高地芽胞桿菌ST15的篩選、鑒定及生防特性研究

苗成琪，趙延存，包 艷，凌 軍，劉嘉鈺，李朝輝，劉鳳權(quán)*

（1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品安全重點實驗室，南京 210014；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，南京 210095）

水稻黃單胞菌Xanthomonas oryzae包含兩個亞種：水稻細菌性條斑病菌X.oryzaepv.oryzicola（Xoc）和水稻白葉枯病菌X.oryzaepv.oryzae（Xoo），分別引起水稻細菌性條斑病（bacterial leaf streak，BLS）和水稻白葉枯?。╞acterial leaf blight，BLB），是我國水稻生產(chǎn)上的兩種主要細菌病害，通常造成產(chǎn)量損失5%～10%，嚴重時達40%以上，甚至絕產(chǎn)[1,2]。目前，水稻細菌病害的防控主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，包括三氯異氰尿酸、噻霉酮、噻唑鋅等[3]。然而，化學(xué)農(nóng)藥的長期不合理使用導(dǎo)致病原菌抗藥性逐漸增強，同時殘留農(nóng)藥對食品安全和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成嚴重威脅。近年來，具有相對安全、無殘留、環(huán)境友好等優(yōu)點的生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)不斷增長，基于微生物的生物防控技術(shù)被認為是未來控制作物細菌病害的主要發(fā)展方向之一[4]。芽胞桿菌Bacillusspp. 屬于革蘭氏陽性細菌，廣泛分布于土壤、植物表面、水體、農(nóng)業(yè)廢棄物等各種生境中，具有廣譜的抗菌活性、較高的芽胞產(chǎn)率和較強的逆境適應(yīng)性，被認為是最具有應(yīng)用開發(fā)潛力的有益微生物之一[5]。高地芽胞桿菌B. altitudinis是芽胞桿菌屬的一個新種，對多種病原真菌具有拮抗活性，能夠有效抑制白絹病菌Sclerotium rolfsii、瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides等多種病原真菌的生長，同時，對植物表現(xiàn)一定的促生作用[6,7]。目前，關(guān)于高地芽胞桿菌對水稻黃單胞病菌具有拮抗作用的報道較少。

本研究從梨樹根際土壤分離篩選到 1株對水稻黃單胞菌具有較強拮抗活性的細菌 ST15，根據(jù)生物學(xué)特征、生理生化指標(biāo)及保守核苷酸序列，確定了該菌株的分類地位；評估了其次生代謝抗菌物質(zhì)的抑菌活性及穩(wěn)定性，測定了ST15對水稻細菌性條斑病的田間防治效果、對水稻的促生作用以及與化學(xué)殺菌劑的兼容性，以期為開發(fā)防治水稻細菌性病害的微生物農(nóng)藥提供新的菌株資源和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所用病原菌菌株包括黃瓜細菌性角斑病菌Pseudomonas syringaepv.lachrymansPSL、梨銹水病菌Dickeya fangzhongdaiLXS、大白菜軟腐病菌Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorumPCC、瓜類果斑病菌Acidovora xavenaesubsp.citrulliGXGB、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusVISA、茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearumsQQK、梨火疫病菌Erwinia amylovoraLHY、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestris Xcc、水稻細菌性條斑病菌6個菌株（Rs105、Xoc-192、Xoc-197、Xoc-S、Xoc-M、Xoc-W）、水稻白葉枯病菌7個菌株（PXO99、YN1、YN7、YN24、FUJ、SCYC-6、GD414），這些菌株均為本實驗室保存菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 NB 培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉1 g/L、牛肉浸膏3 g/L，pH 6.8～7.0。1/2 NB培養(yǎng)基：蔗糖5 g/L、蛋白胨2.5 g/L、酵母粉0.5 g/L、牛肉浸膏1.5 g/L，pH 6.8～7.0。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上添加15 g/L瓊脂粉。PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g/L（煮沸直至馬鈴薯變軟，三層紗布過濾）、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉15 g/L。上述培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 細菌種子液、發(fā)酵液、無菌濾液及菌懸液的制備

