燕麥內(nèi)生細菌YN-J3的分離鑒定及防病促生作用研究

王海霞，鄭成忠，東保柱，孟煥文，周洪友*，孫瑞鋒，鄭紅麗*

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學園藝與植物保護學院/生物農(nóng)藥創(chuàng)制與資源利用自治區(qū)高等學校重點實驗室（培育），呼和浩特 010019；2. 烏蘭察布市農(nóng)牧業(yè)科學研究院，集寧 012000；3. 鄂爾多斯市萬通農(nóng)牧業(yè)科技有限公司，鄂爾多斯 017000）

燕麥Avena sativa在我國種植歷史悠久，屬禾本科Gramineae燕麥屬Avena植物，是一種糧飼兼用作物，同時也是一種功能性保健食品[1]。燕麥多生長在高寒、貧瘠和干旱的極端環(huán)境中，已經(jīng)成為生態(tài)脆弱區(qū)不可替代的特色糧飼作物[2]。因為燕麥營養(yǎng)價值高及適應性好等優(yōu)點，種植面積逐年擴大，現(xiàn)已成為北方地區(qū)著力發(fā)展的特色產(chǎn)業(yè)。但燕麥生產(chǎn)也存在產(chǎn)量低、田間病蟲害發(fā)生頻繁等問題[3]。燕麥田常見病害有炭疽病、德式霉葉斑病、紅葉病、黑穗病等[4]；影響燕麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。鑒于國家當前的農(nóng)業(yè)結構調(diào)整、發(fā)展草牧業(yè)、生態(tài)環(huán)境建設等一系列政策措施的支持，燕麥作為一種優(yōu)良的糧飼兼用作物，其集約化的種植面積將會逐年增加，勢必會引起病害的普遍發(fā)生和嚴重危害。因此，燕麥生產(chǎn)中有害生物的綠色防控成為燕麥產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的必由之路[4]。

植物內(nèi)生菌是非常重要的微生物資源，現(xiàn)已成為植物學、微生物學、植物保護學及作物育種學等多種學科研究的熱點[5-7]。植物內(nèi)生菌對于植物有促生、誘導植物抗病性、提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、生物固氮、降解有害物質(zhì)等作用[8-10]，是重要的生防資源。研究表明，短葉紅杉Taxus revifolia的韌皮部分離出的一株能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌——安德烈紫杉菌Taxomyces andreanae，能夠提高短葉紅衫的抗病性[11]；內(nèi)生菌通過影響宿主植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝促進宿主植物的生長[12]。Mal1nowski等[13]發(fā)現(xiàn)感染了內(nèi)生真菌的酥油草其根系具有更強的吸收P的能力, 同時根系內(nèi)Ca、Mg含量也較高, 其機制可能是增加根系長度和向土壤中分泌酸類。史應武等[14]發(fā)現(xiàn)從甜菜根部分離的1株內(nèi)生菌能顯著增加甜菜鮮重、葉綠素含量及含糖率，有明顯的促生、增糖作用。內(nèi)生菌還可以通過分泌植物生長素（Indole acetic acid）、赤霉素（Gibberellin A4）和細胞分裂素（Cytokinin）等植物激素直接促進植物生長。如沈德龍等[15]從水稻中分離到的內(nèi)生成團泛菌YS19可以分泌生長素、細胞脫落酸、赤霉素和細胞分裂素4種植物激素。目前，很多研究人員開始致力于植物體內(nèi)的細菌研究，至今在植物保護方面積累了大量的植物內(nèi)生細菌研究信息[16,17]。但是，針對燕麥的內(nèi)生菌的研究卻鮮有報道。

本研究通過對田間長勢良好的燕麥植株的內(nèi)生菌進行分離、鑒定和生物測定；以期獲得對燕麥有促生、防病作用的內(nèi)生菌；為燕麥病害的綠色防控積累重要生物資源，并為進一步深入了解燕麥內(nèi)生菌促生及防病機制及應用于燕麥生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品：分離燕麥植株來自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市、河北省張家口市、云南省會澤等地，具體信息如表1。

