郭 娜，方文清，楊 斌

（1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350003；2.邵武市南武夷中藥材種植專業(yè)合作社，福建 邵武 350000）

黃精素有“長(zhǎng)壽百歲仙草”之稱，是國(guó)家衛(wèi)健委公布的藥食同源中藥材之一，也是我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥材，用于滋補(bǔ)強(qiáng)身和治療腎虛精虧、肺虛燥咳以及脾胃虛弱之癥已有很長(zhǎng)歷史，是中醫(yī)常用藥物之一［1-2］。據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定可作為中藥黃精使用的僅有滇黃精（Polygonatumkingianum）黃精（Polygo?natumsibiricum）和多花黃精（Polygonatumcyrtone?ma）3種植物的干燥根莖，分別習(xí)稱為“大黃精”、“雞頭黃精”和“姜形黃精”。其中，多花黃精品種為公認(rèn)的“品質(zhì)最佳品種”。

福建省作為多花黃精野生資源的主產(chǎn)地之一，其人工栽培主要集中在福建北部的南平地區(qū)。筆者在調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)多花黃精在人工種植過(guò)程中普遍存在：傳統(tǒng)栽培品種單一、產(chǎn)量低、周期長(zhǎng)、品質(zhì)退化嚴(yán)重等情況。而且多花黃精的無(wú)性繁殖系數(shù)也較低，主要原因在于多花黃精前端3～4節(jié)進(jìn)行發(fā)芽能力很強(qiáng)，所生成的植株較為旺盛，但尾部的節(jié)卻很難進(jìn)行發(fā)芽處理，即使發(fā)芽成功，生長(zhǎng)質(zhì)量也會(huì)受到影響［3］。因此，多花黃精在栽培上急需高品質(zhì)的新品種進(jìn)行更新，以增加種植效益。為此，本研究開(kāi)展了多花黃精優(yōu)良種源（產(chǎn)地）——優(yōu)良單株二層次聯(lián)合選種及無(wú)性快繁技術(shù)研究，初步篩選出多花黃精新品系，以推動(dòng)閩北區(qū)域多花黃精產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 試驗(yàn)地概況

多花黃精良種選育試驗(yàn)基地位于邵武市南武夷藥博園。2019年邵武市憑借良好的中藥材產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)，被國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定為第二批國(guó)家中藥材（多花黃精）區(qū)域性良種繁育基地。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

多花黃精的種質(zhì)資源活株：分別從福建省南平地區(qū)的邵武、延平、順昌、建甌、松溪、光澤、浦城、建陽(yáng)、武夷山、政和10個(gè)縣市共遷地保護(hù)黃精種質(zhì)資源176份。

樣品的前處理：將不同產(chǎn)地的多花黃精分別編號(hào)并做好標(biāo)記，然后用自來(lái)水進(jìn)行清洗，去除泥土及雜質(zhì)，然后放到電熱恒溫箱鼓風(fēng)干燥箱，在50℃以下干燥一天。取出切成2～3 cm，再用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)65目篩，裝入密封袋，貼上產(chǎn)地標(biāo)簽備用。

2.2 試劑及溶液

無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、磷酸，均為分析純，西隴化工股份有限公司；乙腈，色譜純，美國(guó)新天地公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。0.1%磷酸的配制：用移液槍移取1.17 mL磷酸于燒杯中，加入純凈水，稀釋后配制至1 000 mL的燒杯，并轉(zhuǎn)移到1 000 mL容量瓶定容。然后放入超聲清洗機(jī)超聲20 min，過(guò)0.45μm濾膜備用。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 技術(shù)路線

閩北區(qū)域多花黃精種群生態(tài)學(xué)調(diào)查→種質(zhì)資源圃選址→種質(zhì)資源收集及種質(zhì)資源圃建設(shè)→優(yōu)良種源地種質(zhì)篩選→良種選育試驗(yàn)基地建設(shè)與管理→黃精多糖類化學(xué)成分指紋圖譜構(gòu)建→優(yōu)良單株初步篩選→制定種苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)→良種繁育體系建立→良種示范與推廣。