1.2.1 細菌種子液制備 利用滅菌牙簽挑取單菌落于含有5 mL NB液體培養(yǎng)基的試管中，180 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)至OD600＝1，備用。

1.2.2 細菌發(fā)酵液制備 將1.2.1所得的種子液以1%（v/v）的比例接種到1/2 NB培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃搖培48～52 h。

1.2.3 無菌濾液的制備 將1.2.2制備的ST15發(fā)酵液8000 r/min離心10 min，取上清，用0.22 μm細菌過濾器過濾除菌，得到無菌發(fā)酵濾液。

1.2.4 細菌菌懸液的制備 將1.2.2制備的ST15發(fā)酵液8000 r/min離心10 min，棄上清，用無菌水懸浮菌體，并將菌體密度調(diào)整到1.0×108CFU/mL。

1.3 生防細菌的分離、篩選及初步鑒定

1.3.1 生防細菌的分離 從安徽碭山、河南寧陵、河北石家莊、江西南昌、新疆庫爾勒、甘肅張掖、江蘇句容和溧水的16個梨園采集27份土樣，從遼寧大連的2個蘋果園采集3份土樣，從江蘇句容和溧水的5塊水稻田采集6份土樣，每份土樣充分混勻后稱取10 g，放入500 mL錐形瓶中，加入90 mL無菌水，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，使其充分混勻后，用無菌水梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，每梯度吸取100 μL均勻涂布在NA平板上，每個濃度重復(fù)3次，28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，挑取形態(tài)不同的菌落劃線純化培養(yǎng)，甘油菌種保存于-80 ℃[8]。

1.3.2 生防細菌的篩選 以水稻細菌性條斑病菌Rs105菌株為靶標(biāo)，篩選具有顯著拮抗活性的生防細菌。吸取100 μL Rs105種子液（OD600＝1）稀釋100倍，取3 mL在NA平板上均勻涂布，吸掉多余的菌液，晾干后，分別取3 μL候選生防菌種子液（OD600＝1）滴加在距離平板中心2.5 cm處相對稱的6點，以滴加無菌水為對照，每個處理重復(fù)3次，28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，觀察并測量抑菌圈的直徑。

1.3.3 生防細菌的16S rDNA測定 選取拮抗圈直徑大于2.0 cm的菌株，制備所選細菌的菌液，使用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌的總基因組DNA。利用細菌16S rDNA基因的通用引物27F（5′-A GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）PCR 擴增 DNA 片段[9]。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。所得PCR產(chǎn)物送六合華大生物公司進行序列測定，將測得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析。

1.4 菌株ST15的鑒定

1.4.1 形態(tài)觀察 利用滅菌牙簽從4 ℃保存的ST15平板上挑取單菌落，在NA固體平板上劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察該菌株的菌落形態(tài)。從NA固體平板上挑取菌株ST15的單菌落，28 ℃、180 r/min條件下?lián)u培，于24和48 h分別取樣2 mL，12000 r/min離心10 min收集菌體，利用PBS緩沖液輕緩懸浮菌體，離心洗滌2次，最后利用2.5%戊二醛固定，送揚州大學(xué)電鏡室觀察該菌株的菌體形態(tài)和芽胞形態(tài)。

1.4.2 Biolog測定 委托中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏管理中心，使用 BIOLOG GENIII 試劑盒（按照試劑盒說明書操作）對菌株 ST15 進行基本特性試驗、生長試驗以及化學(xué)敏感試驗的測定。

1.4.3gyrB基因的測定及進化樹分析 利用細菌gyrB基因的通用引物UP-1（5′-GAAGTCATCATGACCG TTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′）和 UP-2r（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACR TCNGCRTCNGTCAT-3′）PCR擴增DNA片段；利用測序引物UP-1S（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCT GCA-3′）和 UP-2Sr（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′）對 PCR 產(chǎn)物進行測序[10]。所得 PCR 產(chǎn)物送六合華大生物公司進行序列測定，并將測定序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫?；趃yrB及GenBank下載的參考序列，利用MEGA 7.0軟件進行多序列比對及遺傳進化樹構(gòu)建，選擇綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosaPAO1作為遺傳進化樹的外圍參照菌株[11]。

