宋 雪，劉 晗，李昭璇，李八方，侯 虎,

1. 中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266003

2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266237

止血敷料常用于傷口的基礎(chǔ)治療，以達到快速止血的目的。然而傳統(tǒng)的止血敷料存在很多問題，例如材料來源單一、止血時間較長、易粘連傷口、體內(nèi)降解性較差、力學性能較差等，已不能滿足傷者們的緊急醫(yī)療需求[1]。因此，針對傳統(tǒng)醫(yī)用敷料的局限性，開發(fā)一種具有良好機械性能、保水性能和止血性能的新型可吸收醫(yī)用敷料，成為目前生物醫(yī)學材料領(lǐng)域研究的熱點和難點之一[2]。目前，常用的止血材料包含以下幾種：1) 沸石類敷料，具有多孔結(jié)構(gòu)，能夠迅速吸收血液中的水分促進凝血，但容易引發(fā)炎癥反應(yīng)；2) 氧化纖維素類敷料，通過羧基與血紅蛋白中的鐵離子形成凝膠狀物質(zhì)進行止血，但在過程中產(chǎn)生的酸性環(huán)境會引起神經(jīng)損傷；3) 明膠、膠原和多糖類敷料，生物相容性較高，具有較高的止血活性，是目前研究的熱點，但單獨使用時存在機械性能較差、易脫落等缺點。因此，本研究考慮將不同的天然高分子材料進行共混交聯(lián)，改善單一材料的局限性，并發(fā)揮其在止血性能中的復(fù)配協(xié)同作用[3]。

明膠作為一種可吸收的天然生物材料，因具有生物相容性、生物降解性、低免疫原性而受到廣泛關(guān)注[4]。明膠具有良好的止血活性，能夠吸收大量血液，并能激活血小板的附著和凝血因子釋放，封閉創(chuàng)面?zhèn)趯崿F(xiàn)快速止血[5]。目前，?；蜇i來源的明膠止血海綿已應(yīng)用于外科手術(shù)之中[6]。太平洋鱈(Gadus macrocephalus) 是世界上重要的經(jīng)濟魚類，從鱈魚皮副產(chǎn)物中提取明膠可以避免陸地源疾病和宗教的影響，避免資源浪費和環(huán)境污染。但純明膠海綿存在機械性能較差、易破損、難止住大傷口出血等缺點，所以要獲得高性能的明膠止血產(chǎn)品，需將其與其他類型的止血材料復(fù)配進行改性[7-9]。褐藻來源的海藻酸鈉是一種由β-1,4-d-甘露糖醛酸和α-1,4-d-古洛糖醛酸構(gòu)成的天然線性共聚物[10]，具有生物降解性好、生物相容性高和易于進行化學改性的優(yōu)點，且具有止血活性以及易于形成凝膠的性質(zhì)，可以作為明膠復(fù)配的良好選擇[11]。已研究開發(fā)出明膠海藻酸鈉水凝膠支架用于骨組織缺損修復(fù)[12]和細胞遷移[13]，但對其復(fù)合材料的止血效果尚未探究。

本研究將鱈魚皮源明膠與海藻酸鈉進行共混并交聯(lián)，制備出一種具有良好機械性能和止血活性的可吸收型復(fù)合止血敷料。通過測定該復(fù)合止血敷料的力學性能、結(jié)構(gòu)特征等指標從而確定其制備的最佳工藝條件，并評價了該敷料的止血性能、生物相容性，初步探究了其止血機制，為新型止血醫(yī)用材料的開發(fā)提供重要參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

太平洋鱈冷凍魚皮由青島浩源有限公司提供；戊二醛和十二烷基硫酸鈉 (SDS) 購自Sigma有限公司；其他試劑均為分析純，購自國藥化學試劑有限公司。

市售鱈魚皮明膠購自青島東易科技有限公司；市售明膠海綿購自江西祥恩醫(yī)療科技發(fā)展有限公司；活化部分凝血酶時間 (Activated partial thromboplastin time, APTT)、凝血酶原時間 (Prothrombin time, PT) 和凝血酶時間 (Thrombin time, TT) 檢測試劑盒，血栓烷素B2(TXB2)、血小板第四因子(PF4) 和P-選擇素檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Wistar大鼠 (210±10) g購自山東魯抗醫(yī)學質(zhì)量檢驗中心實驗動物中心。