表1 燕麥樣本來源及分離數(shù)量Table 1 Oat sample source and separation results

供試病原：燕麥葉斑病菌Drechslera avenae、燕麥炭疽病菌Colletotrichum graminicola、馬鈴薯黃萎病菌Verticillium dahliae、馬鈴薯枯萎病菌Fusarium oxysporum、馬鈴薯黑痣病菌Rhizoctonia solani、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學植物病理研究室分離、保存。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切塊煮沸30 min，濾液中加葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH自然。LB培養(yǎng)基：酵母膏5～10 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.0～7.2。LB液體培養(yǎng)基：酵母膏5～10 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.0～7.2。PKO無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，Ca3(PO4)25.0 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，F(xiàn)eSO40.003 g，酵母膏0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 6.8～7.0，121 ℃滅菌30 min。鉀長石培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，鉀長石2.5 g，Na2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，CaSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂 20 g，pH 7.0。king B 培養(yǎng)基：蛋白胨 20 g，磷酸氫二鉀1.5 g，七水合硫酸鎂1.5 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.0～7.2。DF培養(yǎng)基KH2PO44 g，Na2HPO46 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖2 g，葡萄糖酸鈉2 g，檸檬酸2 g，(NH4)2SO42 g，組分一（H3BO310 mg，MnSO4·H2O 11.19 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，CuSO4·5H2O 78.22 mg，MoO310 mg，溶于 100 mL 滅菌蒸餾水中，4 ℃保存），組分二（FeSO4·7H2O 100 mg溶于10 mL滅菌蒸餾水中，4 ℃保存）溶液各0.1 mL，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.2。ADF培養(yǎng)基：ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）溶于超純水后抽濾滅菌，加到不含(NH4)2SO4且預先滅菌的DF培養(yǎng)基中，ACC終濃度為3 mmol/L。Salkowski比色液：稱取硫酸鐵12 g溶于蒸餾水中，之后緩慢加入429.7 mL濃硫酸，待溶液冷卻后定用蒸餾水容至1 L。測定范圍為0.3～20 mg/mL。細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，天津，中國）16S rDNA擴增引物：27F（5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇）、1492R（5＇-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3＇）gyrA 基因擴增引物：gyrA-F（5＇-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3＇）、gyrA-R（5＇-CAAGGTAATGCTCCAGGC ATTGCT-3＇）,增試劑：2×mixTaq酶、瓊脂粉、核酸染料。

1.2 燕麥內(nèi)生菌的分離

健康的燕麥植株沖洗干凈，然后依次用75%乙醇浸泡30 s，5%次氯酸鈉浸泡2 min，無菌水沖洗3次。樣品經(jīng)表面消毒后，將根、莖、葉用無菌剪刀剪成小段，放入研缽中研磨至勻漿。將梯度稀釋后的勻漿均勻涂布于固體 LB，同時取最后一次無菌水沖洗液，涂布至空白平板上，培養(yǎng)觀察。如無菌落長出，說明植物組織的表面消毒徹底，分離出來的即為植物內(nèi)生菌。培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取不同形態(tài)的菌落用30%甘油在-80 ℃冰箱保存。

1.3 燕麥拮抗內(nèi)生菌的篩選

利用平板對峙培養(yǎng)法篩選病原菌的拮抗內(nèi)生菌[18]。首先在PDA培養(yǎng)基中心接種直徑0.5 cm的病原菌菌餅，然后在病原菌菌餅等距離（2.5 cm）處點接分離得到的細菌菌株，以僅在中心接種病原菌的平板作為對照。28 ℃培養(yǎng)3～6 d后，觀察結果。以抑菌圈的大小和形狀判斷拮抗程度。抑菌率（%）＝（對照菌落半徑－處理菌落半徑）/（對照菌落半徑－0.25 cm）×100。

1.4 內(nèi)生菌株YN-J3的生物測定

1.4.1 防病效果測定 燕麥離體葉片置于鋪有2 層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，將1×107cfu/mL菌懸液均勻噴霧于葉片表面。在葉片上接種10 mL孢子濃度為1×107cfu/mL 的炭疽菌孢子懸浮液。最后，將培養(yǎng)皿置于16 h光照/8 h黑暗、25 ℃條件下培養(yǎng)4 d。測量病斑長度，并計算防治效果。防治效果（%）＝（對照病斑直徑－處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100。