1.5 菌株ST15對病原細菌的抗菌譜測定

采用平板對峙法[12]測定ST15對10種病原細菌的21個菌株的拮抗活性。首先，將各病原菌接種到NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)至OD600＝1.0，作為種子菌液。參照1.3.2方法，分別將各供試病原細菌的種子菌液涂布在NA平板上，然后吸取3 μL ST15 的種子菌液滴在平板中心，28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，測量抑菌圈的直徑。每個處理重復(fù)3次。

1.6 菌株ST15無菌濾液的抑菌活性及穩(wěn)定性分析

1.6.1 無菌濾液的抑菌活性分析 以水稻細菌性條斑病菌Rs105和水稻白葉枯病菌PXO99為靶標(biāo)，采用平板對峙法對ST15無菌濾液、噻唑鋅以及噻霉酮的抑菌活性進行比較。以DMSO分別溶解噻唑鋅和噻霉酮，并分別配置濃度為1 mg/mL和10 μg/mL的藥液。參照1.3.2的方法將病原菌涂布在NA平板上，晾干后用孔徑為5 mm的無菌打孔器在平板中心以及距離平板中心2.5 cm處相對稱的4點打孔。分別吸取30 μL的ST15無菌濾液、1 mg/mL噻唑鋅溶液以及10 μg/mL噻霉酮溶液滴加在小孔處，以滴加DMSO的處理作為對照，每處理重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)2 d，測量抑菌圈直徑。

1.6.2 次生代謝抗菌活性物質(zhì)的熱處理穩(wěn)定性分析 將ST15無菌濾液分裝于2 mL離心管中，每管1 mL，分別在30 ℃、50 ℃、65 ℃、85 ℃和100 ℃條件下水浴處理30 min，以未做處理的ST15無菌濾液作為對照，以水稻細菌性條斑病菌 Rs105菌株為靶標(biāo)，檢測抑菌活性。每個處理重復(fù)3次。

1.6.3 次生代謝抗菌活性物質(zhì)的蛋白酶處理穩(wěn)定性分析 將ST15無菌濾液分裝于2 mL離心管中，每管1 mL，分別加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K，使酶的終濃度為100 μg/mL，以添加無菌水作為對照，37 ℃放置6 h，以水稻細菌性條斑病菌Rs105為靶標(biāo)，檢測抑菌活性。每個處理重復(fù)3次。

1.6.4 次生代謝抗菌活性物質(zhì)的酸堿處理穩(wěn)定性分析 分別吸取5 mL ST15無菌濾液于6孔培養(yǎng)板中，利用HCl和NaOH溶液分別將pH調(diào)整為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，室溫放置1 h后，將各處理無菌濾液的pH 再調(diào)整為 7.0，以未經(jīng)處理的 ST15 無菌濾液作為對照，以水稻細菌性條斑病菌Rs105為靶標(biāo)，檢測抑菌活性。每個處理重復(fù)3次。

1.6.5 次生代謝抗菌活性物質(zhì)的紫外處理穩(wěn)定性分析 取15 mL ST15無菌濾液于培養(yǎng)皿中，打開皿蓋，置于超凈工作臺25 W紫外燈下60 cm處，垂直向下照射處理1 h，以未經(jīng)處理的ST15 無菌濾液作為對照，以水稻細菌性條斑病菌Rs105菌株為靶標(biāo)，檢測抑菌活性。每個處理重復(fù)3次。

1.7 菌株ST15對水稻的促生效果測定

選取健康水稻種子（Y兩優(yōu)911），75%酒精消毒5 min，無菌水沖洗5次，以徹底消除酒精。將120粒水稻種子放入含有100 mL ST15菌懸液(1×108CFU/mL）的500 mL廣口瓶中，浸種36 h，以無菌水處理作為對照。倒掉菌懸液，將水稻種子倒入鋪有一層無菌濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，用同種浸種液將濾紙浸濕，蓋上皿蓋，26 ℃放置72 h催芽，測定種子發(fā)芽率，隨機選擇100粒種子測定其根長和芽長。

