高，且 CD4+/CD8+比值與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，這可能是蝮蛇蛇毒毒素引起T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)失衡，進(jìn)一步引起機(jī)體的免疫狀況和炎癥的進(jìn)展。周克兵等［9］發(fā)現(xiàn)蛇咬傷后的炎癥變化與患者的免疫功能下降有關(guān)，當(dāng)重癥蝮蛇咬傷患者經(jīng)烏司他丁治療后隨著癥狀的改善CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平逐漸升高，其中以CD4+T細(xì)胞尤為明顯，同時(shí)細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平明顯降低，這與本資料中觀察到的變化情況一致，提示在蝮蛇咬傷時(shí)隨著病情的好轉(zhuǎn)，T淋巴細(xì)胞免疫平衡逐漸恢復(fù)，炎癥減輕。類似的中毒引起淋巴細(xì)胞亞群變化的可見氯化氫氣體、甲胺磷農(nóng)藥中毒患者，CD4+表達(dá)量與中毒嚴(yán)重程度、炎癥反應(yīng)程度正相關(guān)，致使機(jī)體免疫功能紊亂。

在免疫調(diào)節(jié)過程中，PD-1同樣起重要作用。本資料顯示，CD4+PD-1+在中重度蝮蛇咬傷患者中呈高表達(dá)，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；經(jīng)治療后CD4+PD-1+表達(dá)明顯降低，同時(shí)炎癥因子水平明顯降低，CD4+T細(xì)胞表達(dá)明顯升高，可能為PD-1通過調(diào)節(jié)免疫平衡，抑制炎癥反應(yīng)。PD-1其主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等，且在活化的T淋巴細(xì)胞表面、樹突狀細(xì)胞（DC）和單核細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，具有調(diào)節(jié)活化和效應(yīng)期淋巴細(xì)胞的功能，在抗炎、抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用。HIRAHARA等［10］發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，疾病活動(dòng)度高的患者有更高的PD-1水平，且隨著治療好轉(zhuǎn)，PD-1水平逐漸降低，提示PD-1可作為SLE疾病活動(dòng)度的標(biāo)志物。在膿毒血癥患者外周血記憶性CD4+T淋巴細(xì)胞中存在高表達(dá)的PD-1水平，說明在炎癥過程中存在免疫抑制的現(xiàn)象［11］。韓輝等［12］發(fā)現(xiàn)Grave's病患者外周血CD4+、CD8+細(xì)胞中PD-1表達(dá)升高，促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活性，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子水平升高，加速GD的發(fā)生和發(fā)展。在惡性膠質(zhì)瘤中，PD-L1表達(dá)上調(diào)，促使CD4+、CD8+T細(xì)胞增加，并加重了炎癥反應(yīng)［13］。賈煒煒等［14］在肝包蟲病合并HBV感染患者中證實(shí)了CD4+PD-1+的表達(dá)與肝功能損傷程度密切相關(guān)，說明PD-1對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)具有重要意義。在SIV病毒感染的動(dòng)物模型中，促炎細(xì)胞因子TNF-α，IL-6顯著增加，PD-1在肺泡巨噬細(xì)胞（AM）上表達(dá)明顯增加，并與血漿病毒載量有明顯的相關(guān)性，表明PD-1表達(dá)通過調(diào)節(jié)AM的功能活性，參與疾病進(jìn)展［15］。

綜上所述，蝮蛇咬傷后機(jī)體存在T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)失衡并伴有細(xì)胞因子分泌紊亂，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。PD-1表達(dá)與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，提示PD-1可能參與蝮蛇咬傷后機(jī)體免疫功能變化，這可為蝮蛇咬傷患者的進(jìn)一步診治提供了新的思路。