皮爾瑞俄類芽胞桿菌ZF390對黃瓜細(xì)菌性軟腐病的防治效果

趙昱榕，謝學(xué)文，許 帥，謝 華，石延霞，柴阿麗，李 磊*，李寶聚*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院/北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100089）

近年來，隨著設(shè)施黃瓜栽培面積不斷擴(kuò)大，黃瓜細(xì)菌性病害的發(fā)生連年嚴(yán)重，由巴西果膠桿菌Pectobacterium brasiliense（Pbr）引起的黃瓜細(xì)菌性軟腐病已經(jīng)得到越來越多人的重視[1]。Pbr侵染黃瓜在我國于 2017年首次報(bào)道，該病害具有發(fā)病速度快、發(fā)病程度重、寄主范圍廣、難以防治等特點(diǎn)，病害發(fā)生后可導(dǎo)致黃瓜大面積減產(chǎn)甚至絕收，嚴(yán)重制約我國黃瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2,3]。已有研究表明，化學(xué)農(nóng)藥不能完全有效地控制住軟腐病的發(fā)生，因此亟需尋找其他安全有效的防治方法，保障黃瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展[4-8]。生物防治成為目前的研究熱點(diǎn)，近年來具有生防作用的類芽胞桿菌Paenibacillus被不斷發(fā)現(xiàn)，除了報(bào)道較多的多粘類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa[9-12]以外，還有Paenibacillus ehimensis[13,14]、Paenibacillus jamilae[15]、Paenibacillus xylanexedens[16]、Paenibacillus alvei[17,18]、Paenibacillus yonginensis[19]、Paenibacillus wenxiniae[20]、Paenibacillus elgii[21]、Paenibacillus lentimorbus[22]、Paenibacillus terrae[23]、Paenibacillus kribbensis[24]和Paenibacillus triticisoli[25]等。通過離體試驗(yàn)、溫室試驗(yàn)和田間試驗(yàn)的測定，樹狀類芽胞桿菌Paenibacillus dendritiformis菌株C454被證明對由胡蘿卜果膠桿菌Pectobacterium carotovorum在馬鈴薯上引起的軟腐病具有一定的生防能力[26]。然而到目前為止，防治果膠桿菌的生防報(bào)道還十分有限。已有一些皮爾瑞俄類芽胞桿菌Paenibacillus peoriae菌株被發(fā)現(xiàn)具有生防作用，菌株NRRL BD-62具有較廣的抑菌譜，且拮抗物質(zhì)穩(wěn)定性較高[27]；菌株P(guān)a86對馬鈴薯青枯病具有較好的拮抗作用[28]；菌株RhAn32能夠有效抑制尖孢鐮孢菌的生長并具有促生作用[29]。本研究以活體防效為基準(zhǔn)篩選黃瓜細(xì)菌性軟腐病高效生防菌株，以期實(shí)現(xiàn)黃瓜細(xì)菌性軟腐病的有效防治，并為生防菌劑的進(jìn)一步研發(fā)和生防機(jī)理的深度探究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試病原菌 野油菜黃單胞野油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestris菌株GL2018042302、丁香假單胞桿菌番茄致病變種Pseudomonas syringaepv.tomatoFQ2017062301、丁香假單胞流淚致病變種Pseudomonas syringaepv.lachrymansHG2019081305、密執(zhí)安棒桿菌馬鈴薯環(huán)腐亞種Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicumMLS2020031402、密執(zhí)安棒桿菌密執(zhí)安亞種Clavibacter michiganensissubsp.michiganensisFQ2017052303、巴西果膠桿菌Pectobacterium brasilienseHG2015010904、葡萄土壤桿菌Agrobacterium vitisPT2016061503、西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulliTG2019080401，以上病原菌均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分離保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1000 mL。NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL。WA培養(yǎng)基：瓊脂4 g，蒸餾水1000 mL。初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 1 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

