枯草芽胞桿菌HMB19198在番茄葉片上定殖能力的分子檢測(cè)

劉曉萌，蘇振賀，宣立峰，王培培，董麗紅，郭慶港*，馬 平

（1. 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000；2. 河北省農(nóng)林科學(xué)院石家莊果樹研究所，石家莊 050061）

由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起的番茄灰霉病在設(shè)施栽培環(huán)境下發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重，成為制約設(shè)施番茄健康發(fā)展的主要障礙[1,2]。由于缺乏抗病品種，目前化學(xué)殺菌劑依然是防治番茄灰霉病的主要措施[3]，但長(zhǎng)期大量的施用化學(xué)殺菌劑容易引起病原菌產(chǎn)生抗藥性[4]。目前已有報(bào)道表明，灰葡萄孢菌對(duì)嘧霉胺表現(xiàn)高抗，對(duì)腐霉利、咯菌腈的抗性也在逐年提高[5]?？顾幮跃甑某霈F(xiàn)降低了化學(xué)殺菌劑的防治效果，因此，農(nóng)民不得不頻繁、大量地施用化學(xué)殺菌劑，由此所帶來(lái)的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染問(wèn)題日益嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)外研究證明，微生物殺菌劑是防治作物病害行之有效和環(huán)境友好的措施之一[6]。針對(duì)番茄灰霉病，目前國(guó)內(nèi)外已獲得一些具有開發(fā)前景的生防菌株。地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformisW10菌株和多粘類芽胞桿菌Bacillus polymyxaW3菌株不僅對(duì)灰霉菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，同時(shí)能有效防治番茄灰霉病[7]。Lee等[8]以地衣芽胞桿菌B. licheniformisN1為活性成分，研制了不同的微生物制劑，發(fā)現(xiàn)可濕性粉劑能更好的發(fā)揮防治番茄灰霉病的效果。生防菌防治作物氣傳病害的機(jī)制包括產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)直接殺死或抑制病原菌生長(zhǎng)；通過(guò)占據(jù)葉面的氣孔或營(yíng)養(yǎng)位點(diǎn)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)空間和營(yíng)養(yǎng)；誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性等[9]。張玉勛等[10]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌M9在番茄葉片上的定殖能力較強(qiáng)，對(duì)灰霉病的防效較高，而定殖能力較差的M11和M15菌株則防效較差。由此可見，生防菌在植物組織上的定殖能力成為其防治灰霉病的重要機(jī)制之一[11]，因此有必要對(duì)生防菌在葉面的定殖數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。以往主要通過(guò)抗生素馴化結(jié)合菌落計(jì)數(shù)法對(duì)靶標(biāo)微生物進(jìn)行定量檢測(cè)，但該方法所需時(shí)間長(zhǎng)，并且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[12]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（Real-time PCR）的出現(xiàn)，使得定量檢測(cè)不同環(huán)境中的微生物數(shù)量成為可能，目前熒光定量PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分子檢測(cè)[13]。熒光定量PCR技術(shù)分為熒光染料法（SYBR）和TaqMan探針?lè)ǎ笳叩撵`敏度和特異性更高。楊健等[14]根據(jù)芽胞桿菌gyrB基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用熒光定量PCR技術(shù)開展了牛乳中蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus的定量檢測(cè)。Scortichini等[15]根據(jù)16S rDNA序列設(shè)計(jì)了針對(duì)榛黃假單胞菌Pseudomonas avellanae的特異性引物和探針，建立了榛黃假單胞菌P avellanae的定量檢測(cè)體系，開展了該病原細(xì)菌在榛子樹上的定殖檢測(cè)。目前的研究多針對(duì)某個(gè)屬或者種的微生物進(jìn)行定量檢測(cè)，但針對(duì)某個(gè)特定菌株開展定量檢測(cè)的報(bào)道較少，主要原因是缺乏針對(duì)特定菌株的特異性引物或探針。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的微生物公布了全基因組序列。通過(guò)對(duì)靶標(biāo)微生物全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，可獲得靶標(biāo)微生物的特異性基因序列，據(jù)此可獲得針對(duì)靶標(biāo)微生物的特異性引物或探針[8]。