1.2 鱈魚皮明膠的制備

太平洋鱈魚皮明膠的制備參考Hou等[14]的方法。解凍清洗后的小塊鱈魚皮經(jīng)0.1 mol·L-1的氫氧化鈉 (NaOH) 溶液 (質(zhì)量體積比1∶25) 和0.1 mol·L-1的鹽酸 (HCl) 溶液 (質(zhì)量體積比 1∶25)浸泡處理后，沖洗至中性。將充分溶脹的魚皮放入錐形瓶中，在55 ℃的條件下水浴搖床振蕩提取4 h。提取液經(jīng)過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后凍干得到鱈魚皮明膠。

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)

采用Laemmli[15]的方法配置7.5%分離膠和5%濃縮膠，電泳采用直流恒壓電源，電壓100 V，跑至距離膠邊緣約1 cm處。將膠置于考馬斯亮藍R-250中染色10～15 min，隨后用脫色液脫色過夜。

1.4 醫(yī)用復(fù)合止血海綿的制備

將 1、5、10、15、20 mg·mL-1的明膠溶液按體積比15∶8與海藻酸鈉溶液混合，在混合溶液中加入戊二醛溶液作為交聯(lián)劑，于4 ℃靜置24 h進行交聯(lián)。真空脫氣15～30 min后，溶液倒入不銹鋼平板中，于-40 ℃下預(yù)凍12 h，冷凍干燥后得到鱈魚皮明膠復(fù)合止血敷料。

1.5 理化特征

1.5.1 吸水性

將敷料剪成1.0 cm3的立方塊，準確稱量記為w0。室溫條件下，浸沒于蒸餾水中充分吸水，隨后用鑷子將其輕輕提出水面，放置在濾網(wǎng)中除去表面多余的水，再次精確稱量記為w1。3次測量，取平均值。吸水倍數(shù)的計算公式為[16]：

式中：w0為海綿干質(zhì)量 (g)；w1為海綿濕質(zhì)量 (g)。

1.5.2 持水力

在測定吸水率的基礎(chǔ)上，將膨脹狀態(tài)下的海綿進行離心。離心后海綿的質(zhì)量為w2。持水力計算公式為[17]：

式中：w0為海綿的干質(zhì)量(g)；w1為海綿的濕質(zhì)量(g)；w2為排水后海綿的質(zhì)量 (g)。

1.5.3 交聯(lián)度

取敷料3～5 mg加入1 mL 碳酸氫鈉 (NaHCO3)溶液和1 mL 三硝基苯磺酸 (TNBS) 溶液 (5 mg·mL-1)，40 ℃ 反應(yīng) 2 h。隨后加入 3 mL 6 mol·L-1的HCl溶液，60 ℃反應(yīng)90 min。溶液經(jīng)去離子水稀釋至5 mL，測定其在345 nm處的吸光值。吸光值與游離氨基數(shù)存在以下關(guān)系[18]：

式中：[NH2]為賴氨酸側(cè)鏈ε-氨基含量；A為吸光度；V為溶液體積(mL)；ε=14.600；l為路徑長度(cm)；m為樣品的質(zhì)量 (mg)。

根據(jù)以下公式計算交聯(lián)度 (%)：

式中：[NH2]為游離氨基質(zhì)量摩爾濃度 (mol·g-1)，下標m和n分別表示交聯(lián)和無交聯(lián)樣品。

1.5.4 機械試驗

將制備好的敷料剪成適當大小，兩端固定在拉力機上，初始距離為15 mm，測試速度為60 mm·s-1，力度為300 N[19]。每組樣品平行測試9次。

抗張強度 (MPa)的計算公式為：

式中：Fmax為樣品斷裂瞬間的最大張力 (N)；S為樣品的橫截面積 (mm2)。

斷裂伸長率的計算公式為：

式中：ΔL為樣品斷裂時延伸的位移 (mm)；L為標距 (mm)。

1.6 體內(nèi)止血評價

1.6.1 股動脈模型

大鼠麻醉后，暴露其右側(cè)股動脈并于相同位置處切開，然后迅速將復(fù)合止血敷料覆蓋在出血部位，施加連續(xù)壓力，每15 s觀察1次。以無菌紗布和市售明膠海綿作為對照，分別記錄止血時間。

