張海娟， 蘆光新*， 范月君， 周華坤， 周學(xué)麗， 竇聲云， 姚世庭， 顏琿璘，馬 坤, 趙陽安， 祁巖慧， 茍恒瑞

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所， 青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810008； 3.青海省草原改良試驗(yàn)站， 青海 共和 813000； 4.青海農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院， 青海 湟源 812100)

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌是一類重要的共生微生物，它能與80%以上的陸生植物互惠共生形成菌根[1]。研究表明，菌根能促進(jìn)植物生長[2-3]，增加植物的生物量[4-6]，促進(jìn)植物根系的發(fā)育[7]。在調(diào)節(jié)植物種間關(guān)系[8-9]、維持植物群落物種多樣性[10-12]和改善植物根圍土壤養(yǎng)分環(huán)境[13]等方面也發(fā)揮著重要作用。

高寒草地是青藏高原最主要的生態(tài)系統(tǒng)，具備調(diào)節(jié)氣候和涵養(yǎng)水源等生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能[14]。然而，由于受全球變化及人類活動的影響，高寒草地遭受嚴(yán)重退化[15]。禾本科牧草是目前應(yīng)用于高寒草地的主要播種植物，但種源偏少，且在高寒冷涼的環(huán)境條件下植物群落極不穩(wěn)定，易造成二次退化，嚴(yán)重限制了退化高寒草地植被恢復(fù)進(jìn)程[16]。因此，研究利用AM真菌開展退化高寒草地禾本科牧草的恢復(fù)具有重要意義。

目前，AM真菌促生的研究多集中在農(nóng)業(yè)作物等領(lǐng)域[17-18]，對高寒草地多年生禾本科牧草促生的研究較少，且不同AM真菌對高寒草地不同禾本科牧草的接種效應(yīng)是否一致亦不明確。為此，本研究通過對青海省退化高寒草地恢復(fù)中常用的6種多年生禾本科牧草扁穗冰草(Agropyroncristatum)、‘青牧1號’老芒麥(Elymussibiricus‘Qingmu No.1’)、寒生羊茅(Festucakryloviana)、冷地早熟禾(Poacrymophila)、‘川草2號’老芒麥(Elymussibiricus‘Chuancao No 2’)和‘阿壩’垂穗披堿草(Elymusnutans‘Aba’)分別接種2種AM真菌根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradices，GI)和摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)，探討AM真菌對高寒草地多年生禾本科牧草的促生效應(yīng)，以期為退化高寒草地生態(tài)修復(fù)中植物微生物聯(lián)合生態(tài)修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為青海省退化高寒草地恢復(fù)中常用的的6種多年生禾本科牧草，來源及基本信息見表1。種子播種前，用10%H2O2消毒10 min，用無菌水沖洗5次，用濾紙吸干水分使用。供試AM真菌菌劑由長江大學(xué)吳楚教授饋贈的根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradices，GI)和摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)，經(jīng)白三葉草擴(kuò)繁兩個月后獲得的包含根段、叢枝、菌絲和孢子等的混合接種物。培養(yǎng)基質(zhì)為田間土和河沙(3∶1，V/V)的混合物，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌2 h后使用。田間土養(yǎng)分含量為：總氮703 mg·kg-1，氨態(tài)氮1.72 mg·kg-1，硝態(tài)氮35.62 mg·kg-1，有機(jī)碳0.87%。培養(yǎng)盆缽為18 cm × 15 cm × 13 cm(上口徑×下口徑×高)的塑料花盆，使用前用75%的酒精反復(fù)擦拭消毒。

