球孢白僵菌GqBb 的分離、鑒定及其對松果梢斑螟幼蟲的致病性研究

劉志佳，李文靜，程曼曼，張曉飛，李繼泉，崔建州

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點實驗室，河北 保定 071000）

松果梢斑螟 （Dioryctria pryeri）是一種為害嚴(yán)重的鉆蛀類害蟲，主要以幼蟲危害油松（Pinus tabuliformis）、華山松（Pinus armandii）、馬尾松（Pinus massoniana）等松科植物的當(dāng)年生幼嫩枝梢和1 ～2 年生球果［1-2］。新梢被害后，逐漸枯萎，極易折斷，影響樹木生長發(fā)育；球果被害后，畸形枯死，影響種子的產(chǎn)量和質(zhì)量，不僅造成經(jīng)濟損失，同時也破壞了天然松樹林的自然更新［3-5］。

目前，松果梢斑螟防控主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治［6-7］。化學(xué)農(nóng)藥的噴施不僅會使昆蟲產(chǎn)生抗藥性，還會導(dǎo)致環(huán)境污染，對人畜和其他生物造成傷害。因此，選擇安全、無污染、對害蟲有持續(xù)作用的生物農(nóng)藥進(jìn)行防治很有必要［8-9］。

白僵菌（Beauveria）是研究最早的一種昆蟲病原微生物［10-11］，具有無毒無污染、適應(yīng)環(huán)境能力強、寄生范圍廣等特點［9-12］，對鱗翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）等700 余種昆蟲有一定的致病性［13］，在生物防治領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［10］。然而，有關(guān)白僵菌對松果梢斑螟的致病性研究尚未見報道。為此，本研究分離純化采自秦皇島北戴河區(qū)自然感病死亡的松果梢斑螟幼蟲僵體病原物，通過形態(tài)學(xué)和ITS 序列分析鑒定菌種，采用噴霧法測定其孢懸液對松果梢斑螟幼蟲的致病性，以期為松果梢斑螟的生物防治提供新的菌株資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供 試 菌 株： 秦 皇 島 北 戴 河 區(qū)（119.48°E，39.83°N）被松果梢斑螟為害的油松球果中，偶然發(fā)現(xiàn)1 頭被白僵菌侵染死亡的松果梢斑螟幼蟲僵體，經(jīng)實驗室分離得到該菌株。

松果梢斑螟幼蟲：采集河北省淶源縣大龍門省級森林公園被松果梢斑螟危害的油松球果，實驗室內(nèi)從被害球果中取出幼蟲，并區(qū)分蟲齡后將同一蟲齡幼蟲放入裝有新鮮油松球果的廣口瓶（250 mL）中，每瓶10 頭幼蟲，雙層紗布封口， 15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：葡萄糖（10.0 g）、蛋白胨（5.0 g）、瓊脂（18.0 g）、磷酸二氫鉀（1.0 g）、七水合硫酸鎂（0.5 g）、蒸餾水（900 mL）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng) 將白僵菌侵染的松果梢斑螟幼蟲僵體，75%酒精浸泡30 s 后，無菌水沖洗3 次，吸水紙吸去多余水分。將僵蟲體接種到PDA 平板（Φ = 90 mm）上，封口膜封口，防止雜菌污染，25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出菌絲后，挑取菌落邊緣新鮮、無污染菌絲，接種到新的PDA 平板上，重復(fù)此操作至不再有雜菌長出，得到純化菌株。

1.2.2 菌株形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)真菌鑒定手冊，光學(xué)顯微鏡觀察菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

菌株DNA 提取參照試劑盒說明書（北京Aidlab 生物科技有限公司）。選用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR 擴增［14］。PCR 擴增體系為50.0 μL，其中模板DNA（20.0 ng/μL）1.0 μL，上下游引物各1.5 μL，10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μL，Taq 聚合酶（5.0 U/μL）1.0 μL，dNTP（10 mmol/L）1.0 μL，ddH2O 39.0 μL。擴增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。反應(yīng)完成后，取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海派森諾生物科技有限公司測序。

1.2.3 孢子懸浮液配制 用含1‰吐溫80 的無菌水沖洗培養(yǎng)20 d 的Gq-Bb 菌株平板，沖洗液于三角瓶（500 mL）中充分混合，3 層無菌紗布過濾，顯微鏡下利用血球計數(shù)板計算孢懸液濃度。用含1‰吐溫 80 的無菌水稀釋，制備成濃度分別為1×104、1×105、1×106、1×107、1×108孢子/mL 的孢懸液，待用。