枯草芽胞桿菌B. subtilisHMB19198菌株能有效防治番茄灰霉病，目前已獲得HMB19198菌株全基因組序列（結(jié)果未發(fā)表），以該菌株為活性的微生物殺菌劑正處于新農(nóng)藥登記階段。本研究通過(guò)對(duì)HMB19198菌株全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得 HMB19198菌株的特異性基因序列，基于此序列，設(shè)計(jì)出針對(duì)HMB19198菌株的特異性引物和探針，建立了HMB19198的熒光定量PCR定量檢測(cè)技術(shù)，利用該技術(shù)對(duì)HMB19198菌株在番茄葉片上的定殖動(dòng)態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

枯草芽胞桿菌 HMB19198菌株（國(guó)家發(fā)明專利：ZL201610879296.8）在含有 30%甘油的 LB（Luria Bertani）培養(yǎng)基中于-80 ℃長(zhǎng)期保存，使用前在LB固體培養(yǎng)基上37 ℃活化。

1.2 菌株HMB19198特異性引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)

目前已獲得 HMB19198菌株的全基因組序列及全部的開放閱讀框序列。將所有開放閱讀框序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）進(jìn)行批量比對(duì)，篩選該菌株獨(dú)有基因。利用Primer Premier 5.0軟件在該基因內(nèi)部設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)菌株HMB19198的上下游引物和探針，引物由金唯智公司合成，探針由賽默飛公司合成，探針的5′端標(biāo)記FAM，3′端標(biāo)記MGB。

1.3 引物和探針的特異性驗(yàn)證

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取32株枯草芽胞桿菌及其近緣種菌株DNA；利用新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取番茄葉片DNA，細(xì)菌和番茄葉片DNA均用無(wú)菌水稀釋為10 ng/μL。利用菌株HMB19198特異性引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR分析，以菌株HMB19198基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以番茄葉片DNA為陰性對(duì)照，無(wú)菌水為空白對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。熒光定量PCR擴(kuò)增條件為Probe qPCR Mix 10 μL，特異性引物（10 μmol/L）各 0.4 μL，TaqMan 探針（5 μmol/L）0.4 μL，模板 DNA 2 μL，用無(wú)菌 ddH2O 補(bǔ)足至 20 μL。擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min，94 ℃ 30 S，58 ℃ 45 S，40個(gè)循環(huán)。

1.4 引物和探針的靈敏性檢測(cè)

利用HMB19198菌株特異性引物對(duì)HMB19198基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段插入到pMD19-T載體，經(jīng)PstI限制性內(nèi)切酶線性化后進(jìn)行系列梯度稀釋，獲得101～107拷貝/μL的DNA稀釋液。以系列稀釋液為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同1.3部分。以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以熒光定量PCR循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 番茄葉片DNA對(duì)擴(kuò)增效率和檢測(cè)靈敏性的影響

為檢測(cè)番茄葉片DNA對(duì)熒光定量PCR擴(kuò)增效率的影響，本研究利用1 ng/μL的番茄葉片DNA稀釋液對(duì)1.4部分中的線性化質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，獲得101～107拷貝/μL的靶標(biāo)DNA稀釋液。以含有不同拷貝數(shù)DNA的稀釋液為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以熒光定量PCR循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）為縱坐標(biāo)，建立擴(kuò)增曲線。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較分析，明確番茄葉片DNA對(duì)擴(kuò)增效率和檢測(cè)靈敏性的影響。

1.6 菌株HMB19198在葉片定殖能力檢測(cè)

1.6.1 菌落計(jì)數(shù)法分析菌株HMB19198在番茄葉片上的定殖動(dòng)態(tài) 將HMB19198菌株在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌體并用無(wú)菌水調(diào)整菌體濃度為108cfu/mL。用小型噴霧器將HMB19198菌體懸浮液均勻地噴灑在4片真葉期的番茄（品種為合作918）葉片上，分別于0（葉片干燥后立即取樣）、2、4、6和8 d采集葉片。稱取0.5 g葉片，在滅菌研缽中充分研磨，加入10 mL無(wú)菌水充分混勻，雙層滅菌紗布過(guò)濾，過(guò)濾液10倍梯度稀釋，取100 μL稀釋液涂布于LB培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日根據(jù)HMB19198菌株的形態(tài)特征，統(tǒng)計(jì)HMB19198菌落數(shù)，計(jì)算單位質(zhì)量葉片上含有的HMB19198菌體數(shù)量（cfu/g葉片）。