表1 禾本科牧草種子基本信息

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置接種根內(nèi)球囊霉(GI)、接種摩西球囊霉(GM)和不接種(Control check，CK)3個處理，每個處理3次重復(fù)，每種牧草有9盆，共有54盆，隨機(jī)排列，隔天調(diào)換位置。稱400 g滅菌基質(zhì)裝盆，澆適量無菌水，均勻鋪撒20 g供試AM真菌菌劑[19-20]，覆滅菌基質(zhì)60 g，每盆澆100 mL無菌水，以30粒每盆的播量分別播種6種禾本科牧草種子，覆土40 g，澆少量無菌水，出苗7 d后定苗至20 株·盆-1。試驗(yàn)在青海大學(xué)農(nóng)牧實(shí)驗(yàn)樓草地微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，自然采光，白天溫度為(22 ± 2)℃，夜間溫度為(18 ± 2)℃。培養(yǎng)周期為45 d(2021年4月30日至2021年6月13日)，栽培期間每周澆1次Hoagland營養(yǎng)液[21-23]，每次100 mL。

1.3 測定指標(biāo)與方法

牧草生長指標(biāo)：栽培期間，每3周用直尺測定一次植物株高，每盆隨機(jī)測定10株，共測2次(第3和6周)；試驗(yàn)結(jié)束后，每個處理隨機(jī)挖取5株健康植株，表面清洗干凈后用濾紙擦干，分別稱取單株地上和地下生物量，3次重復(fù)；稱量結(jié)束后的完整植物根系用根系掃描儀(Epson Perfection V800 Photo)掃描成像，并用WinRHIZO分析圖像獲得根系相關(guān)指標(biāo)的數(shù)據(jù)。

菌根侵染率：采用臺盼藍(lán)染色法檢測2種AM真菌對6種禾本科植物的菌根侵染率[23]，并按Biermann等的方法計(jì)算菌根侵染率[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，用IBM SPSS 26.0軟件做單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan法多重比較，用Spearman相關(guān)分析檢驗(yàn)菌根侵染率與牧草各生長指標(biāo)的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種AM真菌對6種禾本科牧草菌根侵染率的影響

由圖1可知，CK處理無菌根侵染的跡象(圖1a)，而接種GI和GM的處理均能檢測到孢子和泡囊等菌根結(jié)構(gòu)(圖1b，1c)，但2種AM真菌對6種禾本科牧草的菌根侵染率之間存在差異。經(jīng)分析，GI對‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草、‘青牧1號’老芒麥和扁穗冰草的侵染率明顯高于GM(P<0.05)，對冷地早熟禾的菌根侵染率GM大于GI(P<0.05)，而2種AM真菌對寒生羊茅的菌根侵染率之間無顯著差異(表2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GI對‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草、‘青牧1號’老芒麥和扁穗冰草的侵染率之間差異不顯著，對寒生羊茅和冷地早熟禾的菌根侵染率之間差異不顯著，‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草、‘青牧1號’老芒麥和扁穗冰草的菌根侵染率與寒生羊茅和冷地早熟禾的菌根侵染率之間差異顯著(P<0.05)。GM對‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草、‘青牧1號’老芒麥、扁穗冰草和寒生羊茅的侵染率之間差異不顯著，與冷地早熟禾的菌根侵染率之間差異顯著(P<0.05)。

表2 2種AM真菌對6種禾本科牧草菌根侵染率的影響

圖1 2種AM真菌與6種禾本科牧草識別共生形成菌根情況

2.2 接種AM真菌對6種禾本科牧草株高的影響

與CK相比，接種AM真菌對6種禾本科牧草株高的影響存在差異。栽培3周后，6種禾本科牧草的株高依次為‘阿壩’垂穗披堿草>‘川草2號’老芒麥>‘青牧1號’老芒麥>扁穗冰草>寒生羊茅>冷地早熟禾(P< 0.05)，GI和GM對‘阿壩’垂穗披堿草株高的影響顯著大于CK(P< 0.05)，GM對‘川草2號’老芒麥株高的影響顯著高于CK(P< 0.05)，其余4種禾本科牧草的株高在不同接種處理間差異均不顯著，而不同牧草的株高在同種接種處理間差異顯著(P< 0.05，圖2)。栽培6周后，6種禾本科牧草株高的變化趨勢與栽培3周后株高的變化趨勢有所差異，GI和GM對6種禾本科牧草株高的影響與CK相比均無顯著差異，‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草和扁穗冰草的株高在相同接種處理間差異不顯著，與其余3種禾本科牧草的株高間差異顯著(P< 0.05，圖2)。