1.2.4 菌株對松果梢斑螟幼蟲致病性測定 挑選健康、活躍的各齡幼蟲，采用噴霧法進(jìn)行其致病性測定。將同一蟲齡幼蟲放入培養(yǎng)皿（Φ =90 mm）中，孢懸液均勻噴灑在培養(yǎng)皿，20 s 后用潔凈的濾紙吸去多余的孢懸液，然后將幼蟲放入裝有新鮮油松球果的廣口瓶（250 mL）中， 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h 觀察1 次，記錄死亡個體數(shù)量，至不再有幼蟲死亡。以含1‰吐溫 80 的無菌水為對照，每個濃度處理50 頭試蟲，重復(fù)3 次。

將死亡幼蟲置于平面載玻片上，放入濕潤棉球保濕的培養(yǎng)皿中，25 ℃、75% RH 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，凡有白僵菌菌株長出者計為有效死亡。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 Excel 整理各處理幼蟲的累積死亡率，運用SPSS 21 軟件進(jìn)行分析，計算累計校正死亡率。采用Probity 模型計算致死中濃度（LC50），求回歸方程及計算致死中時（LT50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gq-Bb 菌株形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

菌落生長初期為乳白色絨毛狀，后略顯黃色，孢子層較厚（圖1 A）；背面呈淡黃色（圖1 B）。菌絲近無色，分生孢子為光滑球形或近球形，多簇生于菌絲末端（圖1 C）。

使用PCR 擴增目的菌株的rDNA-ITS 序列片段的測序結(jié)果為525 bp：CTGATTCGAGGT CACGTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGC CGCGTCGGGGTCCCGGTGCGAGCTGTATTACTG CGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCC ATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCA ACGCCGACCTCCCCAAGGGGAGGTCGAGGGTT GAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGA ATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTC GATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTT ATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAG AGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTC ATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATG CTGGAATACAAGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGG CCGCTGGTCCAGTCCGCGTCCGGGCTGGGGCG AGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTTCACA GAAGGGTTAGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGA TCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA。

將該序列與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與球孢白僵菌的相似度為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定該菌株為球孢白僵菌，編號Gq-Bb 菌株。

2.2 感染球孢白僵菌Gq-Bb 的松果梢斑螟幼蟲癥狀

松果梢斑螟各齡幼蟲均可被Gq-Bb 菌株感染（圖2）感侵染初期幼蟲行動力減弱，取食量下降，身體出現(xiàn)不同程度的皺縮。隨侵染時間延長，病原真菌逐漸在蟲體內(nèi)生長擴散，幼蟲體表出現(xiàn)大小不一的黑色斑點并逐漸擴大，至整個蟲體變黑褐色后幼蟲死亡，蟲體僵硬。僵蟲體表面1 ～2 d 后開始出現(xiàn)白色絮狀菌絲，再經(jīng)過2 ～4 d 菌絲長滿僵蟲體表，剖開的幼蟲體內(nèi)也存在大量菌絲。從松果梢斑螟被感染至長出菌絲產(chǎn)出孢子，最短約7 d，最長約11 d。

圖2 松果梢斑螟幼蟲感染癥狀Fig.2 External symptoms of larvae of Dioryctria pryeri after infection treatment

2.3 球孢白僵菌Gq-Bb 對松果梢斑螟幼蟲的致病力

2.3.1 松果梢斑螟幼蟲的累積死亡率 由表1可知，球孢白僵菌Gq-Bb 可侵染5 個齡級的松果梢斑螟幼蟲，隨孢子濃度的升高各齡級幼蟲的累計校正死亡率逐漸升高，高齡幼蟲的累計死亡率低于低齡幼蟲。同時，隨侵染時間的推移幼蟲的累積死亡率逐漸升高，第6 d 時累積死亡率達(dá)到最大。感染第6 d時，孢懸液濃度1×107孢子/mL 和1×108孢子/mL較1×104孢 子/mL、1×105孢 子/mL 和1×106孢子/mL 其1 齡和2 齡幼蟲差異顯著，孢懸液濃度1×108孢子/mL 較1×104孢子/mL、1×105孢子/mL和1×106孢 子/mL 其3 齡 和4 齡 幼 蟲 差 異 顯 著（P＜0.05）， 孢 懸 液 濃 度1×108孢 子/mL 較1×104孢子/mL、1×105孢子/mL 、1×106孢子/mL和1×107孢子/mL 其5 齡幼蟲差異顯著；孢子濃度為1×106孢子/mL、1×107孢子/mL 和1×108孢子/mL 時，1 齡、2 齡和3 齡幼蟲較4 齡和5 齡幼蟲的累積死亡率有顯著差異，1×104孢子/mL 和1×105孢子/mL 時各齡幼蟲的累積死亡率沒有顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同濃度孢子懸浮液處理的各齡級松果梢斑螟幼蟲的累積死亡率Table 1 Cumulative mortality of Dioryctria pryeri larvae in various instars treated with different concentrations of spore suspension

