張 帥，顧文源，趙云環(huán)，劉 瑩，左玉柱，范京惠

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050035；3. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的家豬和野豬的最具破壞性的出血性傳染病之一。早在撒哈拉以南非洲國(guó)家流行，2007 年傳入格魯吉亞地區(qū)，近年來(lái)，又傳播到西歐和東南亞各國(guó)，2018 年傳入我國(guó)后，迅速在各地豬場(chǎng)蔓延，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了毀滅性的打擊。根據(jù)毒力大小，ASFV可分為高毒力、中毒力、低毒力和無(wú)癥狀感染毒株。在非洲豬瘟的臨床病例中，高致病性病毒感染最為常見(jiàn)，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%。因此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將ASF 列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，在我國(guó)也將ASF 列為一級(jí)動(dòng)物疫病［1］。

ASFV 是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大型、雙鏈、線性DNA 病毒，基因組龐大，大小約為170 ～190 kb，編碼超過(guò)200 種蛋白質(zhì)。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，盡管?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量研究，大多數(shù)蛋白質(zhì)的功能仍不清楚，阻礙了疫苗的研發(fā)和致病機(jī)制及免疫逃避機(jī)制的探明，導(dǎo)致目前尚無(wú)商品化疫苗及特效的藥物用于ASF 的有效防控［2］。在編碼的200多種蛋白質(zhì)中，超過(guò)50 種是構(gòu)成病毒結(jié)構(gòu)的主要蛋白，其中由EP402R 基因編碼的CD2v 蛋白是ASFV晚期表達(dá)蛋白［3］，可介導(dǎo)紅細(xì)胞對(duì)ASFV 感染細(xì)胞的吸附作用，抑制有絲分裂原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，延長(zhǎng)免疫系統(tǒng)消滅病毒的時(shí)間，同時(shí)還是ASFV 血清型分型的關(guān)鍵蛋白［4］，且在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、免疫逃逸和ASFV 病毒入侵宿主和傳播擴(kuò)散中發(fā)揮重要作用。目前該蛋白的結(jié)構(gòu)尚未完全解析，因此深入了解CD2v 蛋白的結(jié)構(gòu)及功能，將有助于ASFV 的有效防控［5］。本研究以中國(guó)首次分離且在國(guó)內(nèi)流行的非洲豬瘟病毒Pig/HLJ/2018 株為研究對(duì)象，對(duì)ASFV CD2v 蛋白進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析、理化性質(zhì)分析、蛋白結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽分析以及B 細(xì)胞和T 細(xì)胞抗原表位分析等生物信息學(xué)分析［6］，以期為ASFV 的進(jìn)化分析和CD2v蛋白的功能研究、ASFV 與宿主細(xì)胞的作用機(jī)制研究以及疫苗研發(fā)提供一些基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)，為ASF 的有效防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CD2v 蛋白遺傳進(jìn)化分析

通過(guò)登錄NCBI 查詢中國(guó)流行株P(guān)ig/HLJ/2018株（GenBank：QBH90580）ASFV EP402R 基因并選取其他國(guó)內(nèi)、外具代表性的毒株20 條，獲取基因組和基因型等信息（見(jiàn)表1），用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，描述20 種不同基因組數(shù)據(jù)之間的關(guān)系；用Megalign 軟件對(duì)20 條氨基酸序列進(jìn)行比較和分析。

表1 20 株ASFV EP402R 基因統(tǒng)計(jì)信息Table 1 Statistical information of EP402R gene of 20 ASFV strains

1.2 CD2v 蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy 在線分析工具ProtParam 對(duì)CD2v蛋白的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、原子數(shù)、疏水性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.3 CD2v 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利 用 在 線 工 具GOR4、Swiss-Model、cNLS Mapper、Psort 等分析軟件對(duì)CD2v 蛋白NLS 序列和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測(cè)［7］。

1.4 CD2v 蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)

通過(guò)TMHMM-2.0 在線工具分析CD2v 蛋白跨膜區(qū)［8］，通過(guò)SignalP-5.0 在線工具分析CD2v 蛋白信號(hào)肽［9］。

