趙美茜，白忠義，張祥輝，劉金亮，潘洪玉，張艷華

（吉林大學植物科學學院，長春 130062）

玉米ZeamaysL.是世界上最主要的糧食作物，在農業(yè)生產中起著重要的作用。玉米生產受到莖腐病的嚴重影響，莖腐病是最廣泛和最具破壞性的土傳病害之一[1]。莖腐病主要由幾種鐮孢菌引起，如禾谷鐮孢Fusariumgraminearum、輪枝鐮孢F.verticillioides和層出鐮孢F.proliferatum等[2-4]。其中，禾谷鐮孢是引起玉米莖腐病的主要病原體，而且它能產生多種真菌毒素，降低玉米品質[5-7]。在我國由玉米莖腐病造成的損失從5%到80%不等，因此，控制禾谷鐮孢引起的莖腐病具有重要意義[8,9]。

目前，玉米莖腐病的防治主要依賴于抗性品種和化學殺菌劑。然而高抗莖腐病的品種資源不足，選育抗莖腐病的玉米品種耗時費力[10,11]。化學防治方法存在成本高、環(huán)境污染、農殘殘留以及食品安全等問題[12]。因此，生物防治方法作為可持續(xù)發(fā)展的新興技術，研究日益深入。木霉和芽胞桿菌是目前用于防治玉米莖腐病最為廣泛的菌株[13-16]。

本研究從玉米根際土壤中分離獲得一株具有良好生防效果的細菌菌株CSR-2，該菌株對多種植物病原真菌均具有拮抗作用，影響禾谷鐮孢菌絲生長、菌絲形態(tài)及孢子萌發(fā)。將該菌株與玉米膜下滴灌水肥藥一體化技術進行聯(lián)用，對莖腐病防治效果顯著。通過第三代PacBio全基因組測序分析，并結合平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity，ANI）對生防菌株CSR-2的分類地位進行鑒定，為深入挖掘其生防潛力及次級代謝產物基因簇用于農業(yè)生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 禾谷鐮孢、稻瘟菌Magnaportheoryzae、灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum、玉米灰斑病菌Cercosporazeae-maydi、玉米小斑病菌Helminthosporiummaydis及立枯絲核菌Rhizoctoniasolani，均由本實驗室保存。

1.1.2 生防菌菌株 取玉米根際土壤，利用平板對峙法進行生防菌株的初篩、復篩，獲得對植物病原真菌具有拮抗作用的菌株CSR-2。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L；綠豆培養(yǎng)基：綠豆40 g/L，瓊脂粉20 g/L。以上培養(yǎng)基均121 ℃高溫滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 菌株CSR-2接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h后，用LB液體培養(yǎng)基將發(fā)酵液稀釋到OD600＝0.6。

1.2.2 病原菌分生孢子懸浮液制備 灰葡萄孢和玉米小斑病菌分別接種于PDA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5～7 d，在平板中加入5 mL無菌水沖洗，用三層無菌紗布過濾，利用無菌水將各孢子懸浮液稀釋至105CFU/mL，獲得灰葡萄孢和玉米小斑病菌分生孢子懸浮液。禾谷鐮孢接種于PDA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d，用打孔器取邊緣菌餅接種于50 mL綠豆培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)96 h，加無菌水稀釋至105CFU/mL，獲得禾谷鐮孢分生孢子懸浮液。

1.2.3 對菌絲生長的抑制能力測定 采用對峙培養(yǎng)法測定CSR-2發(fā)酵液對多種植物病原真菌的抑制活性。在直徑為9 cm的PDA平板中心接種直徑為8 mm活化的病原真菌（禾谷鐮孢、稻瘟菌、灰葡萄孢菌、核盤菌、玉米灰斑病菌、玉米小斑病菌及立枯絲核菌）菌餅。在距中心25 mm處放置面積為1 cm2無菌濾紙片，取10 μL菌株CSR-2發(fā)酵液接種于無菌濾紙片上，以僅接種病原真菌的PDA平板作為對照。通過計算抑菌率，評估菌株CSR-2發(fā)酵液的抑制活性，每個處理重復3次。抑菌率（%）＝（對照菌落半徑－處理菌落半徑）/對照菌落半徑×100。

1.2.4 對病原菌菌絲形態(tài)的影響 按照1.2.3的處理方法，將菌株CSR-2發(fā)酵液（OD600＝0.6）與病原菌共培養(yǎng)在 PDA平板上，在菌絲邊緣斜插入滅菌后的蓋玻片，待菌絲生長至蓋玻片上，在顯微鏡下觀察處理組與對照組病原菌菌絲形態(tài)。