1.8 菌株ST15對3種化學(xué)殺菌劑的耐受性測定

分別將噻唑鋅和噻霉酮溶于DMSO，配置20 mg/mL噻唑鋅和6.4 mg/mL噻霉酮母液；將三氯異氰尿酸溶于無菌水，配置7.1 mg/mL母液；然后，分別制備噻唑鋅終濃度為0、8、16和32 μg/mL的NA固體平板，噻霉酮終濃度為0、0.125、0.25和0.5 μg/mL的NA固體平板，三氯異氰尿酸終濃度為0、64、128和256 μg/mL的NA固體平板。將菌株ST15培養(yǎng)液（OD600＝1.0）和水稻細菌性條斑病菌Rs105菌株培養(yǎng)液（OD600＝1.0）分別稀釋5、25、125倍，分別吸取2 μL ST15和Rs105原液及各濃度稀釋液滴加在含上述殺菌劑的NA固體平板上，28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，觀察菌落的生長情況。每個處理重復(fù)3次。

1.9 菌株ST15生防菌劑對水稻細菌性條斑病的田間防效測定

1.9.1 菌株ST15生防菌劑的配置 將菌株ST15的種子液以1%（v/v）的比例接種到NB培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃搖培48 h，菌體濃度約3.5×109cfu/mL，向發(fā)酵液中添加5%（v/v）98B助劑、0.05%吐溫80以及0.1%苯甲酸鈉，充分混勻，然后無菌分裝，室溫保存。

1.9.2 試驗設(shè)計 田間試驗于2020年在江蘇省泗陽縣張家圩鎮(zhèn)進行，本試驗共設(shè)4個處理：ST15生防菌劑10 L/hm2、ST15生防菌劑15 L/hm2、3%噻霉酮懸浮劑1.5 L/hm2和清水對照，兌水600 kg/hm2稀釋噴霧，每處理重復(fù)3次，隨機區(qū)組排列，每個小區(qū)面積為20 m2。在水稻細菌性條斑病發(fā)生初期（水稻孕穗期）第1次施藥，12 d后進行第2次施藥，連續(xù)施藥2次，采用3WBD-16型背負式電動噴霧器（臺州市路橋噴農(nóng)噴霧器有限公司生產(chǎn)，工作壓力0.2～0.4 MPa）進行噴霧。

1.9.3 調(diào)查及統(tǒng)計方法 于第1次施藥前（8月7日）調(diào)查病情基數(shù)，在第2次用藥后第11 d（8月30日）調(diào)查防效。采用五點（對角線）取樣法進行取樣，每點取5叢，每叢調(diào)查20株，每株調(diào)查水稻上部2張葉片。病害的分級標(biāo)準(zhǔn)和防效統(tǒng)計方法參照《農(nóng)藥 田間藥效試驗準(zhǔn)則（二）第 105部分：殺菌劑防治水稻細菌性條斑病》[13]，病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級病葉數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）×100，防治效果（%）＝[1-（空白對照區(qū)藥前病情指數(shù)×處理區(qū)藥后病情指數(shù)）/（空白對照區(qū)藥后病情指數(shù)×處理區(qū)藥前病情指數(shù)）]×100。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 和Excel軟件，采用Duncan新復(fù)極差法檢驗處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防細菌的篩選和初步鑒定

從采集的36份土樣中共計分離到549株細菌。以水稻細菌性條斑病菌Rs105菌株為靶標(biāo)菌，通過平板對峙試驗發(fā)現(xiàn)有20株細菌對Rs105具有顯著的拮抗效果（拮抗圈直徑≥2 cm），16S rDNA鑒定結(jié)果顯示有10株屬于芽胞桿菌，其中菌株ST15的拮抗活性最高，拮抗圈直徑為（2.88±0.06）cm（表1）。