圖2 接種AM真菌對6種禾本科牧草株高的影響

2.3 接種AM真菌對6種禾本科牧草生物量的影響

2.3.1地上生物量 與CK相比，接種AM真菌使6種禾本科牧草的地上生物量不同程度增加。方差分析結(jié)果表明，接種GI和GM對扁穗冰草和寒生羊茅地上生物量的影響與CK相比無顯著差異，冷地早熟禾的地上生物量表現(xiàn)為CK和GI組顯著低于GM組(P<0.05)，GM對‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草和‘青牧1號’老芒麥地上生物量的影響與CK相比無顯著差異，而GI對這3種牧草的接種效應(yīng)顯著高于CK(P<0.05)。不同禾本科牧草的地上生物量在相同接種處理間有所差異，‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草和‘青牧1號’老芒麥間差異不顯著，寒生羊茅與冷地早熟禾間差異不顯著，與扁穗冰草間差異均顯著(P<0.05)(圖3)。

圖3 接種AM真菌對6種禾本科牧草地上生物量的影響

2.3.2地下生物量 與CK相比，接種GI和GM的處理地下生物量相對較高(圖4)。同種禾本科牧草的地下生物量在不同接種處理間存在差異，GI對‘川草2號’老芒麥、‘青牧1號’老芒麥和冷地早熟禾地下生物量的影響顯著高于GM和CK(P<0.05)，GM對扁穗冰草和寒生羊茅地下生物量的影響顯著高于GI和CK(P<0.05)，對‘阿壩’垂穗披堿草則是GI和GM均顯著高于CK(P<0.05)，GI與GM間無顯著差異。不同禾本科牧草的地下生物量在同種接種處理間存在差異，‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草和‘青牧1號’老芒麥間差異不顯著，寒生羊茅與冷地早熟禾之間差異不顯著，與扁穗冰草間差異顯著(P<0.05)。

圖4 接種AM真菌對6種禾本科牧草地下生物量的影響

2.4 接種AM真菌對6種禾本科牧草根系發(fā)育的影響

除了寒生羊茅和冷地早熟禾外，總根長均是GI和GM顯著高于CK(P< 0.05)，GI和GM對‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草和扁穗冰草的總根長均無顯著差異，對‘青牧1號’老芒麥為GI顯著高于GM(P< 0.05)。與CK相比，接種GI和GM對6種禾本科牧草的總根表面積、總根體積、總根尖數(shù)和分枝數(shù)均有一定的促進(jìn)作用，促進(jìn)程度因牧草種類不同而異，GI和GM對根平均直徑的影響與CK相比無顯著差異，或低于CK(表3)。

表3 2種AM真菌對6種禾本科牧草根系發(fā)育的影響

2.5 菌根侵染率與禾本科牧草株高、生物量和根系指標(biāo)之間的相關(guān)性

不同禾本科牧草的菌根侵染率(表2)與其株高、生物量以及根系發(fā)育之間的關(guān)系不一致(表4)。菌根侵染率與根平均直徑間存在一定的負(fù)相關(guān)，與總根長、總根表面積、總根體積、總根尖數(shù)、分枝數(shù)、地上和地下生物量以及第3和6周株高之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系?！ú?號’老芒麥的菌根侵染率與總根長、總根表面積和總根體積之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P< 0.05)；‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率與總根長和分枝數(shù)之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與地上生物量之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；‘青牧1號’老芒麥的菌根侵染率與總根長、總根表面積、總根體積、分枝數(shù)和地下生物量之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與地上生物量間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；冷地早熟禾的菌根侵染率與地上生物量之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