2.3.2 黃精多糖類化學(xué)成分指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)方法

多花黃精產(chǎn)品質(zhì)量是種苗篩選研究的核心，而黃精多糖含量是多花黃精根莖的重要有效藥用成分，也是衡量其藥材質(zhì)量的主要指標(biāo)之一［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明了黃精的活性成分主要為黃精多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎抗菌、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫、改善記憶力等功能［5-11］。因此，項(xiàng)目采用現(xiàn)代分析技術(shù)進(jìn)行其指標(biāo)成分檢測(cè)，采用超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)進(jìn)行高效提取分離，以高效液相色譜——離子阱質(zhì)譜離線聯(lián)用模式，對(duì)比種苗試驗(yàn)基地的多花黃精對(duì)照品種的成分分析結(jié)果，開(kāi)展多花黃精HPLC-MS、HPLC特征指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 建立了3個(gè)多花黃精種群生態(tài)信息監(jiān)測(cè)點(diǎn)，2個(gè)種質(zhì)資源圃及其信息數(shù)據(jù)庫(kù)

根據(jù)多花黃精品種選育技術(shù)路線，項(xiàng)目組在南武夷藥博園內(nèi)建立了多花黃精生態(tài)信息監(jiān)測(cè)點(diǎn)3個(gè)，種質(zhì)資源圃2個(gè)（占地面積30畝），分別對(duì)不同縣市產(chǎn)地的多花黃精品種的主要生物學(xué)性狀進(jìn)行跟蹤系統(tǒng)觀測(cè)，進(jìn)行了光、溫度、水、土壤等因子對(duì)多花黃精的生態(tài)作用及適應(yīng)的研究。同時(shí)，建立了與種質(zhì)資源圃相匹配的“武夷山脈多花黃精種質(zhì)資源信息數(shù)據(jù)庫(kù)”，分別從形態(tài)、產(chǎn)量、品質(zhì)、適應(yīng)性及繁殖特性等方面開(kāi)展種質(zhì)評(píng)價(jià)，初步建成閩北區(qū)域多花黃精種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)。

3.2 不同產(chǎn)地HPLC指紋圖譜檢測(cè)

項(xiàng)目組在10個(gè)縣市所收集到的176份多花黃精種質(zhì)資源中，以其生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)為主要參考值，選擇出閩北區(qū)域8個(gè)不同縣市產(chǎn)地的多花黃精，具體產(chǎn)地為：邵武市南武夷藥博園、邵武市金杭、政和縣外屯、武夷山市上梅、浦城縣富嶺、松溪縣花橋、順昌縣洋口、光澤縣司前，分別為圖1的A、B、C、D、E、F、G、H。

為了進(jìn)一步確認(rèn)HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，分別對(duì)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。即制取了8份等質(zhì)量的樣品，分別測(cè)定這8份多花黃精供試品溶液10號(hào)峰的峰面積，求它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。綜合圖1、表1可見(jiàn)，10號(hào)峰較為穩(wěn)定，峰值為1，RSD為0，分離效果最好。故選擇第10個(gè)峰號(hào)作為良種篩選中多花黃精遺傳穩(wěn)定性指標(biāo)的參照峰。

為提高數(shù)據(jù)的科學(xué)性，項(xiàng)目組對(duì)圖1、表1的數(shù)據(jù)做了6次重復(fù)測(cè)試。其重現(xiàn)性情況見(jiàn)表2。由表2可知，重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD=0.69%（n=6），表明此樣品的重現(xiàn)性良好。其穩(wěn)定性情況見(jiàn)表3。由表3可知，穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD=0.55%（n=6），表明制備好的多花黃精供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 八批多花黃精的相對(duì)保留時(shí)間指紋圖譜數(shù)據(jù)Tab.1 Relative retention timefingerprint data of eight batches of P.cyrtonema

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果一覽表Tab.2 The list of reproducibility test results

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果一覽表Tab.3 The list of stability test results

圖1 八批不同產(chǎn)地的多花黃精的高效液相指紋圖譜Fig.1 HPLCfingerprints of P.cyrtonema from eight batches of different producing areas

同時(shí)為了證明該方法的可行性，對(duì)儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性等都進(jìn)行檢驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)中的精密性試驗(yàn)的RSD=0.40%（n=6），重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD=0.69%（n=6），穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD=0.55%（n=6），即表明制備好的多花黃精供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 優(yōu)良單株篩選

