任 可， 姚傳福， 孫 柳， 吳 悠， 劉 煜，王 惠， 徐新萍， 周紅梅 ， 趙 黎， 趙小軍， 彭瑞云，

(1.河北大學 教育學院， 保定 071000；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 輻射醫(yī)學研究所， 北京 100850)

0 引言

隨著我國科技的不斷突破與發(fā)展,微波技術廣泛應用于雷達導航和生物醫(yī)療等領域。無線通信與5G網絡的出現(xiàn)和普及，也使微波廣泛應用于日常生活中，為人們提供便利[1]。但與此同時，微波輻射已經成為繼空氣、水和噪聲污染之后的第四大污染源，隨之而來的健康危害備受關注[2]。以往研究發(fā)現(xiàn)，微波輻射環(huán)境暴露可導致機體神經系統(tǒng)障礙，并出現(xiàn)學習和記憶減退等損傷表現(xiàn)[3]。海馬組織是微波輻射致腦損傷的敏感部位，海馬組織結構與認知功能發(fā)揮密切相關[3-4]。學習與記憶是認知功能的重要方面，由于腦認知功能的復雜性，其分類的角度與標準多種多樣。其中工作記憶在對外界信息編碼和存儲方面起到重要作用，它包括中央執(zhí)行系統(tǒng)、視空間模板和情景緩沖器等方面，與資源分配、策略轉換和認知靈活性相關[5]。識別記憶則是對新舊事物記憶的觸發(fā)與辨別的過程[6]。Morris水迷宮經典范式可用于評價嚙齒類動物空間記憶水平[7]，而水迷宮反轉實驗在經典范式基礎之上，用新平臺替代原有平臺位置，動物前期學習信息被更新，需要排除舊信息的干擾對新信息進行整合的過程，可用于更加精確評價動物空間工作記憶和認知靈活性水平[7-10]；新物體識別實驗則是利用動物對新異刺激的偏好來檢測識別記憶的神經行為學工具[11]；二者聯(lián)合分析可更加全面反映動物認知功能的多個方面。但目前，結合水迷宮經典范式及平臺反轉實驗與新物體識別實驗對大鼠空間學習記憶、工作記憶和識別記憶功能的影響鮮有報道。因此，本研究通過動物神經行為學實驗觀察微波輻射后大鼠空間學習、工作記憶與識別記憶功能的改變，并采用蘇木素伊紅組織染色觀察海馬結構的改變，為深入研究微波輻射致腦損傷特點和機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

二級雄性Wistar大鼠50只，體重(180±20)g，由北京市維通利華實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(京)2016-0006]。隨機分為假輻射組(Sham 組)和微波輻射組(MW組)，每組25只。按照12 h明/12 h暗飼養(yǎng)，每日光照時間為 9:00—21:00，實驗在10:00—18:00進行，大鼠可自由飲水進食。

1.2 微波輻射方法

采用軍事醫(yī)學研究院微波輻射系統(tǒng)進行大鼠全身均勻照射。該電磁屏蔽室內壁覆蓋錐形微波吸收器，以減少反射(圖1A)。輻射盒采用有機玻璃制成，圍繞中心旋轉對稱(圖1B)。微波輻射頻率為2.8 GHz,平均功率密度為 30 mW/cm2，輻射時間為15 min，SAR為21 W/kg。Sham組大鼠處理條件與MW組相同，但不予輻射。

1.3 大鼠空間和工作記憶能力檢測

采用水迷宮實驗系統(tǒng)(江蘇賽昂斯生物科技有限公司，中國)進行 Morris 水迷宮實驗。主要分三個階段：① 學習期。大鼠于輻射前訓練 3 天。將大鼠面向池壁分別從 4 個入水點放入水中，如果大鼠在 60 s內找到平臺，讓其在平臺上停留 15 s。如果 60 s內未找到平臺，由實驗者將其引至平臺，學習15 s。② 定位航行實驗。于輻射后6 h、1～4 d連續(xù) 5 d進行空間定位航行實驗。從池壁隨機入水點將大鼠放入水中，記錄大鼠找到平臺所用的時間，即平均逃避潛伏期(average escape latency，AEL)以及大鼠找到平臺的總路程，即平均逃避路程。③ 空間探索實驗：于輻射后第5天撤去平臺，記錄大鼠在 60 s內穿越原平臺的次數(shù)及原平臺所在象限時間和路程占比。以AEL和路程反映大鼠學習能力與空間記憶能力水平。以穿越原平臺的次數(shù)及原平臺所在象限時間和路程占比反映大鼠維持空間記憶的能力。