2.3.2 球孢白僵菌Gq-Bb 對松果梢斑螟幼蟲的致死濃度效應(yīng) 應(yīng)用Probity 模型對松果梢斑螟幼蟲死亡率進(jìn)行處理，計算其1 ～5 齡幼蟲的致死中濃度（LC50）分別為1.26×103、1.90×103、2.99×103、2.12×104、2.12×105孢 子/mL（見 表2）。 表 明Gq-Bb 菌株對1 ～3 齡幼蟲致病性最強，其次為4 齡，5 齡幼蟲致病性最低。

表2 球孢白僵菌Gq-Bb 對松果梢斑螟的致死中濃度Table 2 The median lethal concentration of Beauveria bassiana strain Gq-Bb against Dioryctria pryeri larvae

2.3.3 球孢白僵菌Gq-Bb 對松果梢斑螟幼蟲的致死時間效應(yīng) 隨球孢白僵菌Gq-Bb 孢子濃度的增加，松果梢斑螟各齡幼蟲的致死中時間（LT50）逐漸縮短；同一濃度下隨其齡級增長，LT50逐漸延長（表3）。在1×104～1×108孢子/mL 濃度處理范圍中，1 齡幼蟲的LT50從4.34 d 降至2.57 d，2 齡幼蟲的LT50從4.91 d 降至2.78 d，3 齡幼蟲的LT50從5.19 d 降至2.78 d，4 齡幼蟲的LT50從5.73 d 降至2.99 d，5齡幼蟲的LT50從6.44 d 降至3.64 d。

表3 球孢白僵菌Gq-Bb 對松果梢斑螟的致死中時間（LT50）Table 3 The median lethal time of Beauveria bassiana strain Gq-Bb to dioryctria pryeri larvae

3 結(jié)論與討論

不同菌株對害蟲的致病力不同［15］，高效昆蟲病原物真菌菌株篩選時，致病力的強弱是衡量該菌株利用價值的重要指標(biāo)之一。本研究以自然感病的松果梢斑螟幼蟲僵體上分離獲得的白僵菌Gq-Bb 為研究對象，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及ITS 序列比對分析，鑒定該菌為球孢白僵菌（Beauveria bassiana），發(fā)現(xiàn)該菌株對松果梢斑螟各齡幼蟲皆有致病能力，但對不同齡級幼蟲的致病力存在一定的差異，孢子濃度越高對同一齡級幼蟲的致病力越強，孢子濃度相同時對低齡幼蟲的致病力更強。這與前人報道的球孢白僵菌對草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）低齡幼蟲的致病力更高相類似［16］。盡管菌株Gq-Bb對5 齡幼蟲的致死率達(dá)到了77.33%，但相對于1、2 齡幼蟲的致死率較低，因此，低齡幼蟲種群高峰期時施用該菌防治松果梢斑螟防治效果會更好。

致死中濃度（LC50）和致死中時間（LT50）是描述菌株致病性的重要指標(biāo)，LC50數(shù)值越小，目標(biāo)害蟲LT50越短，說明菌株致病力越強。有研究報道，5×109孢子/mL 濃度下3 株球孢白僵菌菌株對粘蟲（Mythimna separata）的累積死亡率均達(dá)到100%［17］。采用噴霧法對分離自松褐天牛（Monochamus alternatus）的23 株球孢白僵菌成蟲殺蟲效果顯示，1×106孢子/mL 濃度下，僅有6 株球孢白僵菌菌株的校正死亡率達(dá)30%以上，其中B10 菌株的校正死亡率最高，為36.7%［18］。選用10 株球孢白僵菌對松果梢斑螟進(jìn)行高致病菌株篩選，發(fā)現(xiàn)A3 和J2 菌株對該螟幼蟲的致死率均達(dá)100%，其LC50和LT50分別為2.97×105孢子/mL、 4.13 d 和4.18×105孢子/mL、 4.22 d［19］。本研究中，在1×108孢子/mL濃度下，1 齡幼蟲的LC50和LT50分別為1.26×103孢子/mL 和2.57 d，5 齡幼蟲也僅為2.12×105孢子/mL 和3.64 d，較前者2 株菌株的LC50更低、LT50更短，表明球孢白僵菌Gq-Bb 對松果梢斑螟幼蟲具有更強的致病力，有進(jìn)一步研究的價值。

球孢白僵菌是一類重要的生防菌，具有巨大的研發(fā)潛力，但在繼代培養(yǎng)過程中，其一些毒素的代謝水平的降低，會導(dǎo)致毒力下降［20］，意味著在其培養(yǎng)過程中，存在退化的可能。因此，如何保持其毒力，在自然環(huán)境條件下利用白僵菌制劑進(jìn)行害蟲防治，仍有許多問題需要解決。本研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)條件下球孢白僵菌Gq-Bb 對松果梢斑螟幼蟲具有很強的致病力，但其在田間應(yīng)用時能否產(chǎn)生同樣的效果，特別是如何保證孢子接觸蟲體并發(fā)揮作用，仍需進(jìn)一步深入研究。