1.2.5 對病原菌分生孢子萌發(fā)的抑制能力測定 將菌株CSR-2接種到20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。利用LB液體培養(yǎng)基將發(fā)酵液稀釋到OD600分別為0.15、0.3、0.6。取等體積的發(fā)酵液與禾谷鐮孢分生孢子懸浮液混合置于凹面載玻片上，每個濃度重復2次。從接種開始每隔1 h于光學顯微鏡下觀察（20×20），每個重復計數(shù)3個視野區(qū)域，每個視野區(qū)域觀察約50個孢子，統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù)量，計算各處理的孢子萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率（%）＝孢子萌發(fā)數(shù)量/視野內孢子數(shù)量×100。

1.2.6 菌株CSR-2對玉米莖腐病防治效果的田間試驗 試驗于2020年5月至10月在吉林省松原市乾安縣贊字鄉(xiāng)父子村水肥藥一體化試驗基地進行。試驗設置無藥劑處理的陰性對照（CK）、2%戊唑醇懸浮種衣劑包衣、生防菌CSR-2處理3個小區(qū)，每個小區(qū)50 m2，3個重復，共9個小區(qū)。將禾谷鐮孢接種到滅菌帶殼高梁培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)3 d，至菌絲長滿高梁粒表面。玉米田間播種時，同時播種3 g處理好的帶菌高梁粒，播種深度為4～5 cm。生防菌施用是借助水肥藥一體化裝置采用玉米膜下滴灌的方式，分別在播種前期、3葉期、8～10葉期3次進行，生防菌濃度為1.5×108CFU/mL，按照1 L/m2劑量施用。玉米莖腐病的田間防效采取棋盤式取樣，每個樣點調查 10株，統(tǒng)計病情指數(shù)和防治效果。病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.3 全基因組序列測定和分析

1.3.1 DNA提取、基因組測序及組裝 采用改進的 CTAB法從菌株 CSR-2中提取基因組 DNA，利用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）、Qubit dsDNA HS檢測試劑盒（Qubit 3.0熒光儀）和0.8%凝膠電泳檢測DNA質量。使用G-tubes（Covaris）將合格的基因組DNA片段化并進行末端修復，制備SMRTbell DNA文庫（片段大小為＞10 kb，采用Blue Pippin系統(tǒng)）。利用Qubit分析文庫質量，Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent，Santa Clara，CA，USA）估計片段平均大小。SMRT測序采用Pacific Biosciences Sequel II測序儀（Frasergen Bioinformatics Co.，Ltd，Wuhan，China）。利用Microassembly（smrtlink8）、HGAP4 及 Canu（v.1.6）重新組裝 PacBio reads，使用 pbalign（BLASR, v0.4.1）分析基因組覆蓋深度，利用Circos（v0.64）獲得菌株CSR-2的基因組圈圖[17-20]。

1.3.2 基因組的注釋及菌株鑒定 菌株CSR-2的全基因組用Glimmer（v3.02）注釋[21]。核糖體RNA基因用 RNAmmer（v1.2）鑒定，tRNA 基因用 tRNAscan-SE（v2.0）驗證。對 NR、SwissProt、COG、KEGG及GO進行BLAST全基因組搜索（e值閾值為1e-5），選擇得分最高的作為最后的注釋[21-23]。利用OAT（0.90）計算菌株CSR-2與其他菌株全基因組序列的平均核苷酸同源性（ANI），通過BLASTx對NR與NT數(shù)據(jù)庫進行比對鑒定菌株CSR-2。

2 結果與分析

2.1 菌株CSR-2抑菌活性

采用對峙培養(yǎng)法對從玉米根際土壤中分離到的菌株CSR-2進行抑菌活性分析結果顯示，菌株CSR-2對禾谷鐮孢、玉米小斑病菌、稻瘟菌、灰葡萄孢菌、核盤菌、玉米灰斑病菌以及立枯絲核菌均有明顯的抑制效果，形成明顯的抑菌帶，抑制率為60.6%～66.8%（圖1）。上述結果表明，生防菌CSR-2對多種植物病原真菌有較強的拮抗作用，顯著抑制病原菌菌絲生長，并具有一定的廣譜性。

圖1 菌株CSR-2對植物病原真菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of strain CSR-2 on plant pathogenic fungi

2.2 菌株CSR-2對病原真菌菌絲形態(tài)以及孢子萌發(fā)的影響

將菌株CSR-2發(fā)酵液分別與禾谷鐮孢、立枯絲核菌、玉米灰斑病菌共培養(yǎng)在PDA平板上，在顯微鏡下觀察病原菌的菌絲形態(tài)。結果表明，對照組3種病原菌的菌絲表面光滑，粗細一致，滲透性正常，內含物分布均勻。處理組禾谷鐮孢菌絲表面褶皺，粗細不均；處理組立枯絲核菌與玉米灰斑病菌菌絲出現(xiàn)內含物分布不均勻且外溢的現(xiàn)象，表明菌株CSR-2能夠破壞病原菌菌絲的結構，抑制菌絲的生長（圖2）。