在第5～10天將平臺轉移到對側象限，進行Morris水迷宮反轉實驗。實驗包括定位航行反轉實驗和空間探索反轉實驗，實驗過程同前，分別記錄AEL、穿越原平臺的次數(shù)及原平臺所在象限時間、路程占比。以AEL、穿越平臺的次數(shù)及原平臺所在象限時間、路程占比反映大鼠空間和工作記憶水平。

1.4 大鼠識別記憶能力檢測

采用新物體識別實驗系統(tǒng)(江蘇賽昂斯生物科技有限公司，中國)進行新物體識別實驗。主要分三個階段：① 適應期：于輻射后1 d，將大鼠從敞箱壁一角放入，適應10 min，實驗過程不設置物體。② 學習期：于輻射后2 d在敞箱中放入兩個相同圓柱體，將大鼠從敞箱一角背朝物體放入，記錄10 min內大鼠探索兩個圓柱體的時間。③ 測試期：測試期1在學習期結束 1 h后進行，在敞箱中放入物體，其中一個圓柱體被替換為尺寸相當?shù)男挛矬w(圓錐)，另一個物體為圓柱不變。每只大鼠被單獨放入自由探索 5 min，并用攝像機跟蹤記錄大鼠探索圓柱體和圓錐體的時間，以大鼠鼻子或嘴巴接觸物體或距物體≤2 cm為有效。測試期2在學習期結束 24 h后進行，敞箱中新物體被替換為另一個的新物體(長方體)，另一個物體為圓柱不變。每只大鼠實驗結束后均以75%的酒精擦拭敞箱底部，防止氣味殘留干擾。以辨別指數(shù)(identify index，DI)反映大鼠對新舊物體的識別記憶能力，F(xiàn)為探索熟悉物體的時間，N為探索新物體的時間，計算公式為：DI=N/(N+F)×100%。

1.5 大鼠海馬組織結構觀察

于輻射后3 d和7 d，取出兩組大鼠腦組織浸入10%福爾馬林溶液固定7 d，將大鼠腦組織取材后進行脫水、透明、浸蠟和包埋，制備3 μm組織切片，并采用蘇木素伊紅法進行組織染色，中性樹膠封片，采用光學顯微鏡(Leica，德國)觀察并拍照記錄。

1.6 統(tǒng)計學處理

本研究數(shù)據(jù)使用Excel錄入，采用 SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用(M±SD)表示。采用重復測量方差分析、獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 大鼠空間學習記憶與工作記憶的變化

Morris水迷宮定位航行實驗中大鼠運動軌跡顯示，Sham組大鼠游泳路線軌跡呈直線式與趨向式，由四周向目標區(qū)域探索。MW組大鼠游泳軌跡路線呈現(xiàn)邊緣式，部分有集中目標象限的趨勢(圖2A)。同時，Sham組AEL隨著學習時間增加有縮短趨勢(F=1.808，P>0. 05)，MW組AEL隨著學習時間增加有縮短趨勢(F=1.790，P>0. 05)，兩組之間無顯著差異。與Sham組相比，MW組大鼠于輻射后6 h、1～4 d 內AEL(F=0.018，P>0.05)與平均逃避距離均無顯著差異(F=0.014，P>0.05)(圖2B和2C)。

空間探索實驗中大鼠運動軌跡顯示，Sham組大鼠游泳路線多集中于平臺象限周圍，游泳軌跡呈直線式，MW組大鼠游泳軌跡路線反復畫圈，多呈現(xiàn)隨機式，沒有集中目標象限的趨勢(圖3A)。輻射后5 d，與Sham組相比，MW組大鼠在原平臺所在象限停留時間占比上顯著降低(t=2.365，P=0.026<0.05)，但MW組大鼠穿越平臺次數(shù)(t=1.238，P>0.05)與原平臺所在象限游泳路程占比無顯著差異(t=1.541，P>0.05)(圖3B、3C和3D)。

圖3 微波輻射后大鼠空間記憶的維持能力(Morris水迷宮空間探索)A.大鼠游泳軌跡；B.穿越平臺次數(shù)(Platform crossing times)；C.平臺象限時間占比(The proportion of time in the quadrant of the platform)；D.平臺象限路程占比(The proportion of distance in the quadrant of the platform) *P<0.05

Morris水迷宮定位航行反轉實驗中大鼠運動軌跡顯示，Sham組大鼠入水后，受前期平臺位置影響游泳路線趨向前期目標區(qū)域，但在下個入水點更快地找到新平臺位置。MW組大鼠游泳軌跡路線呈現(xiàn)直線式與隨機式搜索，較少受前期目標平臺信息的干擾(圖4A)。于反轉平臺后1～5 d，與Sham組相比，MW組大鼠AEL(F=0.138，P>0.05)與平均逃避距離(F=0.05，P>0.05)均無顯著差異(圖4)。

