劉金海， 蔣金娟， 羅富成， 徐 翠， 王鴻發(fā)， 馬向麗

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650201； 2.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 河南 信陽 464000)

‘納羅克’非洲狗尾草(Setariasphacelata‘Narok’)是禾本科狗尾草屬(Setaria)多年生叢生型草本植物[1]，原產(chǎn)于非洲熱帶地區(qū)，是中國南方亞熱帶和暖溫帶地區(qū)草地建設(shè)、護(hù)坡護(hù)堤、礦區(qū)植被恢復(fù)和石漠化治理優(yōu)選禾草之一[2]。目前‘納羅克’非洲狗尾草已成為中國南方草地建設(shè)的骨干品種，被大面積種植，并進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，生產(chǎn)區(qū)集中分布在云貴高原，但其仍存在開花成熟不一致、種子落粒性強、產(chǎn)量低、休眠程度深等缺點[3]。在大田生產(chǎn)條件下，‘納羅克’非洲狗尾草種子產(chǎn)量一般為45～60 kg·hm-2，發(fā)芽率在10%左右[4]。在國外，‘納羅克’非洲狗尾草種子的產(chǎn)量和質(zhì)量也不高，在印度即使在最佳施肥條件下其產(chǎn)量為40.9～52.9 kg·hm-2[5]；在澳大利亞其大田種子產(chǎn)量一般為20～150 kg·hm-2[6]，發(fā)芽率為13.6%～57.0%，休眠率在28.5%～50.5%之間[7]。近年來，國內(nèi)外圍繞破除‘納羅克’非洲狗尾草種子休眠、提高種子發(fā)芽率等問題已開展過多方面的研究，并得到各種打破種子休眠、有效促進(jìn)種子發(fā)芽的方法[8-11]。羅富成[12]在研究‘納羅克’非洲狗尾草種子內(nèi)源萌發(fā)抑制物時發(fā)現(xiàn)，從其種殼和種胚中提取、鑒定和分離的二聚丙三醇(Diglycerol)對白菜(Brassicapekinensis)種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用，且該作用在一定濃度范圍內(nèi)(1～10 000 mg·L-1)隨濃度的提高而增強，存在于‘納羅克’非洲狗尾草種子內(nèi)部的這種化合物，可能是一種內(nèi)源萌發(fā)促進(jìn)劑。前人在研究種子內(nèi)源抑制物時也發(fā)現(xiàn)了這種物質(zhì)，但并未對該物質(zhì)進(jìn)行充分利用[13]。秦源源等[1]研究儲藏年限對狗尾草種子活力的影響，發(fā)現(xiàn)狗尾草種子應(yīng)在儲藏2年內(nèi)及時利用。綜上，本研究選用存放1年和2年的‘納羅克’非洲狗尾草種子，并用不同濃度的二聚丙三醇溶液培養(yǎng)，觀測種子萌發(fā)和幼苗生長情況，旨在探討該內(nèi)源化合物對納羅克非洲狗尾草種子的生物活性的影響，豐富種子生理學(xué)基礎(chǔ)理論，為提高種子活力及其萌發(fā)性能尋找一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)實習(xí)基地收獲后分別存放1年和2年的‘納羅克’非洲狗尾草凈種子，分別自2018年10月和2019年10月采收；二聚丙三醇標(biāo)準(zhǔn)品從美國進(jìn)口(sigma上海阿拉丁生化科技有限公司)，由云南科儀化玻有限責(zé)任公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1種子預(yù)處理 從供試材料中，隨機選取適量的狗尾草種子置于燒杯中，用10%的次氯酸鈉溶液浸種10 min消毒，隨后用蒸餾水沖洗3次，用濾紙吸干種子表面水分。