1.6.2 肝損傷模型

麻醉大鼠后，打開腹腔，暴露出肝臟中葉，從肝臟尖端1 cm處進行切割，制備肝臟出血模型。其余操作同上，分別記錄止血時間。

1.6.3 尾部模型

大鼠的尾部用75%乙醇消毒，在尾部的1/3處拉直并切割。其余操作同上，分別記錄止血時間。

1.7 APTT、PT、TT 分析和 TXB2、PF4、P-選擇素檢測

APTT、PT、TT分析分別按照相應(yīng)檢測試劑盒的說明書測定。血小板活化因子檢測按照TXB2、PF4和P-選擇素檢測試劑盒的說明書測定。

1.8 生物相容性評價

參考GB/T 16886.11—2011《醫(yī)療器械生物學評價第11部分：全身毒性試驗》進行全身急性毒性試驗；參考GB/T 16886.10—2017《醫(yī)療器械生物學評價第10部分：刺激與皮膚致敏試驗》進行刺激性試驗；參考GB/T 16886.4—2016《醫(yī)療器械生物學評價第4部分：與血液相互作用試驗選擇》進行溶血試驗。

1.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)進行處理，并采用獨立樣本t檢驗進行分析。數(shù)值數(shù)據(jù)用“平均值±標準差()”表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE圖譜分析

采用SDS-PAGE對自提鱈魚皮明膠樣品和市售明膠的亞基成分進行了分析。自提鱈魚皮明膠由3條α鏈 (α1，α2和α3) 和1條β鏈構(gòu)成，與斑點叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) 和胡鯰 (Clarias gariepinus)皮中提取的明膠結(jié)構(gòu)類似[20-21]，具有典型的Ⅰ型膠原蛋白電泳條帶特征 (圖1) 。α鏈分子量在100～135 kD，由于α1和α3分子量十分接近，所以在SDS-PAGE凝膠上形成一個難以區(qū)分的條帶。自提鱈魚皮明膠β鏈的分子量約為245 kD，但在市售明膠的電泳圖譜中沒有觀察到清晰的條帶。根據(jù)SDSPAGE結(jié)果推斷出鱈魚皮明膠是由Ⅰ型膠原蛋白變性得到的，與市售明膠對比，自提鱈魚皮明膠樣品條帶清晰，幾乎沒有降解，可以作為醫(yī)用止血敷料的主要材料。

圖1 鱈魚皮明膠的SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of Pacific cod skin gelatin

2.2 不同明膠濃度對止血敷料理化表征的影響

不同明膠濃度對復(fù)合止血敷料理化性能的影響見表1。隨著明膠濃度的增加，復(fù)合敷料的抗張強度從 (0.010 0±0.003 7) MPa提高至 (0.085 9±0.003 6) MPa，斷裂伸長率從 (7.54±0.37)%下降到(1.36±0.30)%。明膠質(zhì)量濃度超過10 mg·mL-1時，其抗張強度間無明顯差異 (P＞0.05)，而斷裂伸長率則隨著明膠濃度的增大而逐漸減小，說明隨著明膠濃度的增大，復(fù)合止血敷料的脆性和硬度增加，導致延伸性受到較大影響。如果敷料的機械強度較差則不能抗擊血液沖擊，容易造成二次出血，因此機械強度是衡量敷料質(zhì)量的一個重要指標。

表1 不同明膠濃度對復(fù)合止血敷料理化性能的影響Table 1 Physical and chemical properties of composite hemostatic sponge with different gelatin concentration

因為敷料需要吸收大量的傷口滲出物，防止細菌入侵傷口，因此吸水性和持水性是其理化性質(zhì)的重要指標。吸水性的變化趨勢與抗張強度相同，明膠質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1時，取得最大倍數(shù)(49.20±2.24)，高于王運智[22]通過冷凍干燥法和自組裝法得到的魚皮膠原止血海綿的吸水倍數(shù)(33.6和11.9)。明膠海綿的高吸水性使其在應(yīng)用時可吸附大量血液，從而對滲血表面造成局部壓迫，達到止血目的。持水性則隨著明膠濃度的增加從(21.00±0.20)% 升至 (37.99±0.30)%。當明膠質(zhì)量濃度低于10 mg·mL-1時，敷料微觀結(jié)構(gòu)比較松散，吸水后無法保持較為完整的形狀。當明膠質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1時，敷料結(jié)構(gòu)過于緊密，孔隙較小，導致吸水性能下降但持水率較高。

戊二醛可以與明膠中賴氨酸和羥基賴氨酸殘基的自由氨基反應(yīng)形成席夫堿型化合物，還可以與海藻酸鈉陰離子結(jié)構(gòu)表面的羥基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)度隨著明膠濃度的增大而減小，明膠質(zhì)量濃度超過10 mg·mL-1時變化不大 (P＞0.05)。這說明在明膠濃度較低時，暴露出的交聯(lián)位點能夠完全被戊二醛利用，隨著明膠濃度的增加，所能交聯(lián)的位點是有限的，所以交聯(lián)度逐漸趨于穩(wěn)定。