1.4.2 促生作用測定 種植燕麥的土壤進行高溫滅菌，按照土壤、蛭石、營養(yǎng)土體積比 2:2:1進行混合，裝盆待用。將燕麥種子沖洗干凈，然后依次用5%次氯酸鈉浸泡3 min，無菌水沖洗4次。之后將燕麥種子放入待測菌株菌懸液中，在28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，以在液體LB中搖培2 h的燕麥種子設為對照。將處理好的燕麥種子均勻地撒在花盆中，每盆20粒，重復3次，表面覆土，于培養(yǎng)室內(nèi)（25 ℃）培養(yǎng)，隔天澆水。待生長3 周后測量植株出苗率、株高、鮮重等，分析不同內(nèi)生細菌對燕麥生長的影響。

1.5 內(nèi)生菌株YN-J3的田間生測

田間試驗地塊設置在內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市集寧區(qū)烏蘭察布市農(nóng)牧業(yè)科學研究院和內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市武川縣小西攤村兩處。試驗于2021年5月至9月進行，兩個地點處理相同，每個地點設置內(nèi)生菌處理和空白對照，重復4次。燕麥種子的品種為白燕二號，首先用內(nèi)生菌菌懸液（1×107cfu/mL）對燕麥種子進行拌種，待晾干后播種。之后每隔20 d左右對燕麥植株進行內(nèi)生菌菌懸液噴霧，共進行3次。其中菌懸液（1×107cfu/mL）需稀釋10 倍后施用，對照只噴霧清水，田間常規(guī)管理。

待對照發(fā)病后開始調(diào)查，每個小區(qū)隨機調(diào)查燕麥植株炭疽病發(fā)病情況，燕麥炭疽病分級標準：按病斑所占葉片表面積進行分級，1級：無病斑；2級：1%～10%；3級：11%～25%；4級：26%～50%；5級：51%以上。病情指數(shù)＝100×∑（各級病葉數(shù)×該病級代表相數(shù)值）/（調(diào)查總葉數(shù)×最高級代表值），防治效果（%）＝100×（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)。并調(diào)查了燕麥植株的株高，與對照相比，計算處理對燕麥植株的促生作用。

1.6 內(nèi)生菌YN-J3的促生功能測定方法

1.6.1 解磷能力測定 將內(nèi)生菌接種于PKO無機磷培養(yǎng)基平板上，3次重復，30 ℃下培養(yǎng)3 d，觀察菌落周圍是否有解磷圈的形成及其直徑大小，以此來判斷該菌株有無解磷能力，并測量解磷圈直徑及菌落直徑，解磷能力的大小用解磷圈直徑/菌落直徑（D/d）表示，其比值越大，解磷效果越好，以此來初步確定菌株的解磷能力[19]。

1.6.2 解鉀能力測定 將菌株接種于鉀長石培養(yǎng)基平板上，3次重復，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落周圍是否有解鉀圈的形成及其直徑大小，以此來判斷該菌株有無解鉀能力，并測量解鉀圈直徑及菌落直徑，解鉀能力的大小用解鉀圈直徑/菌落直徑（D/d）表示，其比值越大，解鉀效果越好，以此來初步確定菌株的解鉀能力[20]。

1.6.3 產(chǎn)吲哚乙酸IAA能力測定 選用經(jīng)典的 Salkowski試劑比色法[21]。挑取待篩選菌株單菌落接入液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600＝1。將菌懸液以1%的接種量接至不含色氨酸的King B培養(yǎng)基中，以無菌水做對照。將上述三角瓶置于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。取菌懸液1 mL滴加于試管中，加入等量的Salkowski比色液，將試管置于室溫顯色15 min，觀察顏色變化，將比色結果與IAA以及加無菌水的不含色氨酸的king B培養(yǎng)基做對照，溶液顏色越紅，表明IAA生產(chǎn)能力越強，不變色則為陰性，不產(chǎn)IAA。

1.6.4 產(chǎn)ACC脫氨酶能力測定 挑取產(chǎn)IAA陽性菌株少許于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，將三角瓶置于28 ℃、180 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，制成菌懸液。吸取200 μL上述菌懸液加入到提前配置好的10 mL的DF培養(yǎng)基中，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸取200 μL加入到10 mL的ADF培養(yǎng)基中，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，將菌株再在ADF培養(yǎng)基轉接培養(yǎng)一次。以ADF（不含ACC）培養(yǎng)基作為陰性對照，不接菌的ADF和不含ACC的ADF培養(yǎng)基調(diào)零，在分光光度計下測量其在600 nm波長下的光度值，菌液濃度OD600大于0.1，表明菌株能夠利用 1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）作為唯一氮源生長，初步認為是ACC脫氨酶陽性菌株。