1.2.2種子發(fā)芽試驗 按照云南省技術(shù)監(jiān)督局[14]提供的方法進(jìn)行種子發(fā)芽試驗。首先用8種不同濃度的二聚丙三醇溶液[0(CK)，10，50，100，500，1 000，5 000，10 000 mg·L-1]各5 mL分別浸潤鋪有1個濾紙的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿內(nèi)均勻植入100粒已消毒的種子，每個濃度3次重復(fù)，然后將培養(yǎng)皿置于(25±1)℃的人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行幼苗培養(yǎng)，培育期為21 d，人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)每天光照、黑暗各12 h，光照強度為30 000 lx，相對濕度70%。萌發(fā)前10 d，每天將前一天多余的溶液倒掉，再給予3 mL相應(yīng)的二聚丙三醇培養(yǎng)液，以保持種子濕潤并處于原溶液濃度；培養(yǎng)10 d后，每隔 1 d加入1 mL溶液保持濾紙濕潤即可。幼苗培養(yǎng)期間，每天定時觀察記錄種子發(fā)芽情況。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1種子發(fā)芽率及活力指標(biāo) 參照發(fā)芽實驗法[15]，試驗第7 d統(tǒng)計種子發(fā)芽勢，第21 d統(tǒng)計種子發(fā)芽率，并計算種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[11]。計算公式如下：

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽終期(21 d)發(fā)芽種子數(shù)÷供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢(%)=發(fā)芽初期(7 d)正常發(fā)芽種子數(shù)÷供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)(GI)=Σ(Gt/Dt)

活力指數(shù)(VI)=GI×S

式中：Dt為發(fā)芽時間(d)；Gt為與Dt相對應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)；S為發(fā)芽試驗結(jié)束時正常幼苗單株干重(g)。

1.3.2形態(tài)指標(biāo) 種子萌發(fā)結(jié)束后，從各培養(yǎng)皿中隨機選取10株正常生長的幼苗，用電子天平稱其幼苗鮮、干重，用游標(biāo)卡尺測定其苗長和根長，取其平均值，獲得苗高和根長數(shù)據(jù)。然后將各處理的所有幼苗置于105℃烘箱中殺青15 min，再在80℃下干燥24 h至恒重后，測定幼苗單株干重。

1.3.3綜合種子萌發(fā)能力評價法 采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法[16-17]對二聚丙三醇處理兩種采收年限狗尾草種子的萌發(fā)能力進(jìn)行綜合評價。計算公式如下：

X1=(X—Xmin)/(Xmax—Xmin)

X2=1—(X—Xmin)/(Xmax—Xmin)

式中：X1表示不同處理下各指標(biāo)呈正相關(guān)的隸屬函數(shù)值，X2表示不同處理下各指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)的隸屬函數(shù)值，X表示某一指標(biāo)的測定值，Xmax和Xmin分別表示不同處理下各指標(biāo)的最大值和最小值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理和作圖均利用Excel 2010軟件完成，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Duncan’s法比較各處理間的差異，獨立樣本t檢驗比較不同年份間的差異，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 二聚丙三醇溶液對狗尾草種子發(fā)芽率的影響

不同濃度的二聚丙三醇溶液對狗尾草種子的萌發(fā)具有“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的雙重效應(yīng)，但該效應(yīng)在不同采收年限的種子之間存在著差異(圖1)。在0～500 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，種子發(fā)芽率隨濃度的增大而提高，500 mg·L-1時發(fā)芽率達(dá)到最大值，二聚丙三醇(500 mg·L-1)處理存放1年的種子發(fā)芽率為71.00%，為對照(CK)的1.60倍(P<0.05)；存放2年，其種子發(fā)芽率為39.67%，是對照1.78倍(P<0.05)。在500～10 000 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，種子的發(fā)芽率則隨溶液濃度的增大而下降，濃度達(dá)到10 000 mg·L-1時存放2年的種子發(fā)芽率為16.33%，顯著低于對照處理(P<0.05)，而對存放1年的種子抑制作用不顯著。從種子存放年限來看，在相同二聚丙三醇濃度下，存放1年種子的發(fā)芽率均顯著高于存放2年的種子(P<0.05)。

圖1 二聚丙三醇溶液對狗尾草種子發(fā)芽率的影響

2.2 二聚丙三醇溶液對狗尾草種子發(fā)芽勢的影響

與種子發(fā)芽率的變化趨勢相似，隨著二聚丙三醇濃度的增大，種子的發(fā)芽勢整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖2)。存放1年的種子，發(fā)芽勢的最大值出現(xiàn)在500 mg·L-1處理，為41.00%，是對照的1.78倍；而存放2年的種子在500 mg·L-1達(dá)到最大為21.33%，是對照的1.56倍(P<0.05)。當(dāng)濃度為500～10 000 mg·L-1時，種子的發(fā)芽勢則隨溶液濃度的增大而下降，濃度為10 000 mg·L-1時，存放2年的種子發(fā)芽勢為9.33%，顯著低于對照(P<0.05)，存放1年的種子與對照差異不顯著。無論是對照還是加入二聚丙三醇溶液處理，存放1年的種子發(fā)芽勢均顯著高于存放2年的種子(P<0.05)。