圖2 菌株CSR-2對病原真菌菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effects of strain CSR-2 on mycelial morphology of plant pathogenic fungi

利用OD600＝0.15、0.3與0.6的菌株CSR-2發(fā)酵液處理禾谷鐮孢分生孢子懸浮液。結果顯示，對照組分生孢子在培養(yǎng)3 h時開始萌發(fā)，從其一端或兩端長出芽管，5 h后即可形成菌絲。而用菌株CSR-2發(fā)酵液（OD600＝0.6）處理的分生孢子表面皺縮，滲透性異常，5 h后分生孢子不能萌發(fā)形成菌絲。用OD600＝0.3發(fā)酵液處理3 h，分生孢子不能正常萌發(fā)，5 h后部分孢子開始形成芽管。發(fā)酵液濃度為OD600＝0.15時對分生孢子形態(tài)影響較小，3 h時多數(shù)孢子可以正常萌發(fā)（圖3）。

圖3 菌株CSR-2對禾谷鐮孢分生孢子萌發(fā)的影響（比例尺=10 μm）Fig.3 Effects of CSR-2 on conidial germination of F.graminearum（scale=10 μm）

菌株CSR-2發(fā)酵液對禾谷鐮孢分生孢子的影響結果表明，菌株CSR-2發(fā)酵液與禾谷鐮孢分生孢子處理4 h時，對照組分生孢子萌發(fā)率為84.31%，3個處理組（OD600＝0.15、0.3和0.6）分生孢子的萌發(fā)率分別為59.22%、8.33%及7.14%。隨著菌株CSR-2發(fā)酵液濃度增加，禾谷鐮孢分生孢子萌發(fā)率逐漸降低，推測菌株CSR-2產生的次生代謝產物能破壞禾谷鐮孢分生孢子的結構從而抑制孢子萌發(fā)（圖4）。

圖4 不同濃度的CSR-2對禾谷鐮孢分生孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Effects of different concentrations CSR-2 on the conidia germination of F.graminearum

2.3 菌株CSR-2田間試驗結果

在無藥劑處理的陰性對照組，玉米莖腐病的病情指數(shù)為78.9；2%戊唑醇懸浮種衣劑進行種子包衣的病情指數(shù)為38.9，防治效果為50.7%；生防菌CSR-2處理組病情指數(shù)為37.1，病害防治效果為52.3%，表明CSR-2可顯著降低玉米莖腐病的田間發(fā)病率（表1）。

表1 菌株CSR-2對玉米莖腐病的田間防治效果Table 1 Biocontrol effect of strain CSR-2 against maize stalk rot in field trials

2.4 菌株CSR-2全基因組測序結果

2.4.1 基因組測序與組裝 采用三代 PacBio測序技術進行CSR-2全基因組測序，共獲得198692條高質量的長片段，基因組測序深度為395.83 X，N50大小為9082 bp。采用Microbial Assembly、HGAP4軟件和Canu（v1.6）軟件對數(shù)據(jù)進行組裝結果表明，菌株CSR-2基因組由3202366 bp的單條環(huán)狀染色體組成，GC含量為 59.11%?；?GC含量、GC偏差、tRNA/rRNA、COG注釋、堿基修飾和限制性修飾系統(tǒng)相關酶等信息構建基因組圈圖，全基因組測序結果已登錄到GenBank，收錄號為CP081941（圖5）。

圖5 菌株CSR-2基因組圈圖Fig.5 Circular genome map of strain CSR-2

2.4.2 編碼基因的注釋及菌株鑒定 采用軟件Glimmer（v3.02）在菌株CSR-2中鑒定出3007個編碼基因，編碼基因總長為2837892 bp，平均長度為943.76 bp，編碼基因占全基因組序列的88.62%，其中含有62個tRNAs、15個rRNAs和14個其他RNA序列。使用trf409.legacylinux64軟件鑒定出串聯(lián)重復序列 97個，簡單串聯(lián)重復序列29個。

利用NR數(shù)據(jù)庫進行蛋白質序列相似性搜索結果顯示，共有2743個基因被注釋到NR數(shù)據(jù)庫中，占總數(shù)的91.22%。菌株CSR-2基因組的NR數(shù)據(jù)庫注釋排名前10的物種分布如圖6所示，相似性最高的是朝井桿菌屬，在菌株CSR-2的編碼基因中共注釋到810個編碼基因，占總數(shù)的29.53%，總量最大；其次為茂物朝井桿菌Asaiabogorensis注釋了739個基因，占比為26.94%。對5株朝井桿菌屬細菌的全基因組序列的ANI分析表明，菌株CSR-2與茂物朝井桿菌NBRC 16594（GenBank收錄號為AP014690.1）ANI值最高（80.09%），與朝井桿菌屬的暹羅朝井桿菌A.siamensis、桔梗朝井桿菌A.platycodi、夏枯草朝井桿菌A.prunellae和落新婦朝井桿菌A.astilbis的ANI值在79.12%～77.39 %，表明CSR-2與茂物朝井桿菌基因組相似度最高。利用NT數(shù)據(jù)庫對菌株CSR-2染色體序列進行比對結果表明，該菌株與茂物朝井桿菌NBRC 16594相似度最高。結合ANI分析及NR、NT數(shù)據(jù)庫比對結果，菌株CSR-2被鑒定為茂物朝井桿菌。

