苗鈞魁，張雅婷, ，張圣國(guó)，鄭志紅，王致鵬，王海英

1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所/青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266071

2. 青島科技大學(xué)，山東 青島 266061

3. 河北省農(nóng)業(yè)項(xiàng)目規(guī)劃中心，河北 石家莊 050000

4. 大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023

5. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109

海帶 (Laminaria japonica) 提取物作為天然生物刺激素的一種，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[1-3]，其在提高作物產(chǎn)量[4-10]、促進(jìn)種子發(fā)芽[11-13]、根系生長(zhǎng)[14-16]和代謝產(chǎn)物積累[17]等方面均有顯著作用，還可增強(qiáng)植物對(duì)各種脅迫的抗逆性，例如冷凍脅迫、鹽分脅迫、水分脅迫、熱脅迫和病原體脅迫[17-24]。海帶提取物的功效性在于其富含生物活性物質(zhì)，包括各種植物激素 (Plant hormones, PHS)、甜菜堿、甾醇、獨(dú)特的多糖和相應(yīng)的低聚物 (海藻酸鹽、海帶淀粉和巖藻多糖等) 以及礦物質(zhì)等[2-3]。這些化合物參與植物光合作用或作為細(xì)胞分裂、增殖及分化和器官發(fā)生的誘導(dǎo)劑，并表現(xiàn)出協(xié)同活性[25]。其中植物激素被認(rèn)為是最重要的因素，痕量的植物激素可改變植物的生長(zhǎng)和發(fā)育模式，從而有效地促進(jìn)生理過程[26-27]。此外，褐藻中含量最豐富的海藻酸鹽降解生成的活性成分海藻酸寡糖 (Alginate oligosaccharides, AOS) 被證實(shí)在植物根系發(fā)育等方面具有顯著的促進(jìn)作用[15]。

海帶是我國(guó)最大的養(yǎng)殖海藻品種，中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒顯示2020年我國(guó)海帶年產(chǎn)量已達(dá)165×104t[28]。海帶主要用作飼料和食物，也是生產(chǎn)海藻酸鈉和海帶提取物主要原料之一[29-30]。破壞褐藻細(xì)胞壁從而使生物活性物質(zhì)釋放，是海帶提取物生產(chǎn)工藝最重要的一環(huán)。用稀堿或酸堿溶液進(jìn)行化學(xué)處理 (Chemical processing, CP) 一直是海帶提取的主要方法[2-3,31]，但需要高濃度的酸堿和較長(zhǎng)的提取時(shí)間，存在污染環(huán)境、提取效率低、生物活性物質(zhì)被破壞等缺點(diǎn)[32-33]。因此亟需高效環(huán)保的替代工藝，實(shí)現(xiàn)海帶原料中有效成分的高效提取。

目前，已開發(fā)出特異性纖維素酶可有效破壞藻類細(xì)胞壁，同時(shí)褐藻膠裂解酶可將褐藻細(xì)胞間質(zhì)中的海藻酸鹽水解成可溶性海藻酸寡糖[34-35]，從而使胞內(nèi)成分得到有效釋放和提取[36]，酶解工藝 (Enzymolysis processing, EP) 已成為一種可行的綠色提取方法。此外，EM菌劑作為一種生態(tài)調(diào)理劑在農(nóng)業(yè)上被廣泛應(yīng)用，在酶解工藝基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加EM菌劑，通過酶解與微生物發(fā)酵聯(lián)用 (Combined enzymolysis and microbial fermentation processing, CEMP) 可建立一種提取新方法[23]。本研究對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)工藝、酶解工藝和酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝得到的海帶提取物中11種植物激素、海藻酸寡糖含量和分子量進(jìn)行系統(tǒng)分析，為不同褐藻生物提取工藝效果比較提供了理論依據(jù)，也為海藻綠色生物提取技術(shù)的開發(fā)提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用原料為干海帶，購(gòu)自尋山集團(tuán)有限公司，海帶加工日期為2019年5—6月，整顆海帶干燥除濕后研磨至約50目，室溫保存直至使用。D-葡萄糖醛酸和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich,Inc., St. Louis, USA。纖維素酶 (CellicCTec2) 由諾維信中國(guó)投資有限公司贈(zèng)予。EM菌 (有效菌活≈6×109CFU) 購(gòu)自鄭州百億寶生物科技有限公司，含乳酸菌、抗菌肽、芽孢桿菌、光合細(xì)菌、酵母菌等。