1.5 CD2v 蛋白B 細(xì)胞和T 細(xì)胞抗原表位分析

采用在線分析工具BepiPred 1.0、IEDB 分析序列B 細(xì)胞抗原表位區(qū)域［10］，采用NetMHC 4.0、NetMHCpan 4.1 在線服務(wù)器分析序列T 細(xì)胞抗原表位區(qū)域［11］，并結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等不易形成抗原表位的區(qū)域，篩選出優(yōu)勢(shì)表位區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于Pig/HLJ/2018 株ASFV CD2v 蛋白序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

2.1.1 基于ASFV CD2v 蛋白基因EP402R 的進(jìn)化樹(shù) 通 過(guò) 對(duì)Pig/HLJ/2018 株ASFV 和 從NCBI 查詢篩選出的ASFV CD2v 蛋白基因EP402R 序列組成20 條序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖1）結(jié)果顯示，Pig/HLJ/2018 株 與 格 魯 吉 亞Georgia 2007、Georgia 2008 以及其他中國(guó)毒株處于同一分支，基因組分型同為Ⅱ型，同時(shí)顯示當(dāng)前格魯吉亞地區(qū)、中國(guó)、東南亞地區(qū)流行毒株均為基因Ⅱ型；西歐地區(qū)流行毒株主要為基因Ⅰ型；非洲地區(qū)當(dāng)前流行毒株多為Ⅸ型和Ⅹ型，從進(jìn)化關(guān)系來(lái)看，Ⅸ型和Ⅹ型具有很高的相似性［12］。

圖1 20 株ASFV EP402R 基因進(jìn)化樹(shù)Fig.1 20 ASFV EP402R gene evolutionary tree

2.1.2 ASFV CD2v 蛋白氨基酸序列分析 通過(guò)Megalign 軟件對(duì)20 條氨基酸序列進(jìn)行比較和分析后結(jié)果（見(jiàn)圖2）顯示，不同基因型之間氨基酸序列存在著不同程度的突變、插入與缺失，同一基因型間氨基酸序列的一致性較高，Pig/HLJ/2018 株與格魯吉亞Georgia 2007、Georgia 2008 以及中國(guó)AnhuiXCGQ 等基因Ⅱ型毒株CD2v 蛋白氨基酸序列一致性高達(dá)100%，與其他基因型的氨基酸一致性在76.8%～81.7%之間。同時(shí)還可以看出，CD2v 蛋白氨基酸序列末端（C 端）出現(xiàn)了KPCPPP 的重復(fù)序列。

圖2 ASFV CD2v 氨基酸序列分析結(jié)果Fig.2 ASFV CD2v amino acid sequence analysis results

2.2 CD2v 蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

根據(jù)ExPASy 在線工具中的ProtParam 分析結(jié)果顯示：CD2v 蛋白共360aa，分子量為41.008 89 kD，其中天冬氨酸（12.5%）、異亮氨酸（12.5%）、脯氨酸（11.4%）和蘇氨酸（9.7%）占比最高，其他氨基酸占比從0.6% ～8.9% 不等；理論等電點(diǎn)為6.21，帶負(fù)電荷的氨基酸總數(shù)為24，帶正電荷的氨基酸總數(shù)為22；原子總數(shù)為5 749，分子式為C1868H2858N460O548S15；預(yù)測(cè)280 nm 消光系數(shù)為51 800 M-1cm-1～52 550 M-1cm-1；在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)半衰期大于10 h；不穩(wěn)定指數(shù)為47.78，脂肪指數(shù)為88.81，親水性總平均值為-0.209，說(shuō)明該蛋白屬于親水性蛋白。

2.3 CD2v 蛋白結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

Pig/HLJ/2018 株ASFV CD2v 蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)表明該基因全長(zhǎng)1 080 bp，G+C 含量為27.88%，A+T含量為72.12%；表達(dá)的蛋白為41.008 89 kD，通過(guò)在線工具GOR4 預(yù)測(cè)的CD2v 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果（圖3）顯示，α-螺旋占5.56%，擴(kuò)展鏈占31.11%、無(wú)規(guī)卷曲占63.33%；將CD2v 蛋白序列提交在線工具Swiss-Model 預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（見(jiàn)圖4），證明了該蛋白主要以無(wú)規(guī)卷曲為主。

