miRNA-122、224在肝細(xì)胞癌患者肝組織和血清中的表達(dá)水平及臨床意義

王海溥 郭俊強(qiáng) 岳愛(ài)民

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生癌變導(dǎo)致的疾病，是我國(guó)最為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤。其致死率在所有腫瘤中位列第三，具有惡性程度高、病死率高、預(yù)后差等特點(diǎn)[1,2]，且一經(jīng)發(fā)現(xiàn)常為晚期，大多數(shù)患者已失去手術(shù)治療的價(jià)值，而目前針對(duì)晚期HCC的治療手段仍為傳統(tǒng)放化療。近年來(lái)索拉菲尼用于治療晚期HCC的效果較為顯著[3]，但晚期HCC患者的五年生存率仍低于30%。HCC嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的健康，尋找有效治療HCC的方法十分重要?，F(xiàn)階段的許多研究從分子生物學(xué)角度入手，探究HCC的發(fā)病原因和機(jī)制，尋找新的HCC相關(guān)靶點(diǎn)，為HCC的臨床治療尋找理論依據(jù)。近年來(lái)報(bào)導(dǎo)的與HCC相關(guān)研究多與微小RNA(mircoRNA，miR)相關(guān)，有研究表明miR-122和miR-224的表達(dá)與HCC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[4,5]。本研究對(duì)本院收治的肝癌患者血清和組織中miR-122和miR-224表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，旨在為HCC的診斷和治療提供新的思路，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇本院肝膽外科2017年3月至2020年3月接受肝臟惡性腫瘤根治術(shù)的62例HCC患者作為研究對(duì)象，其中男性35例，女性27例納入研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)中病例確診為HCC，患者全部符合HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②患者未接受過(guò)放、化療和靶向治療；③流行病學(xué)資料和臨床資料完整，包括患者年齡、性別、病理分級(jí)、腫瘤直徑等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他肝臟占位病變；②患者接受過(guò)放療、化療和靶向治療；③未在我院接受治療者；④伴有嚴(yán)重臟器功能損害患者。選擇同期醫(yī)院收治非惡性肝占位病變患者62例，作為對(duì)照組其中男性31例，女性31例，收集肝臟組織。研究組患者年齡35～75歲，平均年齡(53.3±4.7)歲；對(duì)照組年齡32～71歲，平均年齡(51.6±3.4)歲。本研究納入對(duì)象均簽署對(duì)研究的知情同意書(shū)并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 肝細(xì)胞癌組織中miRNA-122和miRNA-224的檢測(cè)

使用Trizol試劑盒(購(gòu)買自北京天根生化有限公司)提取組織中總RNA，使用Nanodrop儀器檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量，OD260/OD280數(shù)值>1.8證明所提取RNA質(zhì)量較好，無(wú)污染。提取到的樣品置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诳倶悠分刑崛? μl總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用SuperScript IV Reverse Transcriptase(購(gòu)買自美國(guó)thermofisher公司)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書(shū)合成cDNA，反應(yīng)條件為55℃ 10 min，80℃ 10 min針對(duì)目標(biāo)序列使用Primer premier6.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工有限責(zé)任公司合成引物。miRNA-122上游引物序列為：5'-CCATACCACCCTGAACGC-3'，下游引物序列為：5'-GTATTCCCAGGCGGTCTC-3'；miRNA-224上游引物序列為：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列為：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；U6引物上游序列為：5'-CGCTTCGGCAGACATATAC-3'，下游引物序列為：5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'。以cDNA作為模板，U6引物作為內(nèi)參，使用q-PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-122和miRNA-224在HCC患者和非惡性肝占位病變患者組織中的相對(duì)表達(dá)情況。建立20 μl反應(yīng)體系，上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、cDNA模板1 μl、dd H2O 7.8 μl、q-PCR Mix反應(yīng)液10.4 μl。反應(yīng)條件為92℃預(yù)變性5 min，然后92℃ 60 s、54℃ 60 s、72℃ 60 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在PCR儀(HEMA96TC珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)中進(jìn)行。miRNA-122和miRNA-224相對(duì)表達(dá)使用2-△△Ct法進(jìn)行測(cè)定。△△Ct=(CTmiRNA-CTU6RNA)實(shí)驗(yàn)組-(CTmiRNA-CTU6RNA)對(duì)照組。

1.3 患者血清中miRNA-122和miRNA-224的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，檢測(cè)HCC患者和非惡性肝占位病變患者血清中miRNA-122和miRNA-224表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組患者均在入院后次日晨起空腹時(shí)抽取靜脈血4 ml于抗凝管中，離心制備血清，使用ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)并嚴(yán)格按照試劑盒中說(shuō)明書(shū)所示操作步驟，檢測(cè)患者血清中miRNA-122和miRNA-224的表達(dá)水平。檢測(cè)后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其濃度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得出檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組miRNA-122和miRNA-224水平比較