吲哚乙酸 (IAA)、吲哚丁酸 (IBA)、脫落酸(ABA)、玉米素 (cZ)、反式玉米素核苷酸(tZR)、赤霉素A3 (GA3)、水楊酸 (SA)、茉莉酸 (JA) 購(gòu)自Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, USA。赤霉素A1(GA1)、赤霉素A4 (GA4) 和赤霉素A7 (GA7) 的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 Toronto Research Chemicals, Inc., North York, CA。

本研究中使用的所有其他試劑均為分析純。

1.2 褐藻膠裂解酶的制備

褐藻膠裂解酶使用前期研究獲得的Alyw203，從弧菌W2中克隆獲得并在食品級(jí)解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中成功表達(dá)[37]。將表達(dá)菌株在YPD 液體種子培養(yǎng)基 (20.0 g·L-1葡萄糖、20.0 g·L-1蛋白胨、10.0 g·L-1酵母提取物) 中培養(yǎng)20 h，然后換用 GPPB培養(yǎng)基 {20.0 g·L-1葡萄糖、1.0 g·L-1硫酸銨 [(NH4)2SO4]、2.0 g·L-1酵母提取物、2.0 g·L-1磷酸二氫鉀 (KH2PO4)、3.0 g·L-1磷酸鉀 (K2HPO4)和 0.1 g·L-1硫酸鎂 (MgSO4·7H2O)}，接種量為 5%。培養(yǎng)60 h后，收集酵母培養(yǎng)物并以5 000×g離心，回收上清液作為褐藻膠裂解酶使用。

1.3 不同工藝制備海帶提取物

1.3.1 化學(xué)法制備海帶提取物

將10 g海帶干粉加入100 mL含有1.5 g氫氧化鉀 (KOH) 的蒸餾水中，在紅外線加熱爐中加熱沸騰并保持約10 h，不斷添加蒸餾水以保持總體積恒定，直至體系黏度低于10 mPa·s。將混合物以5 000 r·min-1離心5 min，上清液即為化學(xué)工藝海帶提取物，凍干后收集作為樣品。制備3個(gè)重復(fù)樣品。

1.3.2 酶解法制備海帶提取物

將10 g海帶干粉加入100 mL蒸餾水 (含20 mmol·L-1，pH 7.0磷酸鹽緩沖液) 中，40 ℃ 預(yù)熱后將0.3 g纖維素酶和0.5 mL褐藻膠裂解酶溶液加入混合物中，40 ℃下持續(xù)攪拌6～8 h，體系黏度低于10 mPa·s時(shí)停止反應(yīng)。將混合物以5 000 r·min-1離心5 min，上清液即為酶解工藝海帶提取物，凍干后收集作為樣品。制備3個(gè)重復(fù)樣品。

1.3.3 酶解發(fā)酵聯(lián)用法制備海帶提取物

將10 g海帶干粉加入100 mL蒸餾水 (含20 mmol·L-1，pH 7.0磷酸鹽緩沖液) 中，40 ℃ 預(yù)熱后將0.3 g纖維素酶和 0.5 mL褐藻膠裂解酶溶液加入混合物中，保持40 ℃并持續(xù)攪拌反應(yīng)4 h后，將5.0 mL活化的EM菌劑和 0.1 g豆?jié){加入混合物中，置于37 ℃下培養(yǎng)約30 h，直至混合物的黏度低于 10 mPa·s。將混合物在 5 000 r·min-1的條件下離心5 min，上清液即為酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝海帶提取物，凍干后收集作為樣品。制備3個(gè)重復(fù)樣品。