綜上所述，明膠質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1時，醫(yī)用復(fù)合止血敷料具有良好的物理性能，有利于快速吸收滲出物和血漿，加速凝血過程。

2.3 大鼠股動脈模型、肝損傷模型及尾部模型的止血效果

斷尾止血實驗過程見圖2-a。與自然止血組的(485±11) s相比，實驗組和市售明膠海綿組均能明顯縮短斷尾止血所用時間(P＜0.01)，且實驗組止血時間要短于市售明膠海綿組(P＜0.05)。肝創(chuàng)面模型的實驗過程見圖2-b，止血指標的結(jié)果表明(圖2-d)，實驗組止血時間為 (108±4) s，短于羅非魚 (Oreochromis mossambicus) 魚皮膠原海綿 (131 s)[22]。股動脈模型的實驗過程見圖2-c，切開動脈，立刻有大量血液涌出且壓力較大，對止血敷料的要求較高，自然止血組無法在一定時間完成止血。實驗組的止血時間為 (64±9) s，明顯優(yōu)于市售明膠海綿組的 (87±9) s (P＜0.01)，說明實驗組對出血量大、壓力強的動脈出血有一定的控制作用。

圖2 復(fù)合止血敷料的止血性能評價Fig. 2 Hemostatic evaluation in vivo with different model

結(jié)果表明，明膠復(fù)合止血敷料的吸水性和多孔結(jié)構(gòu)有利于血液的吸收，同時明膠與海藻酸鈉起到了復(fù)配協(xié)同止血效果[23]。Wang等[24]制備了含海藻酸鈣多孔微球的殼聚糖復(fù)合海綿，與純殼聚糖和凝膠海綿相比，可以縮短止血時間、減少失血量。因此，將海藻酸鈉共混到明膠中，可促進血小板黏附和各種凝血因子的活化[25]。復(fù)合止血敷料在吸收組織滲出液后轉(zhuǎn)變?yōu)槟z形態(tài)，可以持續(xù)為傷口提供潮濕環(huán)境，促進傷口愈合。

2.4 APTT、PT、TT分析和血小板活性因子檢測

APTT是內(nèi)源凝血系統(tǒng)較為敏感和最為常用的篩選指標，PT測定是外源性凝血系統(tǒng)的篩選實驗，TT是指在血漿中加入標準化的凝血酶后血液凝固的時間。因此，試驗采用APTT、PT和TT分析方法探討明膠復(fù)合止血敷料誘導的凝血途徑。與陰性對照組相比，實驗組在第5、第15、第30和第60 分鐘4個不同浸提時間點的APTT均有極顯著降低(P＜0.01，圖3-a)，說明內(nèi)源性凝血系統(tǒng)是明膠復(fù)合止血敷料的主要凝血途徑。據(jù)報道，海藻酸鈉的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以為血細胞提供支持，吸收大量的血液，激活傷口附近的凝血因子，誘導凝血的內(nèi)部通路[25]。復(fù)合止血敷料和市售明膠海綿對PT無顯著影響 (圖3-b)，表明它不刺激外源性的凝血途徑。明膠復(fù)合止血敷料和市售明膠海綿在第5、第15和第60分鐘時TT顯著降低(P＜0.01，圖3-c)，通過縮短凝血接觸活化時間實現(xiàn)快速止血。Li等[26]證實，明膠微球能有效誘導紅細胞聚集，改善凝血時間。Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)殼聚糖/硅藻-生物硅復(fù)合海綿通過激活內(nèi)源性凝血途徑加速了凝血。因此，明膠復(fù)合止血敷料可激活內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑，縮短血液凝固接觸活化時間，活化Ⅷ、Ⅻ、Ⅺ等凝血因子，達到快速止血的目的。

對血小板活性因子TXB2、PF4和P-選擇素的含量進行測定，可以判定明膠復(fù)合止血敷料對血小板黏附、聚集和活化等生理功能的作用，結(jié)果見圖3-d—3-f。與對照組相比，其他各組均能顯著增加血小板活性因子的釋放量 (P＜0.05)，從而快速有效激活血小板。此外，浸提時間的長短并不影響血小板活性因子的釋放。