在空間探索反轉實驗中大鼠運動軌跡顯示，Sham組大鼠入水后，游泳路線多集中于舊平臺象限周圍，經過新平臺象限路線較少，MW組大鼠游泳軌跡路線呈現(xiàn)隨機式，但穿越新平臺次數(shù)較多(圖5A)。于反轉平臺后6 d，與Sham組相比，MW組大鼠穿越平臺的次數(shù)(t=-1.895，P>0.05)、原平臺所在象限停留時間(t=-1.037，P>0.05)和原平臺所在象限路程占比均無顯著差異(t=-0.831，P>0.05，圖5B、5C和5D)。

圖4 微波輻射后大鼠空間工作記憶的變化(Morris水迷宮定位航行反轉實驗)A.大鼠游泳軌跡；B.平均逃避潛伏期(AEL)；C.平均逃避路程(Distance)

圖5 微波輻射后大鼠空間工作記憶的變化(Morris水迷宮空間探索反轉實驗)A.大鼠游泳軌跡；B.穿越平臺次數(shù)(Platform crossing times)；C.平臺象限時間占比(The proportion of time in the quadrant of the platform)；D.平臺象限路程占比(The proportion of distance in the quadrant of the platform)

2.2 大鼠識別記憶的變化

新物體識別實驗運動熱圖顯示，在熟悉期，兩組大鼠探索新舊物體的時間基本一致；在熟悉期后1 h和24 h，Sham組表現(xiàn)出更多探索新物體行為，MW組表現(xiàn)出偏好熟悉物體的行為(圖6)。

圖6 新物體識別實驗大鼠軌跡熱圖A. 熟悉期大鼠軌跡；B. 測試期Ⅰ大鼠軌跡；C. 測試期Ⅱ大鼠軌跡

新物體識別實驗結果顯示，兩組大鼠在總移動距離、平均速度和總探索時間上均無顯著差異(P>0.05)，提示兩組大鼠具有相同探索水平。輻射后1 h，與Sham組相比，MW組大鼠辨別指數(shù)顯著降低(t=2.117，P<0.05)。輻射后24 h，與Sham組相比，MW組大鼠辨別指數(shù)呈降低趨勢，但無顯著差異(t=1.999，P>0.05)(圖7)。

圖7 微波輻射后大鼠識別記憶的變化(新物體識別實驗)A.大鼠移動距離(Total Distance)；B.平均速度(Mean speed)；C.兩物體總探索時間(Total object exploration)；D.辨別指數(shù)(Recognition index)*P<0.05

2.3 大鼠海馬組織結構的變化

輻射后3 d，Sham組大鼠海馬組織齒狀回區(qū)呈正常結構，表現(xiàn)為神經元排列整齊，核淡染，胞質均勻(圖8)。MW組大鼠海馬組織齒狀回區(qū)結構損傷，主要表現(xiàn)為神經元核固縮、深染，呈梭形；以輻射后3 d損傷嚴重，輻射后7 d損傷呈恢復趨勢(圖8)。

圖8 微波輻射后大鼠海馬組織結構的變化A. 輻射后3 d Sham組(左圖: Scale bar=50 μm，右圖：Scale bar=20 μm)；B. 輻射后3 d MW組(左圖: Scale bar=50 μm，右圖：Scale bar=20 μm)；C. 輻射后7 d Sham組(左圖: Scale bar=50 μm，右圖：Scale bar=20 μm)；D. 輻射后7 d MW組(左圖: Scale bar=50 μm, 右圖：Scale bar=20 μm)

3 討論

微波輻射是300 MHz～300 GHz之間的電磁波，其在人們工作和生活各領域的應用越來越廣泛[12]。其中，2～4 GHz的微波頻段，常應用于WiFi、藍牙等通信、醫(yī)療及工業(yè)中，微波暴露職業(yè)人群與普通人群常處于該波段微波輻射環(huán)境中。微波對人體產生的健康危害受到學者和廣大群眾關注。腦是微波輻射損傷的敏感靶點，流行病調查和實驗室研究均發(fā)現(xiàn)，微波輻射可造成機體認知障礙[13-14]。國際上的電磁場暴露限制標準存在差異，仍需根據(jù)現(xiàn)實復雜情況不斷更新[15]。另外，由于現(xiàn)代社會的發(fā)展，非電離電磁場的環(huán)境暴露水平也不斷上升。因此，結合現(xiàn)狀與本課題組以往研究，本研究采用30 mW/cm2的2.8 GHz微波輻射進行實驗，以適應不斷增加的環(huán)境暴露。目前，針對該頻段微波輻射造成的大鼠空間工作記憶、識別記憶變化及其組織結構基礎的研究尚未見報道。