1.4 植物激素含量分析

采用Gupta等[38]和劉雪梅等[39]的改進(jìn)方法，對(duì)樣品中的11種植物激素進(jìn)行分析。50 mg海帶干粉或粉狀海帶提取物在-80 ℃下冷凍1 h，然后在液氮浴中研磨成更細(xì)的粉末。在粉末中加入2 mL萃取溶劑 [V(甲醇)∶V(甲酸)∶V(水)=15∶1∶4]，超聲輔助 (功率30 W，頻率40 kHz) 萃取20 min。將混合物在 -20 ℃下保持16 h，然后以10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，殘留物再用1 mL萃取溶劑萃取2次。合并提取的上清液在35 ℃下減壓蒸發(fā)，溶解在1 mL甲醇 (0.1%甲酸) 中。再次以10 000 r·min-1離心 10 min，上清液過 0.22 μm 濾膜后用于分析。

LC-MS/MS分析使用 Agilent 1290系列HPLC與配備電噴霧電離接口的API 6500 Qtrap (AB Sciex)質(zhì)譜儀聯(lián)用進(jìn)行。使用美國(guó)安捷倫科技有限公司的 Poroshell 120 SB-C18 反相柱 (150×2.1 mm, 2.7 μm)進(jìn)行HPLC分離。流動(dòng)相由含0.1%甲酸的甲醇(A)和含0.1%甲酸的水 (B)組成；使用梯度0～1 min 20% A、1～9 min 20%～80% A、9～10 min 80%A、10～10.1 min 80%～20% A和10.1～15 min 20%A。流動(dòng)相流量流速為 0.3 mL·min-1，柱溫保持在30 ℃。源參數(shù)包括霧化器氣體65 psi；加熱器氣體70 psi；離子源溫度400 ℃；離子噴霧電壓為4 500 V。使用自動(dòng)進(jìn)樣器10 μL等分進(jìn)樣。

1.5 海藻酸鹽含量分析

應(yīng)用改良的間羥基聯(lián)苯方法分析樣品中海藻酸鹽含量[40]。將 10 μL 氨基磺酸 (4 mol·L-1)加入到1 mL稀釋樣品中 (×103稀釋倍數(shù))，然后在冰水浴中緩慢加入3 mL四硼酸鈉-硫酸溶液 (75 mmol·L-1)?；靹蚝蠓兴?5 min，冷卻至室溫，將100 μL 0.5%氫氧化鈉 (NaOH)溶液 (含0.15%間羥基聯(lián)苯) 添加到樣品中并渦旋混合。所有樣品均在525 nm處讀取吸光值。使用去離子水代替樣品作為對(duì)照。用葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 (0、10、20、40、60、80、100 μg·mL-1) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。海藻酸鹽的提取率為提取物中總海藻酸鹽與海藻原料中海藻酸鹽的質(zhì)量比。

1.6 海藻酸寡糖聚合度分布分析

將不同工藝海帶提取物凍干粉 (0.05 g) 完全溶解在 10 mL 0.1 mol·L-1碳酸氫銨 (NH4HCO3)中，并以 10 000 r·min-1離心 10 min。上清液通過 0.22 μm濾膜進(jìn)一步凈化。采用色譜柱Superdex TM Peptide 10/300GL (GE，美國(guó))，液相色譜UltiMate 3000(Dionex，美國(guó)) 配備示差折光檢測(cè)器 (RID) 用于分子量分析。流動(dòng)相為0.1 mol·L-1碳酸氫銨，流速為 0.1 mL·min-1，柱溫為 35 ℃，進(jìn)樣量為 20 μL。不同聚合度的海藻酸寡糖 (AO) 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自青島海洋醫(yī)藥研究院。

1.7 葡萄糖含量分析

發(fā)酵液中葡萄糖檢測(cè)方法參照GB 5009.8—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》中第一法高效液相色譜法。