1.7 解淀粉芽胞桿菌YN-J3的鑒定

1.7.1 形態(tài)學、生理生化鑒定 對待鑒定菌株YN-J3利用革蘭氏染色進行初步鑒定[22]，參照方中達《植物病理研究方法》[23]進行生理生化鑒定。

1.7.2 分子生物學鑒定 挑取單菌落于1.5 mL離心管中，12000 r/min離心1 min，收集菌體。細菌DNA由購自天根生化科技有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取，詳細步驟請參閱產(chǎn)品手冊。

用通用引物 27F（5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇）、1492R（5＇-TACGGTTACCTTGTTACGAC TT-3＇）擴增 16S rDNA，并利用引物gyrA-F（5＇-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3＇）、gyrA-R（5＇-CAA GGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3＇）擴增看家基因。PCR擴增反應體系為25 μL，其中DNA模板為3 μL，27F/1492R引物各1 μL，2×mixTaq酶12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR擴增反應程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min、30個循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送到北京擎科生物技術有限公司測序。將測序的結果通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序進行相似性比對分析。用MEGA 7.0構建目標菌株16S rDNA與gyrA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本試驗數(shù)據(jù)在Excel軟件上進行統(tǒng)計，計算結果在SPSS統(tǒng)計分析軟件上完成，檢驗處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離及篩選

通過對來自內(nèi)蒙古自治區(qū)、河北省及云南省等地點的健康燕麥植株樣本進行內(nèi)生菌分離（表1），共分離到512株內(nèi)生菌。其中，對于燕麥德式霉菌有抑制作用的共122株，有9株內(nèi)生細菌的抑制率達到60%以上，分別為JN-Y2、XH-J8、JN-G7、JN-J12、YN-J3、ZZ-J4、ZZ-G2、ZZ-G5、ZZ-J3（表2）。其中菌株YN-J3抑制效果最好，抑菌率為79.03%（圖1）。篩選出的9 株內(nèi)生細菌對燕麥炭疽病菌均有不同程度的抑菌作用，菌株YN-J3的抑菌率為89.60%（表2）。以上試驗結果表明，篩選得到的9株燕麥內(nèi)生菌對于燕麥2種病原菌均有廣譜的抑菌效果，菌株YN-J3的抑菌效果最顯著。

表2 內(nèi)生菌對燕麥病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of endophytes on oat disease bacteria

圖1 內(nèi)生菌對燕麥葉斑病菌的拮抗作用Fig. 1 The antagonistic effect of endophytes on oat leaf spotpathogen

將分離得到的9株燕麥內(nèi)生菌與馬鈴薯常見病原菌做平板對峙試驗，結果表明：9株燕麥內(nèi)生菌均能抑制馬鈴薯黑痣病菌、菌核病菌、鐮刀菌病菌、大麗輪枝菌的生長。因此，9株燕麥內(nèi)生細菌對于馬鈴薯、燕麥常見病原菌具有廣譜抑制作用，菌株YN-J3對4種馬鈴薯病原菌均有很好的抑制作用，抑制率分別為80.66%、65.06%、68.98%和89.28%（表3）。

表3 內(nèi)生菌對其他病原真菌的抑制作用Table 3 Inhibition of endophytes on other pathogenic fungi

2.2 內(nèi)生菌株YN-J3的生物測定

利用離體接種的方法，測定菌株YN-J3對燕麥炭疽病的室內(nèi)防治效果。結果如圖2所示，YN-J3處理后炭疽病斑長度為（0.23±0.03）cm，對照的病斑長度為（0.93±0.03）cm。離體條件下，YN-J3的防治效果為75.27%。此外，接種4 d后，對照葉片已退綠，經(jīng)菌株YN-J3處理后的葉片仍為綠色。結果表明，菌株YN-J3離體條件下能夠有效控制炭疽病的侵染和擴展。

圖2 菌株YN-J3對燕麥炭疽病菌的離體葉片試驗Fig. 2 Test of detached leaves of strain YN-J3 against the pathogen of oat anthracnose