1.2 土壤樣品中菌株的分離純化

將 10 g山西省晉中市和順縣黃瓜細(xì)菌性軟腐病發(fā)生嚴(yán)重地塊中的健康黃瓜植株根際土壤樣品充分懸浮于90 mL無菌水中，梯度稀釋后吸取100 μL懸浮液均勻涂布于LB平板，28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取形態(tài)不同的細(xì)菌菌落進(jìn)行純化。

1.3 黃瓜細(xì)菌性軟腐病生防菌株的篩選

1.3.1 病原菌拮抗菌株的離體篩選 采用雙層培養(yǎng)法[30]測定全部菌株。將菌株單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，用空白LB液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌懸液濃度至OD600值為0.8，吸取5 μL菌懸液接種至PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)24 h后，用3 mL氯仿熏蒸12 h。將巴西果膠桿菌單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，用空白NB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌懸液濃度至OD600值為0.8，在5 mL WA培養(yǎng)基中均勻混入100 μL病原菌菌懸液，倒入平板平鋪至PDA上層，晾干后28 ℃培養(yǎng)24 h。每處理3次重復(fù)，若待測菌株菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則表明該菌株對黃瓜細(xì)菌性軟腐病菌具有拮抗作用，為拮抗菌株。

1.3.2 病害生防菌株的活體篩選 采用噴霧法測定拮抗菌株對黃瓜細(xì)菌性軟腐病的活體防效，篩選高效生防菌株。將200 mL的OD600值為0.8的病原菌菌懸液噴霧接種于15株一葉一心時(shí)期的健康新泰密刺黃瓜幼苗上，溫度28 ℃、相對濕度75%保持24 h后，噴霧接種300 mL OD600值為0.8的拮抗菌株菌懸液100倍液，以接種等體積的3%中生菌素可濕性粉劑650倍液為藥劑處理，接種蒸餾水為對照處理。每處理 3次重復(fù)。待空白對照完全發(fā)病后，調(diào)查病情指數(shù)并計(jì)算防效。病級分類標(biāo)準(zhǔn)參考李磊[31]的研究，0級：無病斑；1級：病斑面積占整個(gè)葉面積的5%以下；2級：病斑面積占整個(gè)葉面積的6%～25%；3級：病斑面積占整個(gè)葉面積的26%～50%；4級：病斑面積占整個(gè)葉面積的51%～75%；5級：病斑面積占整個(gè)葉面積的 75%以上。病情指數(shù)＝100×∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)的代表值）/（總?cè)~數(shù)×最高級數(shù)的代表值），防效（%）＝100×（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)。

1.4 菌株ZF390的鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)及生理生化特性 將菌株ZF390劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)，并利用透射電鏡和掃描電鏡觀察菌體形態(tài)。依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[32]對其生理生化特征進(jìn)行鑒定，并使用BIOLOG GENE Ⅲ試劑盒進(jìn)行唯一碳源利用的測定。

1.4.2 多位點(diǎn)序列分型（MLST）分析 收集菌體送至北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行全基因組測序，將序列上傳至NCBI后，根據(jù)注釋信息，下載不同類芽胞桿菌菌種模式菌株的16S rDNA (IAQ67_00050)、gyrB(IAQ67_00030)、rpoD(IAQ67_19485)、rho(IAQ67_00730)、rpsA(IAQ67_17705) 基因序列，用 MEGA 7.0、Sequence Matrix、Seaview 4.0軟件按順序比對、裁剪、連接、轉(zhuǎn)換格式后，利用MEGA 7.0軟件最大似然法，設(shè)置自舉重復(fù)數(shù)為1000次，構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株ZF390細(xì)菌抑菌譜的測定

試驗(yàn)方法同1.3.1，下層接種菌株ZF390菌懸液，上層接種不同病原細(xì)菌菌懸液，以不接種菌株ZF390作為對照，每處理3次重復(fù)，測定其細(xì)菌抑菌譜，根據(jù)抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率（%）＝100×抑菌圈直徑/對照平板直徑。