2 結(jié)果與分析

2.1 干海帶原料和各海帶提取物中植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

采用HPLC-MS/MS分析了11種植物激素(ng·g-1，，表1)。結(jié)果顯示，無論是干海帶原料還是海帶提取物中，吲哚乙酸 (IAA) 均為含量最高的植物激素，這與已有的研究報(bào)道一致。Stirk等[41]從巨藻 (Macrocystis pyrifera) 提取的新鮮海藻濃縮物中含約11.67 pmol·mL-1IAA、0.01 pmol·mL-1cZ 和0.29 pmol·mL-1tZR，IAA 也是最豐富的植物激素，而tZR和cZ檢測(cè)到的水平較低；南非Kelpak海藻肥產(chǎn)品中的脫落酸 (ABA) 質(zhì)量濃度約為 0.31～20.70 pg·mL-1，GA1—GA7約為0.01～4.47 pg·mL-1[42]。干海帶原料及海帶提取物還具有相當(dāng)數(shù)量的茉莉酸 (JA) 和水楊酸 (SA)，其主要生理作用是緩解植物中細(xì)菌或真菌引起的生物脅迫[43-44]。

表1 干海帶原料與不同提取工藝制備樣品中植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of 11 PHS species in seaweed material and seaweed extracts by different methodsng·g-1

表1顯示原料中各種植物激素的含量顯著高于化學(xué)工藝和酶解工藝的海帶提取物中的含量，其他類別的植物激素含量也與IAA有相同趨勢(shì)，說明化學(xué)工藝和酶解工藝均對(duì)植物激素提取有較大的破壞。酶解發(fā)酵聯(lián)合工藝海帶提取物中某些植物激素的含量顯著高于其他樣品，如IAA和ABA含量是干海藻原料中相應(yīng)含量的2倍以上，而JA的含量更是相較于原料增高了近60倍。這些性狀可能是由EM發(fā)酵菌劑中的微生物區(qū)系引起，因?yàn)樵S多微生物菌株可以產(chǎn)生植物激素作為代謝產(chǎn)物[45-46]。

2.2 不同海帶提取物中海藻酸鹽含量和海藻酸鹽提取率分析

圖1為不同海帶提取物中海藻酸鹽的提取率。化學(xué)工藝海帶提取物的海藻酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，僅22.3%；酶解工藝海帶提取物和酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝海帶提取物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均約35%?；瘜W(xué)工藝只能從干海藻原料中提取約38.1%的海藻酸鹽，而酶解工藝的提取率接近100%，酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝的提取率則為82.3%。說明酶解工藝是將海藻中的高分子海藻酸鹽分解為可溶性海藻酸寡糖的最有效方法。因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)會(huì)利用部分海藻酸寡糖[47]，故酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝的海藻酸鹽提取率較低。

圖1 不同加工處理的海藻酸鹽含量及其提取率Fig. 1 Alginate content and its extract rate in seaweed extracts by different processing methods

2.3 不同海帶提取物中海藻酸寡糖的分子量分布

在前期研究中，筆者測(cè)試了該褐藻膠裂解酶將海藻酸鹽降解成海藻酸寡糖的能力，產(chǎn)物聚合度(Degree of polymerization, DP) 為 2～7[48]。在本研究的化學(xué)處理過程中，由于強(qiáng)堿和高溫的影響，化學(xué)工藝提取物只能得到較低分子量的寡糖，海藻酸寡糖DP為1～2，而酶解和酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝提取物中的海藻酸寡糖DP分別為1～7和2～7，分子量約為200～1 600 D (圖2)。不同的褐藻膠裂解酶將海藻酸鹽降解為不同DP的海藻酸寡糖。黃桿菌屬(Flavobacterium sp.) UMI-01的褐藻膠裂解酶FlAlyA將海藻酸鹽降解為DP 2～4的寡糖[49]，黃桿菌屬S20的褐藻膠裂解酶Alg2A產(chǎn)生高DP海藻酸寡糖，如五糖、六糖和七糖[50]。目前研究使用的裂解酶可以降解海藻酸鹽產(chǎn)生DP 1～7的寡糖，而酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝提取物得到DP 2～7的寡糖，這可能是由于微生物的同化利用主要使用單糖所致。