圖3 CD2v 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Rediction results of secondary structure of CD2v protein

圖4 CD2v 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Prediction of tertiary structure of CD2v protein

根據(jù)在線工具cNLS Mapper 和Psort 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白可能包括一段NLS 單分型序列（表2），無(wú)雙分型序列，其cut-off 分?jǐn)?shù)為7.5；CD2v 蛋白可能定位于高爾基體的概率為22.2%，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)膜的概率均為11.1%。

表2 ASFV CD2v 蛋白序列單分型NLS 預(yù)測(cè)Table 2 Single NLS prediction of ASFV CD2v protein sequence

2.4 CD2v 蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽分析結(jié)果

根據(jù)TMHMM-2.0 在線工具分析結(jié)果顯示，CD2v 蛋白存在一個(gè)跨膜區(qū)（見(jiàn)圖5-A），信號(hào)肽分析結(jié)果的可能性為0.925，說(shuō)明存在信號(hào)肽（見(jiàn)圖5-B）。

圖5 CD2v 蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Prediction results of CD2v protein transmembrane region and signal peptide

2.5 CD2v 蛋白B 細(xì)胞和T 細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果

根據(jù)在線分析工具BepiPred 1.0、IEDB 分析序列B 細(xì)胞抗原表位區(qū)域結(jié)果顯示，存在9 個(gè)B 細(xì)胞抗原表位；根據(jù)NetMHC 4.0、NetMHCpan 4.1 在線服務(wù)器分析序列T 細(xì)胞抗原表位區(qū)域結(jié)果顯示，CD2v 蛋白存在14 個(gè)T 細(xì)胞抗原表位；結(jié)合2.3 中預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，去掉其中的α-螺旋等篩選出4 個(gè)優(yōu)勢(shì)B 細(xì)胞抗原表位和5 個(gè)優(yōu)勢(shì)T 細(xì)胞抗原表位（見(jiàn)表3）。

表3 CD2v 蛋白優(yōu)勢(shì)B、T 細(xì)胞抗原表位分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Statistical results of CD2v protein dominant B cell and T cell epitope analysis

3 討論與結(jié)論

ASFV 是一種基因組龐大而復(fù)雜的DNA 病毒，可導(dǎo)致豬的急性死亡，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)于2018 年在遼寧首次爆發(fā)ASF［13］，之后迅速蔓延至多個(gè)省市和地區(qū)，并呈區(qū)域性流行，嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。盡管政府部門(mén)按照一類傳染病的防控措施，對(duì)疫區(qū)及受威脅地區(qū)進(jìn)行了嚴(yán)格的管控［14］，但防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻，急需安全有效的疫苗用于本病的防控。然而，由于對(duì)ASFV 與宿主之間的作用機(jī)制、病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制調(diào)控機(jī)制尚不清楚，對(duì)與病毒免疫逃避相關(guān)蛋白的研究相對(duì)較少，目前尚無(wú)商品化的非洲豬瘟疫苗。因此，深入研究病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，將有助于病毒致病機(jī)制的闡明以及非洲豬瘟疫苗的研發(fā)。