1.6 菌株ZF390搖瓶發(fā)酵工藝的優(yōu)化

1.6.1 種子液的活化與發(fā)酵液生物量的測定 將菌株ZF390單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，用空白LB液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌懸液濃度至OD600值為0.6，制成種子液。發(fā)酵液的生物量以菌體濃度表示，梯度稀釋搖培24 h后的發(fā)酵液至適當(dāng)濃度，吸取100 μL菌懸液均勻涂布于LB平板，28 ℃培養(yǎng)2 d，根據(jù)平板上的菌落數(shù)計(jì)算菌體濃度，每處理3次重復(fù)。菌體濃度（CFU/mL）＝平板上的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.6.2 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化 將種子液以2%（v/v）的接種量接種至裝液量為100 mL/250 mL的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。采用單因素法測定同等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳源（葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉和糊精）、氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、水溶性黃豆餅粉、水溶性棉籽餅粉、水溶性花生餅粉、發(fā)酵專用豆粕粉和發(fā)酵用玉米漿干粉）和無機(jī)鹽（NaCl、KCl、CaCl2、K2HPO4、CaSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O 和 MgSO4·7H2O）對菌株 ZF390 菌體濃度的影響。采用爬坡試驗(yàn)（最適碳源和氮源濃度分別設(shè)定為10、20、30、40和50 g/L，最適無機(jī)鹽濃度設(shè)定為0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 g/L）和三因素三水平正交試驗(yàn)（最適碳源和氮源濃度設(shè)定為5、10和15 g/L，最適無機(jī)鹽濃度設(shè)定為1.0、1.2和1.4 g/L）確定碳源、氮源和無機(jī)鹽的最佳添加量。

1.6.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化 采用單因素法依次篩選不同培養(yǎng)溫度（25 ℃、28 ℃、32 ℃、35 ℃、37 ℃和40 ℃）、初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）、裝液量（50、100、150和200 mL/250 mL）、種子液接種量（1%、2%、3%、4%和5%（v/v））和轉(zhuǎn)速（150、180、210和240 r/min）對菌株ZF390菌體濃度的影響，最終確定最適發(fā)酵條件。

1.6.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化前后的比較 分別利用初始發(fā)酵工藝和優(yōu)化后的發(fā)酵工藝對菌株 ZF390進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每4 h測定一次發(fā)酵液的菌體濃度，連續(xù)測定48 h，繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜細(xì)菌性軟腐病生防菌株的篩選

從16份根際土壤中分離純化出155株細(xì)菌菌株。經(jīng)過離體平板測定后，篩選得到6株對黃瓜細(xì)菌性軟腐病菌有抑制作用的拮抗菌株，并對其進(jìn)行編號ZF388～ZF393，其中菌株ZF388、ZF389和ZF391的抑菌圈直徑均在5.5 cm以上，菌株ZF388產(chǎn)生的抑菌圈最大，顯著大于其他菌株產(chǎn)生的抑菌圈，直徑為6.18 cm，而菌株ZF390、ZF392和ZF393的抑菌圈直徑不足2.5 cm（表1，圖1）。為得到更加有利于田間應(yīng)用的菌株資源，利用活體盆栽試驗(yàn)測定6株拮抗菌株對黃瓜細(xì)菌性軟腐病的防治效果，篩選高效生防菌株，對照處理的黃瓜幼苗在接種病原菌48 h后全部發(fā)病，幾乎所有葉片上均出現(xiàn)軟腐癥狀，發(fā)病嚴(yán)重的植株莖部軟爛、折斷，整株死亡，經(jīng)菌株ZF390處理過的植株莖部未發(fā)病，葉片上的病斑變干不再向外擴(kuò)展，生長點(diǎn)可繼續(xù)正常生長，防效達(dá)77.94%，顯著高于其他拮抗菌株和對照藥劑中生菌素的防效（表1，圖2）。通過上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)拮抗菌株在離體條件下的抑菌圈直徑和在活體條件下的防治效果無顯著的相關(guān)性，本研究利用離體平板先篩選出對病原菌具有抑制作用的拮抗菌株，再通過活體盆栽確定能夠有效防治該病害的生防菌株，以獲得能夠適用于田間應(yīng)用的資源，結(jié)合以上結(jié)果選擇菌株ZF390為后續(xù)試驗(yàn)對象。

