王雪倩，張慶珍，程鵬，董婷婷，李衛(wèi)國，周喆，王升啟

中國漢族人群66個InDel基因座的遺傳多態(tài)性

王雪倩1,2，張慶珍2，程鵬2，董婷婷2，李衛(wèi)國1，周喆2，王升啟2

1. 河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007 2. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

插入/缺失多態(tài)性(insertion/deletion polymorphism, InDel)遺傳標記是一類由DNA片段的插入或者缺失形成的變異形式，在降解檢材身份識別領域展現(xiàn)出優(yōu)勢。本文從dbSNP數(shù)據(jù)庫中自主篩選66個InDel基因座，基于高通量測序系統(tǒng)建立了一套多重復合擴增體系(66-plex InDels)。通過評估66-plex InDels在251名中國漢族人群的群體遺傳學參數(shù)，分析其法醫(yī)學應用價值。研究結(jié)果表明：經(jīng)過Bonferroni法校正，66個InDel基因座在中國漢族人群中均符合Hardy-Weinberg平衡定律(>0.000 758)，各基因座間處于連鎖平衡狀態(tài)。各基因座平均觀測雜合度(Ho)為0.482，平均期望雜合度(He)為0.483，平均個體識別力(DP)為0.612，平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.365，累計個體識別率(TDP)為0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 428 18。66個InDel基因座的二聯(lián)體累計非父排除概率(CPEduo)為0.999 739，三聯(lián)體累計非父排除概率(CPEtrio)為0.999 999 999 417。結(jié)果表明：66個InDel基因座在中國漢族人群中具有良好的遺傳多態(tài)性，可獨立應用于法醫(yī)個體識別和親權(quán)鑒定研究。

插入/缺失多態(tài)性；中國漢族人群；個體識別；親權(quán)鑒定

短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat, STR)因靈敏度高、鑒別能力強的特點，已廣泛應用于個體識別和親權(quán)鑒定領域[1]。但STR突變率相對較高，約為10–3，在親權(quán)鑒定中可能存在誤判[2]；且片段較長(100～500 bp)，在降解檢材中檢測成功率較低。插入/缺失多態(tài)性(InDel)作為新型遺傳標記，在人類基因組中分布廣泛；突變率明顯低于STR，約為10–8；擴增子較短(<200 bp)，更適用于高度降解樣本的檢測；其二態(tài)結(jié)構(gòu)更易于分型和檢測[3～5]。

目前已有一些研究針對不同國家、不同群體設計了InDel遺傳標記多重擴增體系，通過評估基因座的群體遺傳學相關參數(shù)，為個體識別和親權(quán)鑒定提供了基礎數(shù)據(jù)。國內(nèi)外應用比較廣泛的InDel商品化分型試劑盒包括Investigator?DIPplex試劑盒(德國Qiagen公司)和AGCU InDel 50試劑盒(無錫中德美聯(lián)生物技術有限公司)。Investigator?DIPplex試劑盒以德國人群基因頻率作為主要篩選依據(jù)，對中國人群的鑒定效力較低[6]。30個InDel在北京漢族群體中累積個體識別率(total discrimination power, TDP)為0.999 999 999 985[7]，在貴州仡佬族和苗族人群中的TDP分別為0.999 999 999 34和0.999 999 996 86[8]，但在西班牙人群中TDP高達0.999 999 999 999[9]。AGCU InDel 50試劑盒是我國研制的商品化分型試劑盒，包含47個常染色體InDel基因座，2個Y染色體InDel基因座和1個性別鑒定基因座(Amelogenin)[10]。47個常染色體InDel基因座在漢族人群中的累積個體識別率(TDP)和累計非父排除概率(cumulative probability of exclusion, CPE)分別為0.999 999 999 999 999和0.9997[11]。雖然47個常染色體InDel基因座鑒定效力大于常規(guī)STR體系的TDP[12](0.999 999 999 98)，能夠滿足個體識別需求，但CPEtrio<0.9999[13]，親權(quán)鑒定效力較低，有待進一步提高。

聯(lián)合檢測更多的InDel基因座可以提高體系的鑒定效力，獨立完成個體識別和親權(quán)鑒定研究。本文從dbSNP數(shù)據(jù)庫中自主篩選66個常染色體InDel基因座和一個Amelogenin性別基因座，基于高通量測序系統(tǒng)自主構(gòu)建了一個66 InDel + Amel的多重復合擴增體系(66-plex InDels)。通過251個中國漢族無關個體樣本的DNA分型檢測結(jié)果，分析66個InDel在中國漢族人群中的群體遺傳學參數(shù)進行分析，為個體識別和親權(quán)鑒定提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 InDel篩選流程