試驗結果如圖3 所示，與對照組相比，菌株YN-J3處理與對照的鮮重分別為（5.36±0.57）和（3.63±0.49）g，YN-J3處理比對照增加了47.66%；干重分別為（0.72±0.04）和（0.31±0.03）g，YN-J3處理比對照增加了83.87%；株高分別為（35.27±0.77）和（28.25±1.88）cm，YN-J3處理比對照增加了24.84%。結果表明，菌株YN-J3對燕麥有很好的促生作用。

圖3 內(nèi)生菌對燕麥生長的影響Fig. 3 Effect of bacterial strain on the growth of oat

2.3 內(nèi)生菌株YN-J3的田間生測

通過兩個地點進行燕麥株高分析，與對照相比，集寧和武川兩個地點經(jīng)菌株YN-J3處理的燕麥株高均顯著高于對照。如圖4所示，集寧地點的菌株YN-J3處理與對照的株高分別為（120.88±6.98）和（99.01±4.67）cm，YN-J3處理比對照增加了22.09%；武川地點的菌株YN-J3處理與對照的株高分別為（59.39±1.39）和（48.03±1.49）cm，YN-J3處理比對照增加了23.65%。

圖4 內(nèi)生菌YN-J3對燕麥株高的影響(田間)Fig. 4 Effects of endophytes on oat plant height (Field)

通過兩個地點進行田間防效分析，與對照相比，經(jīng)菌株YN-J3處理的燕麥炭疽病發(fā)病率明顯低于對照。如表4所示，集寧地點的菌株處理與對照的發(fā)病率分別為（8.31±0.26）%、（19.08±1.03）%，其防治效果為74.53%；武川地點的菌株YN-J3處理與對照的發(fā)病率分別為（26.28±3.14）%、（47.30±3.62）%，其防治效果為63.57%。結果表明，菌株YN-J3在田間條件下具有較強抑菌活性。

表4 菌株YN-J3對燕麥炭疽病的田間防效作用Fig. 4 Field control effect of strain YN-J3 on oat anthracnose

2.4 內(nèi)生菌YN-J3的促生功能研究結果

為了研究菌株YN-J3的促生機制，對菌株YN-J3解磷、解鉀、產(chǎn)IAA和產(chǎn)ACC脫氨酶能力進行測定。解磷能力測定結果如圖5所示：菌株YN-J3有非常明顯的解磷圈，無機磷培養(yǎng)基上解磷圈直徑/菌落直徑（D/d）為（1.80±0.04），表明其具有解磷作用（表5）；將內(nèi)生菌接種于鉀長石培養(yǎng)基上，觀察其解鉀圈的直徑大小，結果表明菌株 YN-J3周圍有明顯的解鉀圈（圖5），其解鉀圈直徑/菌落直徑（D/d）為（2.28±0.05），試驗表明菌株YN-J3具有解鉀作用（表5）。產(chǎn) IAA試驗結果如圖6所示，菌株YN-J3紅色最深，并進行了IAA的定量測定，結果表明菌株YN-J3分泌IAA量最多，為（24.20±0.01）μg/mL，表明其產(chǎn)IAA能力最強。對菌株YN-J3進行產(chǎn)ACC脫氨酶OD值為0.18，大于 0.1，表明菌株 YN-J3有一定程度的產(chǎn) ACC脫氨酶能力（表5）。

表5 內(nèi)生菌YN-J3 解磷、解鉀及產(chǎn)ACC脫氨酶能力Table 5 Endophyte YN-J3 dissolves phosphorus, potassium and ACC deaminase

圖5 內(nèi)生菌YN-J3的解磷及解鉀測試結果Fig. 5 Endophyte YN-J3s test results of dissolving phosphorus and potassium

圖6 內(nèi)生菌株 YN-J3 產(chǎn)IAA顯色結果Fig. 6 Endophytic strain YN-J3 produced IAA color development results

2.5 內(nèi)生菌YN-J3的鑒定

2.5.1 形態(tài)學及生理生化鑒定 對篩選出拮抗效果較好的菌株YN-J3進行形態(tài)學及生理生化鑒定，結果表明，菌株YN-J3白色，菌落不透明，表面粗糙有隆起，邊緣不規(guī)則（圖7）。經(jīng)鑒定，其革蘭氏染色結果為陽性（圖8），甲基紅試驗、丙二酸鹽試驗、淀粉水解試驗、接觸酶試驗均為陽性反應，V-P試驗、檸檬酸鹽試驗為陰性反應（表6）。菌體（0.70～0.90）μm×（1.80～3.00）μm；YN-J3在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d產(chǎn)生芽胞，芽胞中生，產(chǎn)生芽胞后菌體膨大（圖8）。