表1 六株拮抗菌株對黃瓜細(xì)菌性軟腐病的防治作用Table 1 Inhibitory effect of six antagonistic strains against cucumber bacterial soft rot

圖1 黃瓜細(xì)菌性軟腐病拮抗菌株對病原菌的抑制作用Fig. 1 Inhibition of cucumber bacterial soft rot antagonistic strains onPbr

圖2 拮抗菌株對黃瓜細(xì)菌性軟腐病活體盆栽防效Fig. 2 Control effect of antagonistic strains on cucumber bacterial soft rot in greenhouse

2.2 菌株ZF390的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌株ZF390在LB平板上28 ℃條件下培養(yǎng)時(shí)生長速度較慢，菌體與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，用接種環(huán)不易挑起，淡黃色，有特殊氣味，單菌落較小，為邊緣不規(guī)則的圓形，表面不光澤，中心處相對邊緣顏色較白，但不隆起；菌體為橢圓形桿狀、飽滿、表面略微凹凸不平，長2～4 μm、寬0.5～1 μm，周生多根鞭毛（圖3）。

圖3 菌株ZF390形態(tài)學(xué)特征Fig. 3 Morphology of strain ZF390

2.2.2 生理生化特性 如表2所示，菌株ZF390酪蛋白水解反應(yīng)為陽性，精氨酸水解酶、吲哚產(chǎn)生、明膠液化、硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性；可以利用甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、甲基木糖苷、D-果糖、甘露醇、甲基-D-甘露糖苷、水楊苷、麥芽糖、龍膽二糖、D-松二糖、N-乙酰葡糖胺，不能利用D-阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、D-海藻糖、2-酮基-D-葡糖酸鹽、5-酮基-D-葡糖酸鹽、鼠李糖。

2.2.3 MLST分析 分析多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株ZF390（登錄號CP061172.1）與皮爾瑞俄類芽胞桿菌P. peoriae模式菌株KCTC 3763T的親緣關(guān)系最近（圖4）。結(jié)合形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)、BIOLOG唯一碳源利用特性和MLST分析結(jié)果，確定菌株ZF390為皮爾瑞俄類芽胞桿菌。

圖4 菌株ZF390多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on the multigene sequences of strain ZF390

2.3 菌株ZF390細(xì)菌抑菌譜的測定

經(jīng)測定，菌株ZF390對8種病原細(xì)菌的生長均有抑制作用（表3），具有廣譜抑菌活性，對野油菜黃單胞野油菜致病變種和丁香假單胞流淚致病變種的抑制率顯著高于對其他病原細(xì)菌的抑制率。

表3 菌株ZF390細(xì)菌抑菌譜Table 3 The antagonistic effects of strain ZF390 against various pathogenic bacteria

2.4 菌株ZF390搖瓶發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化 經(jīng)測定，以乳糖為碳源的發(fā)酵液菌落數(shù)最高，為1.05×107CFU/mL（圖5A）；以酵母粉為氮源的發(fā)酵液菌落數(shù)最高，為8.81×108CFU/mL（圖5B）；以MgSO4·7H2O為無機(jī)鹽的發(fā)酵液菌落數(shù)最高，為1.62×109CFU/mL（圖5C），菌株ZF390搖瓶發(fā)酵的最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽確定為乳糖、酵母粉和MgSO4·7H2O。測定不同乳糖濃度、酵母粉濃度和MgSO4·7H2O濃度對發(fā)酵液菌落數(shù)的影響，乳糖濃度為10 g/L的發(fā)酵液菌落數(shù)最高，為1.21×109CFU/mL（圖5D）；酵母粉濃度為10 g/L的發(fā)酵液菌落數(shù)最高，為9.11×108CFU/mL（圖5E）；MgSO4·7H2O濃度為1.2 g/L的發(fā)酵液菌落數(shù)最高，為8.33×108CFU/mL（圖5F）。根據(jù)爬坡試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)置三因素三水平正交試驗(yàn)，結(jié)果表明影響發(fā)酵液菌落數(shù)因素的順序?yàn)槿樘牵窘湍阜郏綧gSO4·7H2O，發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分為乳糖 15 g/L，酵母粉 10 g/L和MgSO4·7H2O 1.2 g/L（表4）。