圖2 二聚丙三醇溶液對狗尾草種子發(fā)芽勢的影響

2.3 二聚丙三醇溶液對狗尾草種子發(fā)芽指數(shù)的影響

二聚丙三醇對存放1年和2年的狗尾草種子發(fā)芽指數(shù)的影響一致，均隨著二聚丙三醇濃度的增大表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(圖3)，最大值均出現(xiàn)在500 mg·L-1，分別達(dá)到10.021和5.749，是各自對照的1.65倍和1.71倍(P<0.05)。當(dāng)濃度為500～10 000 mg·L-1時，種子的發(fā)芽指數(shù)則隨溶液濃度的增大而下降，升至10 000 mg·L-1時存放2年的種子發(fā)芽指數(shù)為2.315，較對照降低了31.25%(P<0.05)，對存放1年的種子發(fā)芽指數(shù)的抑制作用不顯著。無論是對照還是加入二聚丙三醇溶液處理，存放1年的種子發(fā)芽指數(shù)均顯著高于存放2年的種子(P<0.05)。

圖3 二聚丙三醇溶液對狗尾草種子發(fā)芽指數(shù)的影響

2.4 二聚丙三醇溶液對狗尾草種子活力指數(shù)的影響

無論是存放1年還是2年的狗尾草種子，其活力指數(shù)均隨著二聚丙三醇溶液濃度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，最大值均出現(xiàn)在500 mg·L-1，存放1年和2年的種子活力指數(shù)分別為0.135和0.091，分別是各自對照的2.03和2.51倍(P<0.05)；當(dāng)濃度為500～10 000 mg·L-1時，種子的活力指數(shù)則隨溶液濃度的增大而下降，溶液濃度升至10 000 mg·L-1時，存放1年和2年的種子活力指數(shù)均小于對照處理，但差異不顯著(圖4)。對于兩種年限的種子，在相同處理下存放1年的種子活力指數(shù)均顯著高于存放2年的種子(P<0.05)。

圖4 二聚丙三醇溶液對狗尾草種子活力指數(shù)的影響

2.5 二聚丙三醇溶液對狗尾草株高的影響

利用不同濃度的二聚丙三醇溶液澆灌培養(yǎng)狗尾草種子，對幼苗的增高均有促進(jìn)作用，無論是存放1年還是2年的種子，幼苗高度均隨著溶液濃度的升高而逐漸增大，并在濃度為10 000 mg·L-1時達(dá)到最大值，分別為3.91 cm和3.75 cm，分別是各自對照(CK)的1.42倍和1.39倍(P<0.05，圖5)。狗尾草幼苗生長的趨勢與種子萌發(fā)指標(biāo)不同，在同一濃度處理下，兩種年限的種子幼苗生長均沒有差異，生長趨勢基本保持一致。

圖5 二聚丙三醇溶液對狗尾草株高的影響

2.6 二聚丙三醇溶液對狗尾草根長的影響

二聚丙三醇浸種后，存放不同年限種子的幼苗根長均隨著溶液濃度的增大而逐漸下降(圖6)。在濃度為10 mg·L-1時就已經(jīng)開始抑制根的生長，當(dāng)溶液的濃度達(dá)到500 mg·L-1時，存放1年和2年的種子幼根長度均為1.78 cm，較各自的對照分別降低了47.80%和45.73%；濃度升至10 000 mg·L-1，其幼根長度下降至0.73 cm和0.70 cm，分別較對照降低了78.59%和78.66%(P<0.05)，可見二聚丙三醇溶液對種子幼根的生長有顯著抑制作用。從種子存放年限來看，對照處理存放1年的種子根長顯著高于存放2年的(P<0.05)，在二聚丙三醇濃度為100 mg·L-1時，存放1年的種子根長顯著低于存放2年的(P<0.05)，而在其余濃度處理下，兩種年限的種子根長均沒有顯著差異。