本研究基于以人類GRCh37.hg19作為參考基因組的dbSNP數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)數(shù)據(jù)集，采用VCFtools[14]和plink軟件[15]篩選出在東亞人群中有較高鑒定效力的InDel基因座。具體篩選標準如下：(1)位于常染色體內(nèi)含子區(qū)域，全局次要等位基因頻率(global minor allele frequency, GMAF)在0.4～0.5之間的二元多態(tài)性插入/缺失序列，得到17,374個基因座；(2)滿足哈德溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)定律，HWE>0.05，雜合度>0.4，得到1263個基因座；(3)符合連鎖平衡檢驗(LE)，2<0.01，得到987個基因座；(4)不同群體間(東亞、南亞、歐洲、美洲、非洲)群體分化指數(shù)()<0.06，得到549個基因座；(5)InDel基因座片段長度>1 bp，得到172個基因座；(6)同一染色體上，InDel基因座之間物理距離≥10 MB，得到93個基因座。將上述篩選標準得到的93個基因座采用Primer Premier 5.0和MFEprimer軟件[16]進行多重引物設計，考慮到引物特異性、引物長度、退火溫度和引物結(jié)構(gòu)設計等因素，以確保每對引物能夠均衡地擴增，最終確定66個InDel基因座用于復合擴增。66個InDel基因座未見與醫(yī)療敏感信息相關的文獻報道。

1.2 樣本收集和DNA提取

根據(jù)知情同意原則，采集100名中國漢族無關個體外周血樣和151名中國漢族無關個體外周血液制成的FTA血卡，包括河南漢族40例、北京漢族28例、內(nèi)蒙漢族21例、山東漢族21例、云南漢族20例、廣東漢族20例、重慶漢族19例、山西漢族18例、江西漢族18例、湖南漢族16例、浙江漢族16例、安徽漢族14例。外周血樣均采用QIAamp?DNA Investigator試劑盒(德國Qiagen公司)提取DNA。采用Qubit 3.0熒光定量儀(美國Thermo Fisher公司)進行DNA定量，–20℃保存?zhèn)溆谩?51名無關個體外周血液制成FTA血卡后，通風干燥處保存?zhèn)溆?。本研究已通過軍事醫(yī)學科學院軍事醫(yī)學研究院倫理委員會批準(No. AF/SC-08/02.101)。

1.3 PCR擴增和文庫制備

采用MultiSeq?Custom Panel (IGMU258V1)(嘉興艾吉泰康生物科技有限公司)進行PCR多重復合擴增(具體引物信息見附表1)，總擴增體系為30 μL，其中Enhancer buffer NB (1N) 3.5 μL，Enhance buffer M 2.5 μL，Primer 5 μL，IGT-EM808 polymerase mixture 10 μL，模板DNA 5 μL (1 ng/μL)或直徑1 mm的FTA血卡樣本DNA，去離子水補至30 μL。實驗過程中，采用DNA女性標準品9947A和DNA男性標準品9948作為陽性對照，去離子水作為陰性對照。使用ProFlex?PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)進行擴增，PCR擴增條件：95℃ 3 min 30 s；98℃20 s，60℃ 4 min，18個循環(huán)；最后72℃ 10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物通過AMPure XP磁珠(美國Beckman Coulter公司)純化，加入PCR產(chǎn)物13.5 μL，Index-i5 1 μL，Index-i7 1 μL，Enhance buffer M 2.5 μL，去離子水2 μL。通過ProFlex?PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)進行擴增，PCR擴增條件：95℃ 3 min 30 s；98℃ 20 s，58℃ 1 min，72℃ 30 s，9個循環(huán)；最后72℃ 5 min，4℃保存。

