26份玉米材料灰斑病抗性鑒定及分子標(biāo)記檢測

周雪琴， 袁艷麗， 任 洪， 王 偉， 柏光曉

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所， 貴陽 550006)

玉米灰斑病(gray leaf spot，GLS)是發(fā)生在玉米葉部的一種嚴(yán)重病害，最早于1925年在美國的伊利諾斯州首次被Tohon和Daniels報(bào)道[1]。1992年在我國遼寧丹東首次被發(fā)現(xiàn)[2]，隨后逐漸向全國擴(kuò)散，嚴(yán)重影響了我國玉米的生產(chǎn)，特別是對東北、華北和西南三大玉米主產(chǎn)區(qū)構(gòu)成巨大威脅[3]。研究表明，控制灰斑病最經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)保的方法是使用抗性品種[4-7]，而選育抗病品種的基礎(chǔ)是篩選抗病資源。徐秀德等[8]利用人工接種的方法對20份玉米自交系進(jìn)行灰斑病抗性鑒定，獲得3份高抗自交系，5份抗病自交系。趙子麒等[9]利用田間自然鑒定方法，對48份玉米自交系進(jìn)行抗灰斑病鑒定，篩選出10份抗灰斑病自交系。這些研究均為玉米自交系灰斑病抗性鑒定提供了參考。

為進(jìn)一步了解玉米抗灰斑病特性，宋茂興等[10]以高抗灰斑病自交系齊319和高感自交系掖478構(gòu)建300個(gè)重組自交系(RIL)群體，結(jié)合199個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，根據(jù)2年人工接種鑒定，在染色體bin 1.02位置發(fā)掘了一個(gè)玉米抗灰斑病候選基因KHB5，兩端標(biāo)記分別為umc 2614和bnlg 1803，結(jié)合抗性鑒定結(jié)果，通過T檢驗(yàn)證明了該標(biāo)記能夠?qū)τ衩谆野卟】剐赃M(jìn)行有效的選擇。李春紅[11]利用高抗自交系T 32和高感自交系交51構(gòu)建BC3F2近等基因系群體和包含180個(gè)單株的BC3F2-Micro小群體，將主效QTL-GLS8精細(xì)定位在標(biāo)記ym 20～ym 51間，并利用BC3F2和BC3F2-Micro群體的交換單株驗(yàn)證了定位分析結(jié)果。王平喜[12]利用元分析方法整合了65個(gè)抗玉米灰斑病QTL，獲得了11個(gè)“一致性”QTL區(qū)間。Sun等[13]以WGR為供體親本，鄭58、昌7-2為輪回親本構(gòu)建RILS群體，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)成功將玉米抗灰斑病主效QTL位點(diǎn)qRgls1.06導(dǎo)入輪回親本中，從而提高了鄭58、昌7-2對玉米灰斑病的抗性。這些研究均為玉米抗灰斑病種質(zhì)的分子鑒定提供了可能。

本試驗(yàn)以26份玉米骨干自交系為試材，通過人工接種，參考已有報(bào)道結(jié)果，篩選與玉米抗灰斑病主效QTL(或基因)緊密連鎖的分子標(biāo)記，對供試材料進(jìn)行灰斑病標(biāo)記檢測，以期為玉米抗灰斑病的分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究選用26份不同血緣玉米供試材料，均為目前國內(nèi)西南地區(qū)玉米育種中的骨干自交系，由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米研究所提供(表1)。

表1 26份供試材料Table 1 Twenty-six tested materials

1.2 人工接種鑒定

四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所是西南地區(qū)國家玉米區(qū)試抗病鑒定指定單位。本實(shí)驗(yàn)供試材料灰斑病抗性人工接種鑒定由該單位在成都新都玉米試驗(yàn)基地完成，方法參照《玉米抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范第11部分：灰斑病》(NY/T 1248.11-2016)，以玉米自交系齊319為抗病對照，自交系掖478為感病對照，對供試材料進(jìn)行玉米灰斑病抗性鑒定。

1.3 分子標(biāo)記

根據(jù)www.maizegdb.org網(wǎng)站和已報(bào)道的文獻(xiàn)，綜合考慮表型貢獻(xiàn)率，篩選與玉米抗灰斑病主效QTL(或基因)緊密連鎖的6個(gè)分子標(biāo)記(表2)，以齊319(高抗)為溫帶材料對照，以T 32(高抗)為熱帶材料對照，對供試材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測。