圖6 二聚丙三醇溶液對狗尾草根長的影響

2.7 二聚丙三醇溶液對狗尾草幼苗鮮重和干重的影響

與種子萌發(fā)指標(biāo)的變化趨勢相似，隨著二聚丙三醇濃度的增大，幼苗的鮮重和干重整體均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。存放1年和2年的種子，鮮重的最大值均出現(xiàn)在500 mg·L-1，分別達(dá)到28.80和16.73 mg，是對照的1.80和1.95倍(P<0.05)；當(dāng)濃度為500～10 000 mg·L-1時，幼苗的鮮重則隨溶液濃度的增大而下降，濃度升至10 000 mg·L-1時，對兩種年限的苗鮮重均存在抑制作用，分別較對照降低了2.51%和7.75%(P<0.05，圖7)。存放1年和2年的種子，干重的變化趨勢與鮮重一致(圖8)，在濃度為500 mg·L-1時達(dá)到最大值，分別是1.56和0.91 mg，分別是對照的1.90和1.82倍(P<0.05)；當(dāng)濃度為500～10 000 mg·L-1時，幼苗的干重則隨溶液濃度的增大而下降。濃度升至10 000 mg·L-1時對存放1年和2年的種子干重抑制作用不明顯。無論是種子鮮重還是干重，在同一濃度處理下，存放1年的種子均顯著高于存放2年的種子(P<0.05)。

圖7 二聚丙三醇溶液對狗尾草鮮重的影響

圖8 二聚丙三醇溶液對狗尾草干重的影響

2.8 二聚丙三醇對狗尾草種子萌發(fā)及幼苗生長效果的綜合評價

為進(jìn)一步明確不同濃度二聚丙三醇對狗尾草種子萌發(fā)過程的效應(yīng)，采用隸屬函數(shù)法對各處理的萌發(fā)指標(biāo)和幼苗生長指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(表1)。平均隸屬值越大，表明在此濃度下種子的萌發(fā)能力越好，經(jīng)二聚丙三醇處理存放1年和2年的狗尾草種子，隸屬值在濃度為500 mg·L-1時均達(dá)到最大，分別為0.921和0.908。

表1 各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及綜合排序

3 討論

3.1 二聚丙三醇溶液對狗尾草種子萌發(fā)的影響

關(guān)于種子萌發(fā)內(nèi)源抑制物的研究已有較多報道，前人已研究證明，內(nèi)源抑制物的存在是引起種子休眠的主要原因之一[18-19]，而醇、酯、赤霉素等打破種子休眠的效果明顯[20-22]。本研究所選用的二聚丙三醇能打破狗尾草種子的休眠促進(jìn)其萌發(fā)，并與醇、酯、赤霉素等的作用有相似之處[23-25]，故本研究選用狗尾草種子的內(nèi)源化合物來進(jìn)一步驗證對其種子自身活力的影響，在生產(chǎn)上可以考慮使用該化合物提高出苗率。研究結(jié)果表明，存放1年和2年的狗尾草種子萌發(fā)指標(biāo)、苗鮮重和干重均有明顯的變化，且隨著二聚丙三醇濃度的增大表現(xiàn)出“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的現(xiàn)象。植物生長靠根系吸收養(yǎng)分，根生長受到一定程度的抑制后，植株生長消耗種子本身儲存的營養(yǎng)物質(zhì)，本試驗在高濃度二聚丙三醇下抑制根的生長，但幼苗生長沒有受到抑制，可能是種子本身儲存的養(yǎng)分較多，幼苗不再橫向生長只縱向生長，故植株的鮮干重隨二聚丙三醇濃度增大而降低，與種子萌發(fā)指標(biāo)的趨勢一致。這與羅富成等[26]采用外源激素處理狗尾草種子的研究結(jié)果相似，宋佳琦等[27]用外源生長素處理紫花苜蓿(MedicagosativaL. ‘Xinmu No.4’)、馬向麗等[28]研究赤霉素對狗尾草種子的影響時也出現(xiàn)相似結(jié)果。此外，狗尾草種子采收后存放的年限不同，二聚丙三醇溶液對種子萌發(fā)的促進(jìn)效果不同，即對存放一年的種子促進(jìn)效果顯著高于存放兩年的種子，該結(jié)果與馬天等[29]的試驗結(jié)果相符，這可能與狗尾草種子休眠期8個月，存放2年種子發(fā)生劣變，活力水平與萌發(fā)能力開始大幅度下降有關(guān)[12]，也可能與種子休眠的釋放過程以及存放條件有關(guān)[30]，說明存放時間很大程度影響了種子的壽命。因此，種子休眠自然釋放完畢應(yīng)及時利用，否則影響種子的種用價值，即使采用外源激素甚至其內(nèi)源萌發(fā)促進(jìn)劑二聚丙三醇處理，促進(jìn)效果也將受到影響。