表4 菌根侵染率與禾本科牧草株高、生物量和根系指標(biāo)之間的相關(guān)性

3 討論

3.1 AM真菌對禾本科植物株高和生物量的影響

本研究通過對扁穗冰草等6種多年生禾本科牧草接種GI和GM后發(fā)現(xiàn)，牧草株高在栽培3周和6周時變化不一致。栽培3周時，接種GI和GM的‘阿壩’垂穗披堿草和‘川草2號’老芒麥的株高顯著高于CK，而其余4種牧草的株高在不同接種處理間差異不顯著。然而，當(dāng)生長到6周時，接種GI和GM的6種禾本科牧草的株高均與CK相比無顯著差異。潘越等[3]和謝開云等[5]也得出了與本研究相似的結(jié)論，即接種AM真菌對禾本科牧草株高無顯著影響。但是，也有研究表明，接種AM真菌能顯著增加植株高度，如田野等對黑麥草(Loliumperenne)接種GM后，黑麥草的株高比CK高[25]；師艷麗等對寬葉雀稗(Paspalumwettsteinii)分別接種隱類球囊霉(Glomusoccultum)、GM和GI后，其株高也高于CK[26]；同樣，楊海霞等對草地早熟禾(Poaparatensis)和高羊茅(Festucaarundinacea)接種AM真菌后其株高顯著增加[27]。這可能是因?yàn)椴煌瘫究颇敛輰Σ煌珹M真菌的菌根依賴性不同所致，也可能由于栽培條件等不同引起。

本研究結(jié)果表明，接種AM真菌能不同程度增加扁穗冰草等6種禾本科牧草的地上和地下生物量，GI對‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草和‘青牧1號’老芒麥地上生物量的影響尤為顯著。然而，潘越等和郭艷娥等對多年生黑麥草接種AM真菌后，黑麥草的地上和地下生物量顯著低于CK[2-3]；甄莉娜等對冷蒿(Artemmafrigida)接種AM真菌后，也得出與上述一致的結(jié)論[6]。可能是因供試宿主植物種類，菌種類型和栽培基質(zhì)等不同所致，表明，不同AM真菌對不同禾本科植物的促生效應(yīng)不同[28-29]。

3.2 AM真菌對禾本科植物根系發(fā)育的影響

通過研究發(fā)現(xiàn)，接種GI和GM對扁穗冰草等6種多年生禾本科牧草的根系發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用，除了寒生羊茅和冷地早熟禾外，接種AM真菌處理的總根長均顯著高于CK，總根表面積、總根體積、總根尖數(shù)和分枝數(shù)也是接種AM真菌的處理較高，而根平均直徑與CK相比無顯著變化。其他研究者也得出了與本研究一致的結(jié)論。如徐雅梅等對2種垂穗披堿草(Elymusnutans)接種AM真菌后，其總根長、根系總表面積、根系平均直徑和根尖數(shù)均顯著高于CK[7]；田野等對黑麥草接種GM后，黑麥草的根系長度表現(xiàn)為接種AM真菌的處理較高[25]；師艷麗等對寬葉雀稗接種AM真菌后，寬葉雀稗的根長也明顯高于CK[26]。以上研究表明，接種AM真菌對能促進(jìn)禾本科植物的根系發(fā)育。但也有研究認(rèn)為，接種AM真菌對植物根長無顯著影響[4]。這可能因植物種類和AM真菌類型不同所致，也可能受培養(yǎng)周期、研究方法等因素的影響。

4 結(jié)論

接種叢枝菌根真菌對青海省退化高寒草地恢復(fù)中常用的6種多年生禾本科牧草的生長具有一定的促進(jìn)作用。與對照相比，接種根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉顯著增加了扁穗冰草等6種多年生禾本科牧草的地上和地下生物量，促進(jìn)了根系發(fā)育。因此，可以嘗試將叢枝菌根真菌應(yīng)用于退化高寒草地受損禾本科牧草的修復(fù)當(dāng)中。