圖5 菌株ZF390發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of strain ZF390 fermentation medium

表4 正交試驗(yàn)中的因素及水平Table 4 Factors and levels in orthogonal test

2.4.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化 經(jīng)測定，菌株ZF390在28 ℃時(shí)發(fā)酵液菌落數(shù)顯著高于其他溫度的發(fā)酵液菌落數(shù)，為1.47×109CFU/mL（圖6A）；在pH 7.0時(shí)發(fā)酵液菌落數(shù)顯著高于其他pH發(fā)酵的發(fā)酵液菌落數(shù)，為2.20×109CFU/mL（圖6B）；裝液量為50 mL時(shí)發(fā)酵液菌落數(shù)顯著高于其他裝液量發(fā)酵的發(fā)酵液菌落數(shù)，為1.77×109CFU/mL（圖6C）；接種量為3%時(shí)發(fā)酵液菌落數(shù)顯著高于其他種子液接種量發(fā)酵的發(fā)酵液菌落數(shù)，為2.27×109CFU/mL（圖6D）；轉(zhuǎn)速為240 r/min時(shí)發(fā)酵液菌落數(shù)顯著高于其他轉(zhuǎn)速發(fā)酵的發(fā)酵液菌落數(shù)，為2.26×109CFU/mL（圖6E）。菌株ZF390最適發(fā)酵條件為溫度：28 ℃；pH：7.0；裝液量：50 mL/250 mL；種子液接種量：3%（v/v）；轉(zhuǎn)速：240 r/min。

圖6 菌株ZF390發(fā)酵條件的優(yōu)化Fig. 6 Optimization of strain ZF390 fermentation conditions

2.4.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化前后的比較 經(jīng)測定，無論以何種方式進(jìn)行發(fā)酵，接種種子液后，菌株ZF390的生長直接進(jìn)入對數(shù)期，大致在20～24 h時(shí)對數(shù)期結(jié)束；以優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，菌株ZF390在對數(shù)期后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體濃度基本保持不變，在36 h時(shí)濃度最大，為2.94×109CFU/mL，而以初始發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵的發(fā)酵液菌體濃度快速回落，發(fā)酵進(jìn)入衰退期，在24 h時(shí)濃度最大，為1.45×105CFU/mL（圖7）。

圖7 菌株ZF390不同發(fā)酵工藝生長曲線Fig. 7 Growth curve of strain ZF390 under different fermentation conditions

3 討論

我國黃瓜細(xì)菌性軟腐病多由巴西果膠桿菌引起[4]，該病害主要在拱棚、育苗場等地發(fā)生，重病拱棚中能造成黃瓜至少50%的減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致黃瓜絕產(chǎn)[33]。生物防治具有安全、有效、無殘留等特點(diǎn)，具備可持續(xù)、環(huán)保、簡便與低能耗等技術(shù)優(yōu)勢，是保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和糧食生產(chǎn)的有效措施，更是降低化學(xué)農(nóng)藥使用量，保障蔬菜水果和大宗農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)的根本手段[34]。目前，不僅鮮有針對黃瓜細(xì)菌性軟腐病生防制劑的相關(guān)研究，市場上防治細(xì)菌病害的化學(xué)殺菌劑對該病害的防治效果也均不理想[35]。因此，篩選黃瓜細(xì)菌性軟腐病高效生防菌株，同時(shí)為開發(fā)防治該病害的生防制劑提供菌種資源和數(shù)據(jù)支持具有重要意義。