1.6.2 熒光定量PCR技術(shù)分析HMB19198菌株在番茄葉片上的定殖動(dòng)態(tài) 將108cfu/mL菌株HMB19198懸浮液均勻的噴施在4片真葉期的番茄葉片上，分別于0、2、4、6 d和8 d采集葉片。稱取0.5 g葉片，利用新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取番茄葉片DNA，具體操縱步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將DNA稀釋為10 ng/μL，取2 μL進(jìn)行熒光定量PCR分析，根據(jù)方法1.5中構(gòu)建的擴(kuò)增曲線，計(jì)算單位質(zhì)量番茄葉片上HMB19198的濃度（拷貝/g葉片）。

1.7 菌株HMB19198防治番茄灰霉病的持效期

將108cfu/mL的HMB19198菌體懸浮液均勻地噴灑在4片真葉期的番茄葉片上，分別于0、2、4、6和8 d采集大小和葉齡一致的健康葉片，用脫脂棉包裹住葉柄，放入鋪有濾紙的玻璃皿中，濾紙和脫脂棉都滴加適量無(wú)菌水保持濕潤(rùn)，番茄葉片中央接種直徑5 cm的灰霉菌餅，以不噴灑HMB19198接種灰霉菌餅的番茄葉片作為對(duì)照。培養(yǎng)皿置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，之后采用十字交叉法測(cè)定病斑大小，計(jì)算病斑面積（長(zhǎng)×寬）。不同處理對(duì)番茄灰霉病的防治效果（%）＝（對(duì)照病斑面積－處理病斑面積）/對(duì)照病斑面積×100。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理，IBM SPSS Statistics Version 20進(jìn)行單因素方差分析，并且使用Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），采用Origin Pro 8.6進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對(duì)結(jié)果

將菌株HMB19198全基因組序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株存在一段獨(dú)有基因片段，該基因功能未知，全長(zhǎng)102 bp（Genbank序列號(hào)：OK086768），BLAST分析沒有發(fā)現(xiàn)同源序列。其上游開放式閱讀框（HMB19198-608）和下游開放式閱讀框（HMB19198-608）均為功能未知蛋白（圖1）。根據(jù)HMB19198菌株特異性基因片段設(shè)計(jì)特異性引物19198F（5'-ATGTGTATAATAAGAAAAGTCGAATTG GAA-3'）/19198R（5'-TCATTTGATGTTGAAGTCAAGAAGT-3'）和TaqMan探針（5'-AACATTC GAAAAACATTCGAAAAACATTC-3'），引物和探針位點(diǎn)見圖1。

圖1 枯草芽胞桿菌HMB19198特異性引物和探針的位點(diǎn)及序列Fig. 1 Schematic diagram ofB.subtilisHMB19198 specific gene cluster and the sequences of specific primers andTaqMan probe

2.2 引物和探針的特異性驗(yàn)證

利用菌株HMB19198的特異性引物和探針，對(duì)32株芽胞桿菌基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，以菌株HMB19198基因組DNA為模板可以獲得較強(qiáng)的擴(kuò)增信號(hào)（Ct值＝21.66），而以其他31株芽胞桿菌基因組DNA為模板不能獲得擴(kuò)增信號(hào)。以番茄葉片基因組DNA為模板也不能獲得擴(kuò)增信號(hào)，而番茄葉片基因組DNA中加入相同濃度的菌株HMB19198基因組DNA后可以獲得較強(qiáng)的擴(kuò)增信號(hào)（Ct值＝24.30）。以上結(jié)果證明，本研究所設(shè)計(jì)的引物和探針針對(duì)菌株HMB19198具有較高的特異性。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將含有菌株HMB19198特異性片段的線性化質(zhì)粒系列稀釋，以101～107拷貝/μL的質(zhì)粒稀釋液為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y＝-3.4552x＋41.188，擴(kuò)增效率為94.7%，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9902，檢測(cè)閾值為101拷貝/μL（圖2a）。為驗(yàn)證番茄葉片DNA是否抑制HMB19198菌株特異性片段的檢測(cè)，本研究利用番茄葉片DNA稀釋液對(duì)線性化質(zhì)粒進(jìn)行稀釋，利用稀釋液進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增曲線。擴(kuò)增曲線的線性方程為y＝-3.1881x＋41.634，擴(kuò)增效率為105.9%，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9879，檢測(cè)閾值為102拷貝/μL。同以線性化質(zhì)粒為模板構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，加入番茄葉片DNA后體系的擴(kuò)增效率沒有降低，但檢測(cè)靈敏度降低了10倍（圖2b）。