結(jié)果表明：研究組組織中miRNA-122水平為(1.26±0.33)，對(duì)照組為(3.65±0.53)，研究組低于對(duì)照組(P<0.001)；研究組組織中miRNA-224水平為(4.19±0.41)，對(duì)照組為(2.56±0.32)，研究組高于對(duì)照組(P<0.001)。

2.2 兩組血清中miRNA-122和miRNA-224水平比較

結(jié)果表明：研究組血清中miRNA-122水平為(39.12±4.13)，對(duì)照組為(73.65±7.26)，研究組低于對(duì)照組(P<0.001)；研究組血清中miRNA-224水平為(74.96±9.58)，對(duì)照組為(41.87±3.14)，研究組高于對(duì)照組(P<0.001)。

2.3 肝細(xì)胞癌組織中miRNA-122和miRNA-224水平與其臨床病理特征的關(guān)系

HCC患者組織中miRNA-122低表達(dá)和miRNA-224高表達(dá)與腫瘤直徑、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和外周血甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)水平相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與患者年齡和性別無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 HCC組織中miRNA-122和miRNA-224水平與其臨床病理特征的關(guān)系

2.4 肝細(xì)胞癌患者血清中miRNA-122和miRNA-224水平與其臨床病理特征的關(guān)系

HCC患者血清中miRNA-122低表達(dá)和miRNA-224高表達(dá)與腫瘤直徑、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和外周血AFP水平相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡和性別無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 HCC患者血清中miRNA-122和miRNA-224水平與其臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

HCC是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。早期HCC患者常無(wú)明顯癥狀和體征，難以被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者一經(jīng)診斷即為中晚期，失去手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)。中晚期HCC具有惡性程度高、對(duì)傳統(tǒng)放化療不敏感、手術(shù)治療后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，患者五年生存率較低[7]。外科手術(shù)治療是HCC患者早期主要的治療手段，近幾年對(duì)腹腔鏡下肝癌切除術(shù)的研究和報(bào)導(dǎo)逐漸增多，因其創(chuàng)傷小和出血少的優(yōu)點(diǎn)逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)手術(shù)治療[8]。晚期HCC患者的主要治療手段為化療，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE術(shù))和索拉菲尼治療中晚期肝癌的效果優(yōu)于傳統(tǒng)化療，但患者預(yù)后仍較差[9-10]，故HCC的早期診斷在HCC的治療過(guò)程中十分重要。

miRNA是一種長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA分子，之前的研究表明許多miRNA不僅參與人體的正常生命活動(dòng)，在某些疾病的發(fā)生和發(fā)展中也起重要的作用[11]。如miR-95的高表達(dá)具有促進(jìn)骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡的作用[12]；miR-9在胃癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[13]；miR-17在乳腺癌組織中高表達(dá)通常與患者預(yù)后不利良密切相關(guān)[14]。本研究中miR-122是一種在肝臟中高表達(dá)的miRNA，參與了肝臟的多種生理功能，還具有抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用[15-16]。有研究表明miR-122在HCC組織中表達(dá)水平降低，且miR-122的低表達(dá)與HCC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)[17]。最近研究表明miR-224在直腸癌、非小細(xì)胞癌、乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中均有高表達(dá)現(xiàn)象，而且miR-224可通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18-19]。

本研究通過(guò)使用q-PCR和ELISA法對(duì)研究組62例HCC患者和對(duì)照組62例非惡性肝占位病變患者肝臟組織中和血清中的miR-122和miR-224的表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示HCC患者肝臟組織和血清中的miR-122水平較非惡性肝占位病變患者相比顯著下降(P<0.001)；而HCC患者肝臟組織和血清中的miR-224水平明顯上升(P<0.001)，比較文獻(xiàn)結(jié)果與之前的報(bào)導(dǎo)相吻合[20-21]。本研究還發(fā)現(xiàn)HCC患者肝臟組織和血清中miR-122的低表達(dá)與miR-224的高表達(dá)與患者性別和年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，但和HCC腫瘤直徑、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和外周血AFP水平密切相關(guān)(P<0.05)。此研究結(jié)果表明，可通過(guò)檢測(cè)患者血清和肝臟組織中miR-122和miR-224的表達(dá)水平對(duì)HCC腫瘤大小、病理分期和有無(wú)轉(zhuǎn)移進(jìn)行初步判斷。

綜上所述，患者血清和肝臟組織中miR-122和miR-224的表達(dá)水平與患者年齡和性別無(wú)關(guān)，但對(duì)HCC的腫瘤大小、病理分期和有無(wú)轉(zhuǎn)移具有一定的判斷價(jià)值，但其機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。