表6 促生菌株生理生化鑒定Table 6 physiological and biochemical identification results of growth promoting

圖7 內(nèi)生菌株YN-J3菌落形態(tài)Fig. 7 Colony morphology of endophytic strain YN-J3

圖8 內(nèi)生菌株YN-J3革蘭氏染色結果Fig. 8 Endophytic strain YN-J3 gram staining results

2.5.2 分子生物學鑒定 利用27F/1492R引物對擴增16S rDNA，PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，在1500 bp左右得到清晰明亮的特異性條帶（圖9）。對特異性條帶測序，將獲得的序列在NCBI中Blast同源性比對，菌株YN-J3與解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens相似度為99.93%，且菌株YN-J3的gyrA基因序列與解淀粉芽胞桿菌相似度為99.86%，下載同源序列并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果如圖10所示：菌株YN-J3與解淀粉芽胞桿菌MW559233.1聚為一類。結果表明，菌株YN-J3為解淀粉芽胞桿菌，16S rDNA基因序列登錄號為OL872222。

圖9 菌株YN-J3的16S rDNA及gyrA基因PCR擴增電泳圖Fig. 9 PCR amplification electrophoresis of 16S rDNA andgyrA gene of strain YN-J3

圖10 菌株YN-J3基于多基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 10 Phylogenetic tree based on the multigene sequences of strain YN-J3

3 討論

內(nèi)生菌物種豐富，主要包括真菌、細菌和放線菌三大類，為生物農(nóng)藥、肥料開發(fā)提供了巨大的資源庫[24]。植物內(nèi)生菌種類多樣性取決于自身和寄主種類多樣性，以及寄主不同部位分布的可選性[25]。目前世界報道的原料研究對象中，植物內(nèi)生細菌多為Bacillus、Pseudomonas等，存在于至少129種大田作物及工業(yè)原料作物中[26]。本研究通過對燕麥內(nèi)生菌進行分離，得到了512株內(nèi)生細菌，細菌形態(tài)多樣；通過16S rDNA擴增序列分析結果表明，512株細菌中涉及到了芽胞桿菌等多個屬內(nèi)的6個種。512株細菌中有9株對于燕麥葉斑病、炭疽病菌有很強的抑菌效果。以上研究結果表明：燕麥的內(nèi)生菌種類豐富，是重要的生防資源。

枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌具有良好的定殖能力，能保護植物免受病原真菌的侵害[27]，還有促生長的作用[28]。研究表明：抗生作用是芽胞桿菌主要的生防機制之一[29,30]。如解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7對9株植物病原真菌均具有良好的拮抗效果[31]；枯草芽胞桿菌B. subtilisRSS-55對油菜菌核病菌S. sclerotiorum有極強的抑制效果，抑制率高達 93.33%[32]。此外，芽胞桿菌還可以分泌出磷酸脂酶和嗜鐵素，從而吸收利用土壤中的難溶性磷和固態(tài)鐵[33,34]；也有一些芽胞桿菌能夠分泌植物生長類激素，促進植物生長。本研究中，分離自燕麥的B. amyloliquefaciensYN-J3能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，顯著抑制燕麥病原菌的生長；并且通過解磷、解鉀、產(chǎn)生植物生長激素等方式，促進燕麥生長。以上結果表明：燕麥內(nèi)生芽胞桿菌資源在防控植物病害、促進植物生長等方面發(fā)揮重要作用，是值得開發(fā)利用的生防資源。

在內(nèi)蒙古地區(qū)，馬鈴薯常年連作，會導致土壤養(yǎng)分利用嚴重失衡，土傳病害日益加重[35]。燕麥-馬鈴薯輪作是合理利用土壤肥力，減輕馬鈴薯土傳病害的重要農(nóng)業(yè)措施；這種輪作的方式也是內(nèi)蒙古寒旱區(qū)主要的種植模式[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，分離得到的多株燕麥內(nèi)生菌，具有廣譜抗菌活性，對于馬鈴薯土傳病原菌有拮抗作用。燕麥內(nèi)生菌有望用于防治馬鈴薯土傳病害，其防治效果需要進一步研究確定。