圖2 無(wú)菌水（a）和番茄DNA（b）10倍梯度稀釋重組載體建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of 10-fold diluted recombinant plasmids with sterile water (a) and DNA extracted from tomato leaves

2.4 菌株HMB19198在番茄葉片上定殖能力檢測(cè)

依據(jù)建立的熒光定量PCR體系，對(duì)不同時(shí)期提取的番茄葉片總DNA中菌株HMB19198的濃度進(jìn)行定量檢測(cè)，同時(shí)利用傳統(tǒng)的菌落計(jì)數(shù)法分析菌株HMB19198在葉面的定殖數(shù)量，分析兩種方法的相關(guān)性。熒光定量PCR的結(jié)果顯示，菌株HMB19198在葉片上的定殖數(shù)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。接菌初期（0 d），菌株HMB19198的定殖濃度為1.7×108拷貝/g葉片，接菌2、4、6和8 d后菌體濃度分別為1.2×108拷貝/g葉片、4.7×107拷貝/g葉片、9.8×106拷貝/g葉片和1.0×107拷貝/g葉片。平板計(jì)數(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，接菌初期（0 d）菌體數(shù)量為8.9×107cfu/g葉片，接菌2、4、6和8 d后菌體數(shù)量分別為6.3×107、2.8×107、3.0×107、和1.2×107cfu/g葉片，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有較高的相關(guān)性（相關(guān)性系數(shù)R2＝0.87）（圖3）。

圖3 Real-time PCR和平板計(jì)數(shù)方法對(duì)HMB19198菌株進(jìn)行定量檢測(cè)Fig. 3 Detection ofB.subtilisstrain HMB19198 by real-time PCR and plate count methods

2.5 菌株HMB19198防治番茄灰霉病的持效期

分別于噴施HMB19198菌株0、2、4、6和8 d后分析菌株HMB19198對(duì)番茄灰霉病的防治效果（圖4）。結(jié)果表明，噴施HMB19198菌株2 d內(nèi)對(duì)番茄灰霉病的防治效果在80%以上，4 d后防治效果為63.4%，8 d后防治效果降至37.9%。

圖4 番茄噴施菌株HMB19198不同時(shí)期對(duì)番茄灰霉病的防治效果Fig. 4 Biocontrol efficiency for tomato gray mold after inoculation ofBacillus subtilisHMB19198 at different times

表1 枯草芽胞桿菌HMB19198探針的特異性檢測(cè)Table 1 Probe specific detection forB.subtilisHMB19198

3 討論

基于TaqMan探針的熒光定量 PCR技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的可快速檢測(cè)環(huán)境中靶標(biāo)生物的一種分子技術(shù)。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、周期短的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境中微生物的定量檢測(cè)[18]。獲得靶標(biāo)微生物特異性探針是開發(fā)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵，目前報(bào)道較多的是基于真菌的ITS序列和細(xì)菌的16S rDNA序列，對(duì)某種微生物進(jìn)行定量檢測(cè)[19]，而針對(duì)特定菌株開展定量檢測(cè)的報(bào)道較少，主要原因是難以獲得菌株特異性的引物或探針。通過(guò)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplied polymorphic DNA，RAPD）和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplied fragment length polymorphism，AFLP）等技術(shù)對(duì)不同菌株進(jìn)行多態(tài)性分析，獲得菌株的特異性片段，進(jìn)而根據(jù)特異性片段序列設(shè)計(jì)針對(duì)菌株的特異性引物或探針，該技術(shù)曾廣泛應(yīng)用于開發(fā)菌株特異性引物，但這兩項(xiàng)技術(shù)要求提供不同菌株 DNA，在一定程度上限制了引物的特異性驗(yàn)證范圍[20]。近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的普及及生物信息學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，通過(guò)菌株全基因組序列比對(duì)，獲得菌株的特異性堿基，據(jù)此設(shè)計(jì)針對(duì)菌株的特異性引物或探針已成為可能。目前僅 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提交的枯草芽胞桿菌類細(xì)菌的全基因組序列達(dá)到350條，方便了枯草芽胞桿菌類細(xì)菌全基因組序列比對(duì)?？莶菅堪麠U菌HMB19198是一株能有效防治番茄灰霉病的生防細(xì)菌，目前已獲得該菌株的全基因組序列。本研究基于全基因組序列比對(duì)技術(shù)，得到HMB19198菌株中的特異性片段19198-609，將此序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)存在同源性較高的序列?；诖诵蛄性O(shè)計(jì)出針對(duì)HMB19198菌株的特異性引物和探針，首先利用32株芽胞桿菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，證明該引物和探針對(duì)HMB19198菌株具有較高的特異性，另外，以番茄葉片DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，也未發(fā)現(xiàn)存在檢測(cè)信號(hào)，因此，該特異性引物和探針可用于開展HMB19198菌株在番茄葉片上的定量檢測(cè)。