2.2 菌株ST15的鑒定

在NA平板上，菌株ST15單菌落為乳白色，扁平，圓形或近圓形，直徑1.0～3.0 mm，菌落表面皺縮，邊緣整齊（圖1A）；挑取24 h的培養(yǎng)物，利用透射電鏡進行觀察，菌體為桿狀，直徑約0.5～0.6 μm，長度約1.5～2.0 μm（圖1B）；挑取48 h的培養(yǎng)物，利用透射電鏡進行觀察，菌體大部分轉(zhuǎn)化為芽胞，芽胞呈梭狀，直徑約0.5～0.6 μm，長度約1.0～1.5 μm（圖1C）。利用Biolog系統(tǒng)測定的生理生化結(jié)果表明，革蘭氏染色陽性，接觸酶和氧化酶均為陰性，能夠利用明膠、果膠、蔗糖、D-甘露醇等，不能利用α-D-乳糖、L-乳酸、D-蘋果酸等，耐受8% NaCl（表2）。對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[14]，ST15具有高地芽胞桿菌的生理生化特性。

表2 菌株ST15的理化試驗分析結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characters of strain ST15

以菌株 ST15的基因組 DNA為模板，擴增的gyrB基因片段為 930 bp，并提交到了 NCBI數(shù)據(jù)庫（Genebank：OM575083）?；讷@得的gyrB基因序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列，利用MEGA 7.0軟件對菌株ST15進行進化樹分析，結(jié)果表明該菌株與高地芽胞桿菌Bacillus altitudinisSCU11聚合在一起（圖2）。綜合上述試驗結(jié)果，生防菌株ST15應(yīng)為高地芽胞桿菌。

圖2 基于gyrB基因序列的菌株ST15系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic tree of strain ST15 based on the partial sequence ofgyrBgene

2.3 菌株ST15的抑菌譜測定結(jié)果分析

通過平板對峙試驗發(fā)現(xiàn)，菌株ST15對水稻黃單胞菌表現(xiàn)較強拮抗活性，其中ST15對7株水稻白葉枯病菌菌株（YN24、FUJ、SCYC-6、YN7、GD414、YN1、PXO99）的拮抗圈直徑為 2.65～3.97 cm，對 6株水稻細菌性條斑病菌菌株（Rs105、Xoc-192、Xoc-197、Xoc-S、Xoc-M、Xoc-W）的拮抗圈直徑為1.50～2.93 cm。同時，發(fā)現(xiàn)ST15對梨火疫病菌LHY和野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xcc表現(xiàn)一定的拮抗活性，但對其他病原細菌的拮抗活性很弱（圖3）。

圖3 菌株ST15對21株病原細菌的拮抗活性測定Fig. 3 Determination of antibacterial activity of strain ST15 against 21 pathogens

2.4 菌株ST15無菌濾液的抑菌活性

拮抗試驗表明，菌株ST15的無菌發(fā)酵濾液、1 mg/mL噻唑鋅和10 μg/mL噻霉酮溶液對水稻白葉枯病菌POX99和水稻細菌性條斑病菌Rs105均具有拮抗活性，其中ST15無菌發(fā)酵濾液對POX99的拮抗圈直徑為（2.35±0.05）cm，分別是1 mg/mL噻唑鋅溶液和10 μg/mL噻霉酮溶液的1.64和1.52倍；ST15無菌發(fā)酵濾液對Rs105產(chǎn)生的拮抗圈直徑為（2.08±0.13）cm，分別是1 mg/mL噻唑鋅溶液和10 μg/mL噻霉酮溶液的1.54和1.32倍（圖4）。

圖4 菌株ST15無菌濾液、噻唑鋅與噻霉酮對水稻黃單胞菌的拮抗活性測定Fig. 4 The antagonistic activity of ST15 sterile filtrate, zinc thiazole and benziothiazolinone againstX.oryzae

2.5 菌株ST15次生代謝抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性

與未處理的對照相比， ST15產(chǎn)生的次生代謝拮抗活性物質(zhì)對熱處理（30 ℃～100 ℃）、酸堿（pH 3.0～11.0）和紫外光照射均表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性（圖5A、B、D）。另外，胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理也不影響ST15無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性（圖5C）。