圖2 不同工藝海帶提取物中不同聚合度海藻酸寡糖的含量Fig. 2 Content of alginate oligosaccharides with different degree of polymerization in seaweed extracts from different processing methods

海藻酸寡糖的生物活性已被廣泛報(bào)道。大分子量或更高古洛糖醛酸/甘露糖醛酸比的海藻酸寡糖可能與大豆中較高的甘油三酯誘導(dǎo)活性相關(guān)[51]。也有報(bào)道稱富含甘露糖醛酸的海藻酸寡糖會(huì)增加植物中苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 和過氧化物酶 (POD)的活性[52]。海藻酸寡糖還具有促進(jìn)胡蘿卜和大米植物根系增長(zhǎng)的活性，并且與寡糖的聚合度相關(guān)[16]。

2.4 酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝中葡萄糖、海藻酸鹽及植物激素含量變化

EM菌因具有土壤改良、生根壯苗等多種有益效果，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。本研究中，為驗(yàn)證該菌種是否有利于生物活性物質(zhì)的提取，將EM菌接種在酶解工藝提取物中30 h。發(fā)酵24 h，葡萄糖幾乎完全被細(xì)胞生長(zhǎng)消耗，海藻酸鹽從2.6 g·L-1小幅下降至2.3 g·L-1，這可能由于EM菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中利用原料中的碳源實(shí)現(xiàn)了增殖，并且發(fā)酵過程中發(fā)酵液中植物激素含量顯著增加 (圖3)。在酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝提取物中，IAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(64.59 ng·g-1)，JA 次之 (13.09 ng·g-1)，ABA 也達(dá)1.28 ng·g-1。相較于海帶干粉原料中的植物激素含量，IAA和ABA含量是海帶干粉原料的2倍多，JA含量接近6倍 (表1)；IBA和反式玉米核苷酸(tZR) 含量也明顯提升。結(jié)果表明EM菌在以提取物發(fā)酵培養(yǎng)過程中可以產(chǎn)生植物激素代謝產(chǎn)物，大幅增加提取物中的植物激素含量，進(jìn)而增強(qiáng)了提取物作為海藻肥產(chǎn)品的功效[53]。因此，EM菌的生物轉(zhuǎn)化作用是增加海帶提取物中植物激素含量的有效手段。

圖3 發(fā)酵過程中葡萄糖、海藻酸鹽、吲哚乙酸和茉莉酸含量變化Fig. 3 Contents of glucose, alginate, IAA and JA during fermentation

3 結(jié)論

本研究采用酶解工藝從海帶中提取植物激素和海藻酸寡糖，酶解處理采用3%纖維素酶和5%褐藻膠裂解酶，酶解工藝AOS提取率達(dá)90.8%，寡糖DP為1～7，PHS和AOS的提取率均遠(yuǎn)高于化學(xué)工藝。進(jìn)一步通過EM菌對(duì)酶解工藝提取物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，可實(shí)現(xiàn)IAA、JA、ABA等植物激素的顯著增加?；贏OS和PHS含量的比較，酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝比傳統(tǒng)化學(xué)工藝和酶解工藝有更好的提取效果。本研究為海藻肥生產(chǎn)工藝提取效果的比較提供了數(shù)據(jù)支撐，也為海藻生物活性物質(zhì)綠色生物提取技術(shù)開發(fā)提供了新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)EM菌對(duì)海帶酶解工藝提取物的生物轉(zhuǎn)化作用，但其作用機(jī)制尚不明確，且酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝作用的最佳工藝尚需優(yōu)化。下一步將開展菌種篩選和發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化等研究，實(shí)現(xiàn)酶解發(fā)酵聯(lián)用工藝的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，為我國(guó)高值農(nóng)用海藻產(chǎn)品的加工開辟一條新路徑。