Smad3與乳腺癌免疫相關(guān)基因關(guān)系研究

童 瀟,周 爽

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所,上海 200092)

乳腺癌是全球女性診斷率最高、死亡率最高的癌癥[1],乳腺癌轉(zhuǎn)移是造成病人死亡的重要原因。在腫瘤免疫微環(huán)境中,TGF-β/Smad信號通路在腫瘤發(fā)生中占主導(dǎo)地位,Smad3作為調(diào)控的主要蛋白之一,已經(jīng)被證實能加速乳腺癌的發(fā)展[2],Smad3含量增多可以促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生并引發(fā)轉(zhuǎn)移[3],而Smad3的泛素化可以有效降低EMT程度[4],減少轉(zhuǎn)移的幾率。研究旨在探索乳腺癌微環(huán)境中的Smad3的表達(dá)與免疫相關(guān)基因關(guān)系,找到Smad3關(guān)聯(lián)蛋白,從而為乳腺癌臨床診斷和免疫治療靶點提供新的方向和思路。

1 實驗方法

1.1 腫瘤樣本和臨床數(shù)據(jù)獲取

乳腺癌樣本從癌癥基因組圖譜(TCGA,the cancer genome atlas)網(wǎng)站下載,轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包含1 109例乳腺癌腫瘤樣本和133例正常癌旁樣本,同時獲取了1 097例臨床數(shù)據(jù)。

1.2 腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞分組評估

從TCGA網(wǎng)站下載獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),樣本整理得到基因表達(dá)矩陣,利用Estimate系統(tǒng)對乳腺癌樣本進(jìn)行評估,分別對基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞進(jìn)行打分,獲得打分評估列表。

1.3 臨床生存曲線繪制

所有樣本依據(jù)基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞打分列表求取平均值,根據(jù)平均值將樣本劃分為2組:高分組和低分組。整理TCGA獲得的臨床樣本數(shù)據(jù)得到生存時間列表,免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞打分?jǐn)?shù)據(jù)分別與生存數(shù)據(jù)聯(lián)合分析,Survival包繪制Kaplan-Meier 生存曲線。

1.4 篩選差異基因并繪制熱圖和韋恩圖

差異基因分析主要采用R語言Limma 包實現(xiàn)。免疫細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞高低分組基因表達(dá)值分別進(jìn)行比較分析,選擇差異倍數(shù)大于1.0,顯著性小于0.05為差異基因,繪制基因熱圖。另外,對免疫細(xì)胞上調(diào)與基質(zhì)細(xì)胞上調(diào)取交集基因,免疫基因下調(diào)與基質(zhì)細(xì)胞下調(diào)取交集基因,R語言Ven包繪制韋恩圖,即獲得一個上調(diào)及下調(diào)的交集差異基因列表。

1.5 Smad3基因高低組差異基因

1 109例腫瘤樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),按照Smad3基因表達(dá)的中位數(shù),將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,以低表達(dá)組為對照組進(jìn)行分析,低表達(dá)組555例,高表達(dá)組554例。R語言Limma 包分析獲得2組間的差異基因(對數(shù)差異倍數(shù)>1.0,調(diào)整P值<0.05)。

1.6 Smad3差異基因聯(lián)合免疫基因分析

Immport 網(wǎng)站下載免疫細(xì)胞表達(dá)基因列表,將Smad3高低組差異基因聯(lián)合免疫基因分析,獲得Smad3相關(guān)的免疫差異基因及其表達(dá)量。用R語言pHeatmap包和Volcano包繪制差異免疫基因熱圖和火山圖。

1.7 基因本體(GO)富集分析及KEGG通路分析

富集分析采用R語言org.Hs.eg.db包實現(xiàn),主要包括基因本體(GO,gene ontology)富集分析:生物過程、分子功能和細(xì)胞成分KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析,選取FDR (false discovery rate)<0.05 作為節(jié)點,可視化為柱狀圖和圈圖。

1.8 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將Smad3相關(guān)的差異免疫基因上傳至String網(wǎng)站,經(jīng)過分析獲得蛋白互作(PPI,protein protein interaction),進(jìn)一步將蛋白輸入到Cytoscape軟件分析繪圖,將所有相關(guān)蛋白統(tǒng)計并進(jìn)行下一步分析。