3.1 ASFV CD2v 蛋白的遺傳變異分析

CD2v 蛋白位于ASFV 的外層囊膜，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是病毒毒力及免疫逃避的相關(guān)蛋白之一［15-16］。本研究對(duì)ASFV CD2v 蛋白氨基酸序列分析結(jié)果顯示，不同基因型之間氨基酸序列存在較大差異，以中國(guó)流行株P(guān)ig/HLJ/2018 株ASFV CD2v 蛋白氨基酸序列為例，在C 末端出現(xiàn)了連續(xù)的重復(fù)序列（KPCPPP），研究表明，該重復(fù)序列是一種遺傳標(biāo)記或抗原表位［17-18］，Yang 等［18］確認(rèn)了該重復(fù)序列（KPCPPP）為細(xì)胞穿透肽(CPP)，CPP 是多種多肽家族，通常由5 ～30 個(gè)氨基酸組成，可通過(guò)能量依賴或能量獨(dú)立機(jī)制通過(guò)組織和細(xì)胞膜，不與特定受體相互作用［19］，它可以攜帶EGFP 通過(guò)網(wǎng)格蛋白和微胞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入CHO 細(xì)胞，這為ASFV 顆粒進(jìn)入細(xì)胞的方式提供了新的見(jiàn)解，同時(shí)也提示ASFV研究可以發(fā)展成為藥物傳遞的工具。另外，連續(xù)的脯氨酸序列與宿主SH3 結(jié)構(gòu)域蛋白SH3P7/mAbp1 結(jié)合，并在囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮作用［20］。對(duì)ASFV CD2v 蛋白遺傳進(jìn)化與氨基酸序列分析表明該蛋白可作為ASF 治療藥物和預(yù)防疫苗的研究靶點(diǎn)，為ASF 的有效防控奠定基礎(chǔ)。

3.2 ASFV CD2v 蛋白結(jié)構(gòu)和抗原表位

對(duì)ASFV CD2v 蛋白的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，CD2v 是一種跨膜蛋白，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示α-螺旋結(jié)構(gòu)占5.56%，存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽，具有由2 個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成的細(xì)胞外N 端區(qū)域和胞質(zhì)C 端區(qū)域，與Rodríguez 等［21］的研究結(jié)果相一致。Sereda 等［22］研究表明CD2v 蛋白能介導(dǎo)紅細(xì)胞對(duì)ASFV 感染細(xì)胞的吸附作用，并指出ASF 保護(hù)性免疫可能是血清型特異性的表現(xiàn)，血液吸附(HAI)抑制同一血清型內(nèi)的病毒互相交叉保護(hù)，而同一血清型外的病毒則沒(méi)有交叉保護(hù)；同時(shí)Malogolovkin 等［23］根據(jù)CD2v 蛋白HAI 特性進(jìn)行了血清學(xué)分型，發(fā)現(xiàn)同一基因型下的毒株表現(xiàn)出不同的血清型分型，這可能更好地解釋ASFV 分離株之間的同源交叉保護(hù)問(wèn)題和影響疾病出現(xiàn)的病毒決定因素，表明ASFV CD2v 蛋白的血清分型對(duì)疫苗的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)非常重要。T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B 細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，在機(jī)體抵抗病原微生物感染的過(guò)程中，發(fā)揮著重要作用，B、T 細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)抗原表位常用于靶向藥物或表位疫苗的研制，Burmakina 等［24］在免疫動(dòng)物攻毒后7 ～10 d，觀察到T 細(xì)胞對(duì)病毒的強(qiáng)大反應(yīng)，并鑒定出了在ASF 保護(hù)性免疫環(huán)境中誘導(dǎo)T 細(xì)胞應(yīng)答的T 細(xì)胞表位區(qū)域，這表明ASFV 的T 細(xì)胞表位對(duì)保護(hù)性宿主反應(yīng)具有重要意義。同時(shí)，Burmakina等［24］提示T 細(xì)胞表位對(duì)給定的病毒血清型也有特異性，T 細(xì)胞宿主反應(yīng)可能與觀察到的血清型特異性保護(hù)有關(guān)。本研究通過(guò)在線工具篩選出4 個(gè)優(yōu)勢(shì)B 細(xì)胞抗原表位和5 個(gè)優(yōu)勢(shì)T 細(xì)胞抗原表位，可作為靶向藥物、表位疫苗篩選的對(duì)象［6］，有助于ASFV 亞單位疫苗的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。

通過(guò)對(duì)ASFV 的CD2v 蛋白及其基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，深入解析了中國(guó)流行毒株P(guān)ig/HLJ/2018株CD2v 蛋白基因的遺傳進(jìn)化情況以及CD2v 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，為進(jìn)一步闡明病毒-宿主相互作用機(jī)制以及ASFV 疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。