表2 分子標(biāo)記信息Table 2 Information of molecular markers

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增 及檢測

參考盧振宇等[15]改良的CTAB法提取樣品DNA，用超微量紫外分光光度計(jì)(Nano Drop One，Thermo，USA)檢測DNA濃度與質(zhì)量，稀釋至15 ng/μL，在-20 ℃下保存。所用標(biāo)記引物的序列均由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系10 μL：DNA模板3 μL，正、反向引物各0.6 μL(5 μmol/L)，10×Buffer 1 μL，MgCl2(25 mmol/L)1 μL，dNTP 0.75 μL(2 mmol/L)，Taq酶0.075 μL(5 U/μL)，Glycerol(99%)1 μL，ddH2O 1.975 μL。PCR反應(yīng)在BIO-RAD C 1000 Thermal Cycler儀(ABI，USA)上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序：93 ℃預(yù)變性1 min；93 ℃變性1 min，58 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

注：1為高抗；3為抗病；5為中抗；7為感??；9為高感。圖1 部分玉米自交系抗性表現(xiàn)Fig.1 Resistance performance of some maize inbred lines

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

在玉米乳熟后期，參考國家標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1248.11-2016)抗性等級(jí)確定方法，對玉米自交系進(jìn)行灰斑病抗病評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：1級(jí)高抗(HR)，穗位葉及上部3葉無病斑或有零星病斑，占葉面積0～5%；3級(jí)抗病(R)，穗位葉及上部3葉有少量病斑，占葉面積6%～10%；5級(jí)中抗(MR)，穗位葉及上部3葉有較多病斑，占葉面積11%～30%；7級(jí)感病(S)，穗位葉及上部3葉有大量病斑，病斑相連，占葉面積31%～70%；9級(jí)高感(HS)，穗位葉及上部3葉基本為病斑覆蓋，葉片枯死。

2 結(jié)果與分析

2.1 自交系抗性分析

根據(jù)《玉米抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范第11部分：灰斑病》(NY/T 1248.11-2016)，高抗對照齊319病級(jí)達(dá)1級(jí)，感病對照掖478病級(jí)達(dá)7級(jí)及以上，鑒定視為有效。本試驗(yàn)表明，自交系齊319病級(jí)為1級(jí)，自交系掖478病級(jí)達(dá)到9級(jí)(圖1)，說明本次鑒定結(jié)果可靠。26份玉米自交系中，表現(xiàn)為高抗的自交系有4份，分別是齊319、蘇65、GD 927和T 32，占所有供試材料的15.38%；抗病自交系3份，分別為QR 273、GH 35和SD 375，占11.54%；中抗自交系8份，分別為S 906、S 908、S 909、S 911、905 m、QB 446、昌7-2和掖107，占30.77%；感病自交系7份，分別為P 138、QB 1064、986、m 6323、A 1164、R 1164和鄭58；占26.92%；高感自交系4份，分別為PH 4 CV、掖478、B 73和交51，占所有供試材料的15.38%(表3)；其中，15份中抗及以上的材料中有9份為熱帶血緣。結(jié)果表明，不同來源玉米自交系對灰斑病的抗性存在明顯差異，抗病材料中熱帶材料偏多。

表3 玉米自交系抗灰斑病鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of resistance to gray leaf spot in maize inbred lines

注：1為齊319;2為蘇65;3為GD 927;4為T 32;5為QR 273;6為GH 35;7為SD 375;8為S 906;9為S 908;10為S 909; 11為S 911;12為905 m;13為QB 446;14為昌7-2;15為P 138;16為QB 1064;17為986;18為PH 4 CV;19為掖107;20為m 6323;21為A 1164;22為R 1164;23為鄭58;24為掖478;25為B 73;26為交51。 圖2 分子標(biāo)記在26份材料中擴(kuò)增結(jié)果 Fig.2 Amplified results of 26 materials by molecular markers

2.2 主效QTL位點(diǎn)的檢測

為了解供試材料灰斑病主效抗病位點(diǎn)，利用6個(gè)與玉米抗灰斑病主效QTL(或基因)連鎖的分子標(biāo)記，對26份供試材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(圖2)。結(jié)果表明，26份供試材料在6個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)帶型不盡相同，與高抗自交系齊319帶型一致的材料主要集中在KHB5和qRgls2.04兩個(gè)位點(diǎn)，分別有11份(蘇65、GD 927、QR 273、GH 35、SD 375、S 906、S 908、S 909、S 911、905 m、掖107)和9份(蘇65、GD 927、QR 273、S 906、S 909、S 911、905 m、昌7-2、掖107)。與高抗自交系T 32帶型一致的材料主要集中在qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02三個(gè)位點(diǎn)，分別有10份(蘇65、GD 927、QR 273、S 906、S 908、S 909、S 911、905 m、QB 446、掖107)、8份(GD 927、GH 35、SD 375、S 906、S 908、S 909、S 911、掖107)和10份(GD 927、QR 273、GH 35、SD 375、S 906、S 908、S 909、S 911、QB 446、昌7-2)。表明不同來源玉米材料其灰斑病抗病位點(diǎn)有所不同，主要集中在KHB5、qRgls2.04、qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02等5個(gè)抗病位點(diǎn)。