圖6 菌株CSR-2基因組的NR數(shù)據(jù)庫注釋前十物種分布圖Fig.6 Top-hit species distribution in the BLASTx analysis against the NR database of strain CSR-2 genome

3 討論

本研究從玉米根際土壤中分離到對禾谷鐮孢、稻瘟菌等7種植物病原真菌均有顯著抑制效果的細菌菌株CSR-2，田間試驗表明該菌株對禾谷鐮孢引起的玉米莖腐病有顯著的防治效果。為深入挖掘CSR-2生防潛力及次級代謝產物基因簇，本研究采用三代PacBio測序技術對菌株CSR-2進行全基因組測序和分析。第三代PacBio測序技術能夠對單個DNA分子進行測序，并開發(fā)了用于三代測序的一些基因組裝軟件，讀段更長，準確率更高，極度敏感且無GC偏向性。自antiSMASH在線工具發(fā)布以來，全基因組序列信息在挖掘次級代謝產物基因簇領域得到了廣泛的應用[24]。通過全基因組測序、ANI值分析以及NR、NT數(shù)據(jù)庫比對，菌株CSR-2被鑒定為茂物朝井桿菌。

醋酸菌（Acetic acid bacteria，AAB）是以氧氣為終端電子受體，氧化糖類、糖醇類和醇類生成相應的糖醇、酮和有機酸的革蘭氏陰性細菌的總稱。已報道的醋酸菌共16個屬，84個種。隨著AAB種類的增加，AAB的功能也逐漸被發(fā)掘，如產生纖維素、色素、吲哚乙酸、抗壞血酸和固氮等[25]。朝井桿菌屬是2000年被提出來的，以日本細菌學家Toshinobu Asai命名，該屬的典型菌種為茂物朝井桿菌[26]。

茂物朝井桿菌是首次從常綠喬木羊蹄甲Bauhiniapurpurea中分離出來的一種革蘭氏陰性細菌，好氧、桿狀、具有鞭毛，屬于醋酸桿菌科朝井桿菌屬[26]。該菌常棲息于熱帶植物的花朵和果實中，能夠合成類胡蘿卜素和類異戊二烯醌等物質，促進其適應于不同的生長環(huán)境[27-29]。研究發(fā)現(xiàn)，該菌能產生許多胞外聚集物，具有粘附性，生物膜穩(wěn)定性強，具有很強的適應能力，能在多種不同的環(huán)境中生長。Grogan等[30]搜索了茂物朝井桿菌SF2.1全基因組序列，尋找該菌株細胞內蛋白質定位信號序列，并將其與報告蛋白堿性磷酸酶相融合，其中有3個信號肽能夠釋放抗菌肽類物質。利用蚊子進一步測試表明，這3株茂物朝井桿菌菌株能夠產生抑制由寄生蟲引起的瘧疾[31]。上述研究表明茂物朝井桿菌次生代謝產物豐富，適應性強，能夠產生多種抗菌性物質，但有關該菌株的研究和報道很少，尤其是有關茂物朝井桿菌對植物病原菌抑制作用的研究報道。

本研究表明菌株CSR-2影響禾谷鐮孢菌絲生長和菌絲形態(tài)，經過發(fā)酵液處理的禾谷鐮孢分生孢子在4 h時萌發(fā)率降低了77.17%，推測菌株CSR-2產生的抑菌性物質分泌到細胞外，拮抗病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，有關菌株CSR-2次生代謝產物的分離鑒定試驗還在進行中。將該菌株與玉米膜下滴灌水肥藥一體化相結合的田間試驗結果表明，菌株CSR-2對玉米莖腐病的防效顯著，且略高于2%戊唑醇懸浮種衣劑，可能與種衣劑在玉米灌漿前期效果減弱有關。如果將生防菌與種衣劑聯(lián)合施用，可能對玉米莖腐病的防治效果更好。本研究報道了茂物朝井桿菌CSR-2的生物防治作用，進行了全基因組序列測定和分析，并將生防菌與膜下滴灌水肥藥一體化體系相結合，為進一步挖掘微生物資源及其代謝產物基因簇用于農業(yè)生物防治提供理論依據(jù)。關于該菌株的代謝產物分析，生物防治機理還有待于進一步研究。