1.4 高通量測序和InDel分型

樣本文庫使用Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent公司)和7500實時熒光定量PCR (美國Thermo Fisher公司)進行質(zhì)控和定量，隨后制備10 pM DNA混合文庫，采用MiSeq v2試劑盒(2×150循環(huán)) (美國Illumina公司)在MiSeq高通量測序儀(美國Illumina公司)進行高通量測序。采用CLC Genomics Workbench 20.0(德國Qiagen公司)對66個InDel基因座和Amel性別基因座進行分型分析。首先通過QC for sequencing Reads和Trim Reads功能對fastq序列進行質(zhì)控，包括原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估及data trimming (去除原始測序reads中質(zhì)量分數(shù)<30的低質(zhì)量reads和接頭序列)。根據(jù)擴增區(qū)域配置的bed文件，導入“Structural Variant Caller”模塊；根據(jù)InDel位置及變異信息配置vcf文件，導入“Identify Known Mutations from mappings”模塊。根據(jù)公安部發(fā)布的公共安全行業(yè)標準GA/T 1693- 2020《法庭科學DNA二代測序檢測規(guī)范》，將“Identify Known Mutations from mappings”參數(shù)Minimum cov-erage設置為100、Detection frequency為軟件默認值20%。由此得到每個基因座的分型結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計分析

采用GenAIEx 6.5[17]軟件計算66個InDel基因座的等位基因頻率(allele frequency, AF)、觀測雜合度(observed heterozygosity, Ho)、期望雜合度(expe-cted heterozygosity, He)，對各基因座進行Hardy- Weinberg平衡和基因座間的連鎖不平衡檢驗，并計算典型父權(quán)指數(shù)(typical paternity index, TPI)。采用Modifie-PowerStates軟件包[18]計算個體識別率(dis-crimination power, DP)、累計個體識別率(TDP)、多態(tài)性信息含量(polymorphism information content, PIC)。采用Cervus 3.0軟件(http://www.fieldgenetics. com/pages/download.jsp)計算二聯(lián)體累計非父排除概率(cumulative power of exclusion in duos, CPEduo)和三聯(lián)體累計非父排除概率(cumulative power of exclusion in trios, CPEtrio)。

2 結(jié)果與分析

2.1 66-plex InDels基因座遺傳信息

IGMU試劑盒對251份中國漢族無關個體的樣本均可進行有效擴增，經(jīng)CLC Genomics Workbench 20.0軟件分析，所有樣本質(zhì)量分數(shù)Q30均大于95%，擴增子平均測序深度為1550X±1200，其多重PCR產(chǎn)物片段主要分布范圍在150～180 bp，Agilent 2100生物分析儀質(zhì)控無非特異性擴增。具體InDel基因座遺傳信息及陽性標準品(9947A、9948)分型見表1。251個中國漢族人群的基因型信息見附表2。

表1 66個InDel基因座遺傳信息及陽性標準品分型

1) rs#為InDel基因座在dbSNP數(shù)據(jù)庫的ID號；2) InDel基因座在人類基因組數(shù)據(jù)庫(GRCh37.p19)染色體上的物理位置；3)參考基因(Ref)在本體系中命名為1，突變基因(Alt)在本體系中命名為2。

2.2 Hardy-Weinberg平衡及連鎖不平衡檢驗

對66個基因座進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，除rs146109101、rs3061475、rs2307807三個基因座外，其他63個基因座基因型分布均符合Hardy- Weinberg平衡(>0.05)，具體值見表2。經(jīng)Bon-ferroni法矯正，將值設為0.000 758 (0.05/66)，66個InDel基因座值均大于0.000 758，符合Hardy- Weinberg平衡。將66個基因座兩兩組合進行連鎖不平衡檢驗，共產(chǎn)生2145 (2145 = [×(–1)]/2，為研究基因座的數(shù)目[4])個組合，具體基因座間連鎖不平衡值見附表3。經(jīng)Bonferroni矯正，=0.000 023 3 (0.05/2145)，66個基因座均未發(fā)現(xiàn)配對連鎖現(xiàn)象。因此，可以進行TDP、CPEduo、CPEtrio的計算。

2.3 66-plex InDels在中國漢族人群中群體遺傳學參數(shù)調(diào)研

經(jīng)GenAIEx 6.5軟件統(tǒng)計分析，除rs79444593基因座的次要等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)低于0.1之外，其余65個InDel基因座的次要等位基因頻率分布在0.28～0.5之間，平均值為0.436，表明其在中國漢族人群中等位基因頻率分布比較均衡，66個InDel基因座等位基因頻率分布見圖1。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，Ho、He、DP、PIC、TPI最小值均在rs79444593基因座出現(xiàn)。除rs79444593外，其余65個基因座觀測雜合度(Ho)為0.390～0.562，期望雜合度(He)為0.409～0.500，兩者比較相差較小；個體識別率(DP)為0.562～0.653，DP越高，代表該遺傳標記在識別不同個體方面的效能越強；多態(tài)性信息含量(PIC)為0.325～0.375，PIC越高，遺傳標記的信息量越多；累計父權(quán)指數(shù)(TPI)為0.820～1.141。累計個體識別概率(TDP)為0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 428 18。具體基因座參數(shù)見表2。除rs79444593基因座外，其他基因座在中國漢族人群中的多態(tài)性較高，66-plex InDels適用于中國漢族人群的個體識別研究。