圖5 溫度、蛋白酶、pH和紫外光對菌株ST15 無菌濾液抗菌活性的影響Fig. 5 Effects of temperature, protease, pH and UV on antibacterial activity of ST15 sterile filtrate

2.6 菌株ST15對水稻幼苗的促生作用

與清水對照相比，ST15菌懸液處理不影響水稻種子的發(fā)芽率，但對水稻根和幼苗具有顯著的促生作用。ST15菌懸液處理種子72 h后，水稻根長為（3.34±0.69）cm，較對照增長了30.47%，對根具有極顯著促生作用（P＜0.01）；ST15 菌懸液處理的水稻芽長為（1.61±0.39 cm），較對照增長了6.62%。ST15菌懸液處理種子7 d后，幼苗根系較對照濃密，并且開始有葉片展開，多處于1葉或1葉1心期，而對照處理的水稻還未有葉片展開（圖6）。

圖6 菌株ST15對水稻的促生效果Fig. 6 Growth-promoting effect of strain ST15 on rice

2.7 菌株ST15對3種化學(xué)殺菌劑的耐受性

試驗結(jié)果表明，相較于水稻細菌性條斑病菌菌株Rs105，生防菌株ST15對3種化學(xué)殺菌劑表現(xiàn)較強的耐受性；除三氯異氰尿酸外，各個濃度的 ST15在噻霉酮和噻唑鋅平板上均能生長，這表明菌株 ST15可與化學(xué)殺菌劑聯(lián)合使用（圖7）。

圖7 菌株ST15對三種化學(xué)農(nóng)藥的耐受性Fig. 7 Tolerance of strain ST15 to three chemical pesticides

2.8 菌株ST15生防菌劑對水稻細菌性條斑病的防控效果

田間試驗結(jié)果表明（表3），連續(xù)施藥兩次，ST15生防菌劑10和15 L/hm2劑量處理的防效分別為（55.05±4.67）%和（63.51±3.28）%，高劑量處理與化學(xué)藥劑3%噻霉酮懸浮劑的防效相近，3個處理之間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 生防菌劑ST15對水稻細菌性條斑病的田間防效Table 3 Control effect of ST15 biocontrol agent on rice bacterial leaf streak in field

3 討論

本研究從梨樹根際土壤分離篩選到1株高地芽胞桿菌ST15，其對水稻黃單胞菌具有較強的拮抗活性，對野油菜黃單胞菌野油菜致病變種和梨火疫病菌也表現(xiàn)一定的拮抗活性，但是對測試的其他6種病原細菌拮抗活性很弱，對前期試驗測定的多種病原真菌也不具有拮抗活性。近期，黃夢桑等[15]從辣椒根際篩選的高地芽胞桿菌181-7對水稻黃單胞菌具有較強的特異性拮抗活性，對測定的其他病原細菌和病原真菌的拮抗活性很弱，與ST15的細菌拮抗譜存在差異，兩者對真菌拮抗活性均很弱。但Sunar等[6]從雪蓮根際分離到的高地芽胞桿菌BRHS/S-73對白絹病菌、瓜亡革菌、菜豆根腐病菌和立枯絲核菌等病原真菌均具有較好的拮抗活性。這說明來源不同的高地芽胞桿菌株系間的抗菌譜和抑菌機制存在差異。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，盡管ST15對不同來源和致病力的水稻細菌性條斑病菌和水稻白葉枯病菌菌株均表現(xiàn)較強的拮抗活性，但病原菌菌株間對ST15的敏感性存在差異，菌株ST15對強致病力株系Xoc-S和中等致病力株系Xoc-M的拮抗活性顯著強于弱致病力株系Xoc-W（P＜0.05），并且ST15對水稻白葉枯病菌菌株的整體抑制活性強于水稻細菌性條斑病菌。