圖3 不同樣品對活化部分凝血酶時間、凝血酶原時間和凝血酶時間血小板活性釋放因子血栓烷素B2、血小板第四因子和P-選擇素的影響Fig. 3 Effect of different samples on APTT, PT, TT and release of platelet active factors (TXB2, PF4 and P-selection)

綜上所述，復(fù)合止血敷料在兩方面表現(xiàn)出有效的止血能力：1) 復(fù)合止血敷料具有適當尺寸和分布均勻的三維網(wǎng)絡(luò)多孔結(jié)構(gòu)，使其具有快速的液體吸收性和良好的機械性能；2) 明膠海藻酸鈉復(fù)合敷料能夠激發(fā)內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑，加速各種凝血因子的釋放從而加速凝血[28]。

2.5 生物相容性評價

急性全身毒性試驗是生物安全評價的一個重要指標，通常用于評價生物醫(yī)學材料或其浸出液對人體的影響[29]。對大鼠注射后的日?；顒?、存活狀況和中毒情況進行觀察，發(fā)現(xiàn)實驗組及陰性對照組的大鼠在觀察期72 h內(nèi)，無任何中毒癥狀發(fā)生，而陽性對照組則在注射后隨即出現(xiàn)明顯的震顫和驚厥反應(yīng)，活動量和爬行速度明顯下降。注射后72 h內(nèi)各組大鼠的平均體質(zhì)量見表2，實驗組和陰性對照組的大鼠體質(zhì)量變化均呈穩(wěn)步增長趨勢，說明制備的鱈魚皮明膠復(fù)合止血敷料無急性毒性，符合醫(yī)用材料全身急性毒性的評價標準。

采用皮膚刺激試驗和皮內(nèi)刺激試驗評價明膠醫(yī)用敷料的刺激效果。相較于b處陽性對照組出現(xiàn)嚴重的皮膚變紅以及組織腫脹等刺激現(xiàn)象，a、d處的實驗組浸提液并未引起任何的皮膚刺激問題，注射后72 h內(nèi)皮膚狀態(tài)均表現(xiàn)良好，與c處的陰性對照組結(jié)果一致，說明鱈魚皮明膠復(fù)合止血敷料對皮膚無潛在刺激作用 (圖4)。受損皮膚刺激實驗的結(jié)果見表2，實驗組部分大鼠出現(xiàn)輕微紅斑，但24 h后消失。復(fù)合止血敷料的原發(fā)性刺激指數(shù)(PII) 為0.22，小于0.5，屬于極輕微刺激性，制備的明膠復(fù)合止血敷料符合生物材料單次接觸皮膚試驗標準。

圖4 注射24 h、48 h和72 h后的皮內(nèi)刺激情況Fig. 4 Intradermal stimulation at 24th, 48th and 72nd hour after injection

溶血率是血液與材料相互作用的體外評價標準[30]。GB/T 16886指出材料與血液接觸時紅細胞的破裂率不宜過高，即溶血率低于5%的材料才具備良好的血液相容性。本實驗測定的鱈魚皮明膠復(fù)合止血敷料的溶血率為1.51%，低于5% (表2)，符合國家生物材料評價規(guī)定的安全范圍。

表2 急性全身毒性試驗、皮膚刺激試驗和溶血試驗結(jié)果Table 2 Results of acute systemic toxicity assay, dermal irritation test and hemolysis ratio

生物材料進入臨床的必要評價是生物安全性評價，綜上所述，鱈魚皮明膠復(fù)合止血敷料符合國家醫(yī)療器械相關(guān)標準，為其臨床應(yīng)用提供了安全性理論依據(jù)。

3 結(jié)論

本文以鱈魚皮為原料提取明膠，并通過SDSPAGE對其亞基結(jié)構(gòu)進行研究。在交聯(lián)劑作用下將鱈魚皮明膠與海藻酸鈉進行復(fù)配，冷凍干燥得到復(fù)合止血敷料。該復(fù)合敷料具有良好的機械性能、吸水性、持水性和均一的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，符合傷口海綿的要求。明膠復(fù)合止血敷料可以明顯縮短APTT和TT，激活內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑，還可以明顯增加TXB2、PF4和P-選擇素的釋放量，通過激活血小板來加速凝血過程。此外，一系列的生物相容性實驗表明，復(fù)合止血敷料無全身急性毒性，不會引起紅斑、水腫等皮膚刺激現(xiàn)象，溶血率為1.51%，符合國家醫(yī)療器械標準 (＜5%)。因此，鱈魚皮源明膠復(fù)合止血敷料可作為一種新型可吸收醫(yī)用敷料應(yīng)用于組織工程之中。