2.3 接種鑒定和標(biāo)記檢測結(jié)果一致性分析

為進(jìn)一步了解人工接種鑒定和標(biāo)記檢測結(jié)果的一致性，對接種鑒定表現(xiàn)為中抗及以上的15份材料進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，在KHB5和qRgls2.04位點(diǎn)，與齊319帶型一致的分別有11份和9份，分別占所有中抗及以上材料的73.33%和60%；在qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02位點(diǎn)，與T 32帶型一致的分別有10、8份和10份，分別占所有中抗及以上材料的66.67%、53.33%和66.67%(表4)。結(jié)果表明，在KHB5和qRgls2.04位點(diǎn)，分子標(biāo)記umc 2614和TID 5306可以檢測與齊319(高抗)一致的抗病位點(diǎn)。在qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02位點(diǎn)， umc 1972、umc 1042和bnlg 1523可以檢測與T 32(高抗)一致的抗病位點(diǎn)(圖3)。

表4 抗病材料分子標(biāo)記檢測結(jié)果Table 4 Testing results of molecular markers for resistant materials

圖3 抗病材料在齊319與T 32間的分布Fig.3 The distribution of disease-resistant materials between Qi 319 and T 32

3 結(jié)論與討論

本研究利用人工接種的方式對26份玉米骨干自交系進(jìn)行灰斑病抗性鑒定。同時(shí)，利用灰斑病主效QTL(或基因)連鎖的6個(gè)分子標(biāo)記，進(jìn)行抗病位點(diǎn)的檢測。經(jīng)接種鑒定，表現(xiàn)為中抗以上級(jí)別的材料有15份，其中高抗有4份。分子標(biāo)記檢測結(jié)果表明，供試材料抗病位點(diǎn)主要集中在KHB5、qRgls2.04、qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02等5個(gè)位點(diǎn)。umc 2614和TID 5306可以檢測與齊319(高抗)一致的抗病位點(diǎn)(KHB5和qRgls2.04)，umc 1972、umc 1042和bnlg 1523可以檢測與T 32(高抗)一致的抗病位點(diǎn)(qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02)，且接種鑒定與分子標(biāo)記檢測結(jié)果總體一致，研究結(jié)果可為玉米分子育種提供參考。

為篩選玉米抗灰斑病材料，吳紀(jì)昌等[16]利用人工接種的方法對915份玉米自交系進(jìn)行灰斑病抗性鑒定，獲得157份抗性材料，這些材料多數(shù)都具有熱帶或亞熱帶血緣。呂國忠等[3]利用人工接種法，對28份玉米自交系進(jìn)行灰斑病的抗性鑒定和評(píng)價(jià)，篩選出7份抗病自交系，且都具有熱帶血緣。本研究利用人工接種法對26份玉米自交系進(jìn)行灰斑病抗性鑒定，獲得的15份中抗及以上材料中，有9份材料如蘇65、GD 927、T 32和S 906等都具有熱帶血緣，與前人研究結(jié)果一致。說明在抗灰斑病種質(zhì)改良創(chuàng)新中，具有熱帶或亞熱帶血緣的種質(zhì)可作為基礎(chǔ)材料。

玉米對灰斑病的抗性主要表現(xiàn)為加性遺傳效應(yīng)，屬數(shù)量性狀遺傳[17]。史利玉[18]以161份玉米自交系為材料，采用全基因組分布的4 110個(gè)SNP標(biāo)記對玉米抗灰斑病進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)合基于雙親作圖群體定位的42個(gè)QTL，確定了3個(gè)抗灰斑病候選基因GLScgb03071、GLScgb03072和GLScgcb0907。宋軍鋒等[19]運(yùn)用KASP分子標(biāo)記和QTL作圖策略，對抗灰斑病自交系K 22的抗性進(jìn)行QTL定位，檢測出3個(gè)QTL區(qū)間bin 1.09、2.04和7.0，并在3個(gè)區(qū)間內(nèi)搜索到2個(gè)可能與K 22高抗灰斑病密切相關(guān)的基因Zm00001d033217和Zm00001d021947，進(jìn)一步證明玉米灰斑病抗性是由多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀。本研究中，自交系GD 927、S 906、S 908、S 909和S 911既在KHB5和qRgls2.04抗病位點(diǎn)與溫帶材料齊319帶型一致，又在qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02抗病位點(diǎn)與熱帶材料T 32帶型一致，表明GD 927、S 906和S 908等熱帶種質(zhì)不但具有與溫帶種質(zhì)齊319一致的抗病位點(diǎn)，也具有與熱帶種質(zhì)T 32一致的抗病位點(diǎn)。因此，結(jié)合溫帶和熱帶材料抗病主效位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，能有效的對玉米種質(zhì)灰斑病的抗性進(jìn)行檢測。