拮抗細(xì)菌的分離多來源于土壤，從病原菌寄主植物病健植株生境分離拮抗細(xì)菌是常見方法，絕大部分研究是通過離體對峙培養(yǎng)的方法篩選拮抗細(xì)菌，但越來越多的研究表明，離體條件下細(xì)菌抑制病原菌的能力與其在植株活體上抑制此病原菌引起的病害不存在普遍的相關(guān)性，因此在培養(yǎng)基上產(chǎn)生最大抑菌圈的菌株并不一定是最好的生防因子，并且這些菌株通常無法表現(xiàn)出較好的田間防效[36]。本研究先利用雙層培養(yǎng)法離體篩選對黃瓜細(xì)菌性軟腐病菌具有抑制作用的拮抗細(xì)菌，再采用活體盆栽試驗(yàn)測定拮抗細(xì)菌在黃瓜幼苗上對病害的防治效果，以活體防效作為菌株生防效果的最終評價(jià)指標(biāo)，篩選得到黃瓜細(xì)菌性軟腐病高效生防菌株ZF390。該菌株雖在離體條件下的抑菌圈直徑僅有1.37 cm，但其對黃瓜細(xì)菌性軟腐病的治療效果為77.94%，顯著高于其他拮抗菌株和對照藥劑的防效；且該菌株具有廣譜的抑菌活性，對8種病原細(xì)菌均有不同程度的抑制作用。菌株ZF390在離體和活體條件下表現(xiàn)出抑菌差異的原因仍需進(jìn)一步的深入研究，這可能是該菌株的主要生防機(jī)理。

本研究對菌株ZF390進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和生理生化測定，值得注意的是菌株ZF390與皮爾瑞俄類芽胞桿菌KCTC 3763T的生理生化測定結(jié)果存在些許不同，表現(xiàn)在明膠液化和D-松二糖酵解方面，Heyndrickx等[37]指出了不同的皮爾瑞俄類芽胞桿菌菌株間可能存在不同的明膠液化能力的區(qū)別，但 D-松二糖的酵解能力還仍需進(jìn)一步探究。利用16S rDNA序列和4個(gè)看家基因gyrB、rpoD、rho、rpsA構(gòu)建菌株ZF390多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行MLST分析，結(jié)果表明菌株ZF390與皮爾瑞俄類芽胞桿菌KCTC 3763T的親緣關(guān)系十分接近，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，鑒定菌株ZF390為皮爾瑞俄類芽胞桿菌。

Messa[38]指出，生防菌株的作用機(jī)制不論是從社會(huì)和人類健康的角度還是從環(huán)境的角度都具有重要的研究意義，隨著生物防治市場前景的不斷擴(kuò)大，分離篩選生防菌株并開發(fā)安全有效的微生物菌劑亟需進(jìn)行更加深入的探索。生防菌株的發(fā)酵工藝優(yōu)化是其從實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)到規(guī)?；a(chǎn)的第一步，也是最重要的一步。本研究以發(fā)酵液的菌體濃度作為評價(jià)指標(biāo)，對其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)酵液菌體濃度由優(yōu)化前的1.45×105CFU/mL提升至2.94×109CFU/mL，顯著提高了4個(gè)數(shù)量級。本研究中只對菌株ZF390的搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行了初步的優(yōu)化，未來大規(guī)模發(fā)酵的參數(shù)調(diào)整需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)，目前該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基成本較高，可能需要利用底物水解技術(shù)結(jié)合代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和穩(wěn)定性等多方面綜合優(yōu)化其發(fā)酵工藝。目前有關(guān)皮爾瑞俄類芽胞桿菌防治植物病害的報(bào)道還非常少，在中國大多是關(guān)于皮爾瑞俄類芽胞桿菌用于防治真菌病害的報(bào)道[39-41]，本研究中獲得的菌株ZF390能夠有效防治細(xì)菌病害，在活體植株上對黃瓜細(xì)菌性軟腐病發(fā)揮了良好的防治作用，該菌種資源具備進(jìn)一步開發(fā)成生防制劑的潛力。