相比化學(xué)農(nóng)藥，芽胞桿菌生物農(nóng)藥的持效期長，但速效性差。將芽胞桿菌與化學(xué)殺菌劑交替或混合使用可以提高對作物病害的綜合防治效果，減少化學(xué)農(nóng)藥用量。吉沐祥等[16]將枯草芽胞桿菌B.subtilisDJ-6與吡唑醚菌酯混合使用，用于防治草莓枯萎病，防效良好且穩(wěn)定。本研究測定了菌株ST15對3種主要的化學(xué)殺細菌劑的耐受性，發(fā)現(xiàn)相較于水稻細菌性條斑病菌，菌株ST15對3種化學(xué)農(nóng)藥均表現(xiàn)較強的耐受性，這使得該菌可以與化學(xué)殺菌劑聯(lián)合使用[17]。菌株ST15與化學(xué)農(nóng)藥的交替及混合使用技術(shù)還需要進一步的研究，以便為該菌株的田間應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

生防菌通過產(chǎn)生各種抗菌活性物質(zhì)來達到抑菌目的，而抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性是影響生防菌株成功開發(fā)應(yīng)用的關(guān)鍵因素。眾所周知，芽胞桿菌能夠合成并分泌特有的抗菌物質(zhì)，在芽胞桿菌防控植物病害方面發(fā)揮重要作用，主要包括脂肽類化合物、聚酮類化合物和多肽類化合物[18]。已有大量研究顯示，脂肽類化合物的理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，對氯仿等有機溶劑有一定的耐受力，抗紫外線，對蛋白酶類的處理不敏感[19-21]。本研究生防菌株ST15的無菌發(fā)酵濾液對水稻黃單胞菌的拮抗活性顯著強于兩種濃度的化學(xué)藥劑，并且對高溫、蛋白酶、酸堿（pH 3.0～11.0）及紫外光處理均表現(xiàn)較好穩(wěn)定性。由此推測，菌株ST15產(chǎn)生的拮抗活性物質(zhì)可能是脂肽類化合物，其抗菌活性物質(zhì)有待進一步分離鑒定。

芽胞桿菌除了具有抑制病原菌的能力，還具有促進植物生長的特性。早先的研究報道，芽胞桿菌通過產(chǎn)生細胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶、鐵載體、吲哚-3-乙酸(IAA)、磷增溶和固氮來促進植物生長[22-24]。Goswami和Deka[7]發(fā)現(xiàn)高地芽胞桿菌MS16對芥菜幼苗的生長有促生作用，包括種子發(fā)芽率、幼苗活力、根長和地上部干鮮重。Wang等[24]觀察到，接種產(chǎn)ACC脫氨酶的芽胞桿菌能顯著促進辣椒幼苗的生長。本研究發(fā)現(xiàn)菌株ST15對水稻有一定的促生作用，經(jīng)菌株ST15處理過的水稻的根長顯著增長，根系更加茂密。這表明菌株ST15還具有作為生物肥料開發(fā)的巨大潛力，不過其促生機制尚不明確，有待進一步研究。

張榮勝等[25]分離得到的解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciensLX-11在大面積示范試驗中對水稻細菌性條斑病的防效達60.2%，基于LX-11研制的水劑“葉斑寧”獲得正式農(nóng)藥產(chǎn)品登記，目前已經(jīng)大面積應(yīng)用于生產(chǎn)。黃夢桑等[15]的盆栽試驗表明，高地芽胞桿菌181-7對水稻細菌性條斑病的預(yù)防效果為59.52%。本研究篩選的高地芽胞桿菌ST15對水稻細菌性條斑病菌的田間試驗防治效果為（63.51±3.28）%，與LX-11和181-7的防效相近，并且與化學(xué)殺菌劑3%噻霉酮懸浮劑的防效相當(dāng)。這些結(jié)果表明，ST15在生產(chǎn)上具備防治水稻細菌性病害的能力，具有良好的應(yīng)用開發(fā)潛力。目前，關(guān)于ST15生防菌劑研究工作仍在進行中，后期還需對ST15的發(fā)酵體系進行優(yōu)化，從而提高菌體密度、芽胞產(chǎn)率和拮抗活性物質(zhì)的產(chǎn)量；建立ST15生防菌劑的田間應(yīng)用技術(shù)，進一步提高其對水稻細菌性條斑病等細菌病害的防治效果。