圖1 66個InDel基因座等位基因頻率分布

表2 66個InDel基因座法醫(yī)遺傳學參數(shù)(n=251)

續(xù)表

續(xù)表

2.4 66-plex InDels在個體識別研究中的應用

Investigator?DIPplex試劑盒和AGCU InDel 50試劑盒作為常用的商品化InDel 分型體系，在個體識別和親權(quán)鑒定領域應用比較廣泛。將66-plex InDels與Investigator?DIPplex、AGCU InDel 50以及常用STR商品化試劑盒(DNA Typer 21?)的鑒定效力進行比較。Investigator?DIPplex、AGCU InDel 50、DNA Typer 21?在中國漢族人群的累計個體識別效率(TDP)分別為0.999 999 973 69[19]、0.999 999 999 999 999 999 8[2]和0.999 999 999 999 999 999 999 998 85[20]。AGCU InDel 50體系的累計個體識別率高于常用STR體系TDP (0.999 999 999 98[12])，表明該體系可以單獨應用于個體識別研究。本研究66-plex InDels的累計個體識別率(TDP)為0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 428 18，遠高于Investigator?DIPplex、AGCU InDel 50及DNA Typer 21?試劑盒，表明66-plex InDels識別不同個體的效力更強。

2.5 66-plex InDels在親權(quán)鑒定案件中的應用

對于親權(quán)鑒定的案件分析，采用Investigator?DIPplex 體系，中國江蘇漢族的二聯(lián)體累計非父排除概率(CPEduo)為0.998 933 978，三聯(lián)體累計非父排除概率(CPEtrio)為0.997 806 392[6]。AGCU InDel 50試劑盒在廣州漢族中三聯(lián)體累計非父排除概率(CPEtrio)為0.999 732 16[2]。兩個商品化試劑盒三聯(lián)體累計非父排除概率(CPEtrio)均小于0.9999[21]，對于二聯(lián)體案件鑒定效力更低，不能單獨適用于親權(quán)鑒定案件。如表3所示，66-plex InDels二聯(lián)體非父排除概率(PEduo)為0.016～0.125，三聯(lián)體非父排除概率(PEtrio)為0.142～ 0.281，在進行親權(quán)鑒定分析時，基因座非父排除概率越高，排除非親生父親的效能越高。經(jīng)Cervus軟件分析，251個無關個體樣本在66-plex InDels中的CPEduo為0.999 739，CPEtrio為0.999 999 999 417。66-plex InDels的CPEtrio比20個STR基因座(CPEtrio= 0.999 999 996[20])鑒定效力更強，表明66-plex InDels可單獨應用于三聯(lián)體親權(quán)鑒定案件的分析，但對于二聯(lián)體案件系統(tǒng)效能未達到法醫(yī)親權(quán)鑒定的要求，需要其他商品化試劑盒聯(lián)合使用。四個體系在中國漢族人群中鑒定效能對比見表4。

3 討論

STR是目前法醫(yī)物證學身份鑒定領域最常用的多態(tài)性遺傳標記，其復合擴增體系的檢測長度一般分布在100～500 bp之間，不適合檢測高度降解和低拷貝的樣本[22]。InDel作為二等位基因遺傳標記，遺傳標記擴增片段均小于200 bp，適合降解檢材的分型[23]。本研究自主構(gòu)建基于Illumina測序平臺的多重復合擴增體系(66-plex InDels)，包含66個常染色體InDel基因座和一個Amel性別基因座。

表3 66個InDel基因座二聯(lián)體非父排除概率及三聯(lián)體非父排除概率(n=251)