利用熒光定量PCR檢測(cè)靶標(biāo)微生物的靈敏性時(shí)受提取DNA的質(zhì)量以及DNA中腐殖酸和有機(jī)酸等物質(zhì)的影響[21]。菌株 HMB19198為葉面噴施，因此，重點(diǎn)檢測(cè)菌株在葉片上的定殖能力?？紤]到番茄葉片DNA可能影響HMB19198菌株的檢測(cè)，本研究分別用HMB19198基因組DNA和混入番茄葉片DNA的HMB19198基因組DNA構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較了兩種情況下的檢測(cè)靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有番茄葉片DNA干擾的條件下，對(duì)HMB19198菌株的檢測(cè)極限為10拷貝/μL，混入番茄葉片DNA后，體系檢測(cè)效率沒有明顯的改變，但檢測(cè)極限降低為 102拷貝/μL。前期研究發(fā)現(xiàn)，噴施 HMB19198菌株后，番茄葉片上菌株的濃度在105cfu/g葉片以上，因此，即使存在番茄葉片的干擾，本研究建立的檢測(cè)體系依然可用于葉片上菌株HMB19198的定量檢測(cè)。

菌株HMB19198田間應(yīng)用間隔期為5～8 d，在施藥間隔期間進(jìn)行菌株HMB19198在葉片上的數(shù)量動(dòng)態(tài)檢測(cè)有助于指導(dǎo)田間施藥和研究生防菌的作用機(jī)制。本研究利用所建立的熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合菌落計(jì)數(shù)法，對(duì)噴施菌株HMB19198 0～8 d后葉片上菌體數(shù)量進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在接種前期（0、2和4 d）熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果略高于菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果，但接種后期（6和8 d）熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果略低于菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)隨著番茄的生長(zhǎng)，葉片中的有機(jī)酸等物質(zhì)含量增多，對(duì)熒光定量PCR的擴(kuò)增效率有影響，從而降低了檢測(cè)結(jié)果。熒光定量PCR檢測(cè)和平板菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果相近，菌體數(shù)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，結(jié)果與劉錦霞[22]等檢測(cè)生防菌株SW11在番茄葉片上的定殖數(shù)量變化趨勢(shì)一致。本研究結(jié)果顯示，用藥2 d后菌株HMB19198在葉面的數(shù)量為6.3×107cfu/g葉片，對(duì)灰霉病的防效在80%以上，而用藥8 d后在葉面的定殖數(shù)量為1.2×107cfu/g葉片，但此時(shí)的防效僅為37.9%。對(duì)于防治葉部病害的生防細(xì)菌，其葉面的定殖能力和產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)均影響其生防效果[23]。由于HMB19198菌株是以菌體形態(tài)噴灑在番茄葉面上，其在轉(zhuǎn)變?yōu)樾菝唧w芽胞的過(guò)程中將分泌微量的抑菌活性物質(zhì)，會(huì)在一定程度上抑制了病原菌的侵染，因此在施藥初期對(duì)灰霉病的防治效果較好。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株HMB19198轉(zhuǎn)化為芽胞或菌體死亡，對(duì)病害的防效降低，另外，其所分泌的抑菌物質(zhì)在溫室高濕環(huán)境下也會(huì)有所流失。