動物神經行為學實驗是明確動物認知、決策等神經系統(tǒng)功能的重要實驗范式，可揭示在各種因素作用下機體認知行為功能的影響。其中Morris 水迷宮和新物體識別是最為常用的兩種。Morris水迷宮實驗是檢測嚙齒類動物認知功能的經典實驗，被廣泛應用于評價空間記憶水平[7]；而反轉實驗將不可見平臺位置改變增加了大鼠尋找平臺的難度，此時舊平臺信息被更新，需要排除舊平臺信息的干擾，將新舊信息整合后做出判斷，認知過程更為復雜，可用于檢測大鼠空間工作記憶能力。新物體識別是評價動物非空間記憶水平的常用行為學實驗。通過設置新舊物體，比較舊刺激與當前新刺激的差異來檢測動物的情景識別記憶。二者各自側重不同記憶類型，又共同揭示了對記憶功能的不同影響。

現(xiàn)有研究主要采用 Morris 水迷宮行為學實驗研究一定強度微波輻射對動物學習和記憶功能的影響，但研究結果存在差異。有研究發(fā)現(xiàn)，微波輻射后動物學習和記憶能力障礙，主要表現(xiàn)為輻射后動物在水迷宮定位航行實驗中AEL增加，在空間探索實驗中原平臺所在象限時間路程百分比減少等[16-18]。但另有研究發(fā)現(xiàn)，微波輻射未對動物學習和記憶能力造成影響，輻射后實驗動物在記憶行為上無顯著性變化[19-21]。此外，尚未見結合水迷宮的延伸-反轉實驗研究微波輻射對工作記憶的影響。為此，本研究采用水迷宮經典范式與平臺反轉實驗研究微波輻射對大鼠空間記憶與工作記憶功能的影響特征。結果發(fā)現(xiàn)，隨著訓練時間增加，兩組大鼠的AEL均有降低趨勢，表明大鼠具有一定的學習能力；于輻射后6 h至4 d，在水迷宮定位航行階段，兩組大鼠AEL與平均逃避路程均無顯著差異，提示大鼠的空間學習記憶能力暫無明顯改變。水迷宮空間探索實驗可以排除一些隨機繞圈等非空間記憶策略完成任務的因素，在定位航行階段結束后24 h進行，可反映大鼠的長時記憶功能，并確保大鼠采用空間策略解決迷宮問題。本研究發(fā)現(xiàn)，于輻射后5 d，大鼠在原平臺所在象限停留時間占比上顯著降低，提示30 mW/cm2微波暴露可導致大鼠空間記憶維持能力下降。本研究于輻射后6 d至10 d進行水迷宮反轉實驗，結果發(fā)現(xiàn)，大鼠AEL、平均逃避路程和穿越平臺的次數(shù)與原平臺所在象限停留時間、路程占比均無明顯改變。表明30 mW/cm2微波輻射對大鼠空間工作記憶未造成明顯損傷，其原因可能與輻射組大鼠對舊平臺空間位置記憶模糊，相對于新平臺位置記憶干擾更小或與輻射后時間過長，微波損傷效應恢復等因素相關，未來研究可將平臺反轉時間相對提前，進一步研究微波對大鼠空間工作記憶的影響。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，在新物體識別實驗中，30 mW/cm2微波輻射后大鼠辨別指數(shù)顯著降低，表明輻射后大鼠更少表現(xiàn)出偏好新異刺激行為。提示30 mW/cm2微波暴露可導致大鼠識別記憶能力下降。

海馬體主要由海馬、齒狀回和下托組成，而齒狀回區(qū)位于海馬體中部，是神經信息傳遞的重要區(qū)域，海馬組織是機體完成學習記憶過程的結構基礎[22-23]。學習記憶功能障礙伴隨組織結構損傷[24]，目前海馬組織成為學習記憶功能的重要腦區(qū)。以往研究表明，微波暴露可導致海馬組織結構不同程度損傷[25-27]。本研究重點關注海馬組織結構變化，以明確其結構和功能的相關性。本研究發(fā)現(xiàn)，輻射后3 d，大鼠海馬組織損傷，主要表現(xiàn)為齒狀回區(qū)神經元核固縮、深染，呈梭形；輻射后7 d大鼠海馬組織齒狀回區(qū)呈恢復趨勢。這與本研究動物行為學結果相吻合，輻射后3 d大鼠AEL和平均逃避路程呈延長趨勢，輻射后7 d無明顯差異。提示30 mW/cm2的2.8 GHz微波暴露后可導致大鼠海馬組織齒狀回結構損傷。

綜上所述，30 mW/cm2的2.8 GHz微波輻射可引起大鼠空間記憶和識別記憶能力障礙，海馬組織特別是齒狀回區(qū)結構損傷是其致傷的結構基礎。微波輻射造成的海馬組織結構損傷和功能障礙的相關性機制仍待進一步探討。