3.2 二聚丙三醇溶液對狗尾草幼苗生長的影響

同一內(nèi)源物質(zhì)對種子生長的不同部位作用不盡相同[31]。本試驗表明，狗尾草幼芽和幼根的生長對二聚丙三醇的響應(yīng)模式不同，即隨著二聚丙三醇溶液濃度的提高，對幼芽的生長有促進(jìn)作用，對幼根的生長卻有抑制作用，這種差異可能是由于幼苗的不同組織器官對二聚丙三醇的敏感度不同所引起。二聚丙三醇溶液對狗尾草幼根生長表現(xiàn)出抑制作用，濃度越高抑制作用越強，可能與種子自身存在抑制物有關(guān)，該內(nèi)源物與抑制幼根生長的某些物質(zhì)存在著協(xié)同作用，也可能與該物質(zhì)在根部的富集有關(guān)，這一現(xiàn)象與燕志強等[32]研究青蒿素對狗尾草幼苗生長、張秋菊等研究返魂草(SeneciocannabifoliusLess.)種子提取液、張躍進(jìn)等[33]研究黃精(PolygonatumsibiricumDelar. ex Redoute)種子甲醇提取物對白菜種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)現(xiàn)類似情況；又因狗尾草種子是休眠種子，在采收后期可能在根生長的部位脫落酸含量太高，再加入二聚丙三醇溶液，二者在種子發(fā)育時逐漸積累形成雙重作用抑制根的生長，鄧建梅等[34]研究黃花棘豆(OxytropisochrocephalaBunge)甲醇提取液對狗尾草幼苗生長、朱強等[35]研究狗尾草水提取物對小麥(TriticumaestivumL.)種子的萌發(fā)及幼苗生長時也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，而且在試驗進(jìn)行過程中，該化合物只是抑制根的生長，并沒有影響種苗的成活率，至于根的抑制現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究?；诠肺膊萦籽亢陀赘L對二聚丙三醇的響應(yīng)模式相左，結(jié)合其對種子萌發(fā)的顯著促進(jìn)效應(yīng)，生產(chǎn)上可采用低濃度(500 mg·L-1)的二聚丙三醇溶液處理種子，解除種子休眠。

3.3 不同濃度的二聚丙三醇處理狗尾草種子的綜合評價

隸屬函數(shù)的分析方法避免了單個指標(biāo)的偏向性和局限性，提高了評價結(jié)果的準(zhǔn)確性，能更好的揭示種子的生長狀況[36]，用綜合得分值量化了不同年份及濃度對狗尾草種子萌發(fā)的效應(yīng)。綜合評價認(rèn)為，適宜濃度的二聚丙三醇溶液對狗尾草種子的萌發(fā)及幼苗生長有一定的促進(jìn)作用，而在高濃度處理下則會抑制種子萌發(fā)，最終影響出苗整齊度，這與陳毅凡等[37]用黃腐酸處理鎘脅迫下的小麥種子得出的效果相似。本試驗表明，存放1年和2年的種子在濃度為500 mg·L-1時隸屬函數(shù)值均最大。從種子存放年限來看，存放1年的種子萌發(fā)指標(biāo)均顯著高于存放2年的種子，因此種子在采收后應(yīng)及時有效利用‘納羅克’狗尾草種子，否則處于休眠狀態(tài)，影響種子的利用價值。

4 結(jié)論

適宜濃度的二聚丙三醇溶液(500 mg·L-1)對存放1年和2年的種子萌發(fā)指標(biāo)和鮮干重均有明顯的促進(jìn)作用，且存放1年的顯著高于2年的種子，狗尾草幼芽和幼根的生長對二聚丙三醇響應(yīng)模式相反。綜合隸屬函數(shù)評價法進(jìn)一步驗證了，采用低濃度(500 mg·L-1)的二聚丙三醇溶液處理種子，能夠解除種子休眠，對其萌發(fā)有較好的促進(jìn)作用。