表4 不同體系鑒定效能比較

通過對中國漢族251個無關個體進行遺傳多態(tài)性調(diào)查，評估66-plex InDels體系的遺傳學參數(shù)。結(jié)果表明，66個InDel基因座分布在18條染色體上，在中國漢族人群中，其平均次要等位基因頻率為0.431；平均觀測雜合度為0.482；平均期望雜合度為0.483；平均匹配概率為0.388；平均個體識別率為0.612；平均多態(tài)性信息含量為0.365；平均累計父權(quán)指數(shù)為0.974。所有基因座經(jīng)過Bonferroni校正后，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(>0.000 758)且兩兩之間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(>0.000 023 3)。其中，rs79444593基因座在國際千人基因組計劃東亞人群中的MAF為0.4385，但該基因座在本研究中國漢族人群中MAF為0.0976，表明該位點在中國漢族人群中遺傳多態(tài)性較低、鑒定效力較差。考慮到隨機抽樣也可能導致誤差，在后續(xù)的實驗中，可以通過增加樣本量來盡量消除隨機抽樣誤差。

前期研究表明約60個InDel基因座的個體識別鑒定效力可以等同于目前法醫(yī)鑒定中常用的商品化STR試劑盒(如Sinofiler試劑盒包含15個STR基因座)[24]。DP是法醫(yī)個體識別鑒定的重要指標，表示兩個隨機個體表型不同的概率。DP越大，代表個體識別效力越強。對66-plex InDels進行統(tǒng)計分析，其累計個體識別概率(TDP)為0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 428 18，累計非父排除概率(CPE)為0.999 999 999 417。TDP高于DNA Typer 21?試劑盒中20個常染色體STR鑒定效力，同時CPE> 0.9999，因此，66-plex InDels可以單獨應用于個體識別和親權(quán)鑒定，也可以作為已有商品化試劑盒的補充基因座，進行復雜親緣關系鑒定。

本研究不足之處在于個別基因座(rs79444593)在中國漢族人群中遺傳多態(tài)性較差，后續(xù)多重復合擴增體系的優(yōu)化中，可以將該位點進行替換，也可增加更多InDel基因座來提高66-plex InDels的系統(tǒng)效能。同時，后續(xù)研究可以分析中國人群其他種族的遺傳多態(tài)性，評價66-plex InDels在中國不同群體中的法醫(yī)學應用價值，進行群體間的遺傳學參數(shù)的均衡性研究，探索66-plex InDels在中國人群中的普適性。

本研究獲得了66個常染色體InDel基因座多重復合擴增體系，通過對66-plex InDels在中國漢族人群中的法醫(yī)群體遺傳學分析，為InDel基因座在中國人群中的個體識別和親權(quán)鑒定研究提供了遺傳背景數(shù)據(jù)。

附錄：

附加材料見文章電子版www.chinagene.cn。

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Genetic polymorphisms of 66 InDel loci in the Chinese Han population

Xueqian Wang1,2, Qingzhen Zhang2, Peng Cheng2, Tingting Dong2, Weiguo Li1, Zhe Zhou2, Shengqi Wang2

Insertion/deletion polymorphism (InDel) genetic markers refer to insertion or deletion of DNA fragments into genomic DNA, which have advantages in the identification of degraded samples. In this study, we independently screened 66 highly polymorphic InDel markers from the dbSNP database to establish a multiplex PCR system for forensic DNA identification using next-generation sequencing system (66-plex InDels). We assessed the population genetic data among 251 Chinese Han population using this system and evaluated their potential forensic application. The results showed that all 66 InDel loci conformed to the Hardy-Weinberg equilibrium (>0.000 758), and all the pairwise InDel loci were in linkage equilibrium after Bonferroni correction. The mean observed heterozygosity (Ho) was 0.482, the mean expected heterozygosity (He) was 0.483,the mean discrimination power (DP) was 0.612, the mean polymorphism information content (PIC) was 0.365, the total discrimination power (TDP) reached 0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 428 18. The cumulative power of exclusion for 66 InDel loci was 0.999 739 in duo cases (CPEduo) and was 0.999 999 999 417 in trios cases (CPEtrio). The results show that the 66 InDel loci have high genetic polymorphisms in the Chinese Han population and can be used independently for forensic DNA identification and paternity testing.

insertion/delationpolymorphism (InDel); Chinese Han population; DNA identification; paternity testing

2022-01-06;

2022-03-15;

2022-03-24

王雪倩，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：分子生物學。E-mail: Wangxqer0122@163.com

李衛(wèi)國，博士，教授，研究方向：分子生物學研究。E-mail: liwg0618@htu.edu.cn

周喆，博士，研究員，研究方向：分子生物學研究。E-mail: zhouzhe@bmi.ac.cn

王升啟，博士，研究員，研究方向：基因分析與生物分子識別研究。E-mail: sqwang@bmi.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-006

(責任編委: 朱波峰)