項(xiàng)目組對(duì)這8個(gè)種質(zhì)資源再次進(jìn)行相對(duì)峰面積指紋圖譜測(cè)試，如表4八批多花黃精的相對(duì)峰面積指紋圖譜數(shù)據(jù)所示。從表4可以看出，在8個(gè)產(chǎn)地中，B產(chǎn)地峰號(hào)0.940 1，C產(chǎn)地峰號(hào)0.933 5，H產(chǎn)地峰號(hào)0.834 5，與第10個(gè)峰號(hào)（參照峰）最為接近，8個(gè)產(chǎn)地中的B產(chǎn)地（邵武市金杭）、C產(chǎn)地（政和縣外屯）、H產(chǎn)地（光澤縣司前）三個(gè)產(chǎn)地的多花黃精遺傳穩(wěn)定性等指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定。經(jīng)初篩完成后，該三個(gè)產(chǎn)地的品種轉(zhuǎn)入實(shí)地栽培，進(jìn)行產(chǎn)量及抗逆性等指標(biāo)實(shí)驗(yàn)。

表4 八批多花黃精的相對(duì)峰面積指紋圖譜數(shù)據(jù)Tab.4 The relative peak area fingerprint data of eight batches of P.cyrtonema

項(xiàng)目組建立栽培對(duì)比實(shí)驗(yàn)基地，從2017年2月至2020年10月，對(duì)B產(chǎn)地（邵武市金杭）、C產(chǎn)地（政和縣外屯）、H產(chǎn)地（光澤縣司前）的3個(gè)多花黃精種質(zhì)資源多芽分蘗品系，開(kāi)展了為期三年栽培實(shí)驗(yàn)，主要對(duì)該三個(gè)品系的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)量、黃精多糖含量、病蟲害狀況、抗逆性等指標(biāo)進(jìn)行跟蹤測(cè)試，于2020年10月20日進(jìn)行測(cè)產(chǎn)，測(cè)產(chǎn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

表5 三個(gè)產(chǎn)地測(cè)產(chǎn)數(shù)據(jù)Tab.5 The production measurement data of three producing areas

項(xiàng)目組對(duì)B產(chǎn)地，C產(chǎn)地和H產(chǎn)地3個(gè)多花黃精種質(zhì)資源多芽分蘗品系，分別進(jìn)行了產(chǎn)量、抗逆性，遺傳穩(wěn)定性等指標(biāo)試驗(yàn)情況開(kāi)展數(shù)據(jù)匯合、綜合分析與評(píng)價(jià)，最終篩選出1個(gè)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的多芽分蘗多花黃精品系，即B場(chǎng)地（邵武市金坑）多花黃精種質(zhì)資源分蘗培育的品系，暫命名：武夷山1號(hào)多花黃精。并制定了《福建北部多花黃精多芽分蘗品系種苗繁育技術(shù)操作規(guī)程（SOP）》。

4 討論

本研究為了選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的多花黃精種苗，建立了種群生態(tài)信息監(jiān)測(cè)點(diǎn)3個(gè)，種質(zhì)資源圃2個(gè)，為研究多花黃精的生態(tài)適應(yīng)性、種苗篩選、繁育、抗逆性和遺傳穩(wěn)定性分析、種植基地建設(shè)等提供了科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，本研究在開(kāi)展黃精HPLC-MS、HPLC特征指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)新方法研究過(guò)程中，為了進(jìn)一步確認(rèn)HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、科學(xué)性，分別對(duì)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證，而且還對(duì)儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性等都進(jìn)行檢驗(yàn)，故該指紋圖譜較為完善，為人工栽培多花黃精提供重要的產(chǎn)品質(zhì)量控制保障，也為從多花黃精種質(zhì)資源圃中篩選出黃精多糖含量高、品質(zhì)較好的種質(zhì)資源提供有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，也為多花黃精的醫(yī)藥使用及質(zhì)量考察提供更為可靠的參考。

該研究采用了多芽型天然變異株系統(tǒng)選擇純化等方法，從10個(gè)縣市所收集到的176份多花黃精種質(zhì)資源中，以“品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性”為主要考核指標(biāo)，成功培育出了多花黃精“一株多芽”型優(yōu)良新品系1個(gè)，其主要表現(xiàn)為芽頭多（從“單株生長(zhǎng)”轉(zhuǎn)變?yōu)椤皡矤钌L(zhǎng)”）、產(chǎn)量高（為“一株單芽”品種的11.4倍）、品質(zhì)優(yōu)（黃精多糖含量達(dá)17.7%，遠(yuǎn)高于《藥典》規(guī)定的“不得低于7%”標(biāo)準(zhǔn)）、抗逆性強(qiáng)，并配套建立配套的良種繁育技術(shù)體系和生態(tài)栽培技術(shù)體系，具有巨大的推廣應(yīng)用價(jià)值。