1.9 Smad3免疫差異基因與腫瘤微環(huán)境差異基因交集基因

基質(zhì)細(xì)胞免疫細(xì)胞差異基因與Smad3免疫差異基因取交集,并繪制韋恩圖,獲得Smad3腫瘤微環(huán)境免疫相關(guān)交互基因。利用CIBERSORT網(wǎng)站分析交集基因在免疫細(xì)胞中的含量、差異性及相關(guān)性。

1.10 細(xì)胞系及腫瘤模型構(gòu)建

收集培養(yǎng)的對數(shù)生長期4T1細(xì)胞,0.25%的胰酶-EDTA消化,將細(xì)胞濃縮制成2×107mL細(xì)胞懸液。接種于正常飼養(yǎng)的BABL/c雌性小白鼠,在左側(cè)第4對乳腺的脂肪墊注射200 μL細(xì)胞懸液約含4×106細(xì)胞。接種后第6天可見5 mm左右的可觸摸的腫瘤。

1.11 Smad3抑制劑治療BABL/c小鼠乳腺腫瘤

接種后的第7天,腫瘤大小6～7 mm,進(jìn)行分組,隨機(jī)分成4組,每組設(shè)3只重復(fù)平行對照。采用腹腔注射,每組小鼠給予不同劑量的Smad3特異性抑制劑SIS3(0、1 μg/g、2 μg/g、4 μg/g),200 μL每只,對照組注射0.9%生理鹽水含等體積DMSO(dimethyl sulfoxide)。每隔一天腹腔注射SIS3,并連續(xù)治療15 d。分別在治療后第1、3、5、7、9、11、13、15天記錄各組腫瘤的生長情況,繪制腫瘤生長曲線。治療結(jié)束后,小鼠二氧化碳窒息處死,小心取下各組腫瘤,進(jìn)行腫瘤大小的比較拍照,并精確稱量瘤重。

1.12 Western印跡檢測Smad3、p-Smad3和MMP9的表達(dá)

取等體積等含量的腫瘤蛋白樣品上樣,經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,3%BSA封閉后將PVDF膜置于一抗抗體孵育盒中(Smad3、p-Smad3 phosphorylation Smad3、MMP9(matrix metallopeptidase 9)),4 ℃冰箱內(nèi)過夜孵育,時間為12～16 h。次日,孵育結(jié)束后,取出PVDF膜,并用吸水紙將多余抗體稍稍蘸干,在1×TBST中充分洗滌,洗3次,每次10 min。PVDF膜浸沒于HRP標(biāo)記的二抗中,室溫孵育2 h,以β-actin為內(nèi)參。孵育結(jié)束后用1×TBST充分清洗PVDF膜。取ECL化學(xué)發(fā)光液A液和B液各1 mL充分混勻,PVDF膜在室溫下與混合液孵育,孵育過后在化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行掃描,預(yù)先設(shè)定為自動曝光,查看發(fā)光情況,然后手動調(diào)整曝光時間,找到最佳曝光時間。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌腫瘤微環(huán)境與生存關(guān)系

TCGA乳腺癌樣本經(jīng)Estimate評估后得到免疫打分(immune score)和基質(zhì)打分(strom score)。根據(jù)分值的平均值將樣本分為高低2組,分別對比高打分組與低打分組之間基質(zhì)細(xì)胞與免疫細(xì)胞的差異,臨床樣本信息提取后結(jié)合腫瘤微環(huán)境打分情況,繪制Kaplan-Meier生存曲線,高低2組在基質(zhì)和免疫細(xì)胞中的對比情況見圖1。臨床樣本信息提取后結(jié)合腫瘤微環(huán)境打分情況,繪制Kaplan-Meier生存曲線。免疫打分和基質(zhì)打分結(jié)果分別如圖1(a)和圖1(b)所示。從圖1(a)可以看出,基質(zhì)打分P=0.522,大于0.05,無顯著性差別;從圖1(b)可以看出,免疫打分P=0.008,小于0.01,具有極顯著差異。此結(jié)果表明,乳腺癌腫瘤微環(huán)境中,免疫細(xì)胞含量對病人生存率具有顯著的影響。

圖1 乳腺癌腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)和免疫與生存率的關(guān)系Fig.1 Relationshipin between stroma and immunity and survival rate in breast cancer tumor microenvironment separately

2.2 腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞差異基因分析

利用R語言limma包對各轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,獲得免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的基因熱圖,如圖2(a)和圖2(b)所示。從差異基因分析中分別獲得免疫與基質(zhì)細(xì)胞上調(diào)、下調(diào)差異基因,進(jìn)一步將免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞上調(diào)、下調(diào)基因分別取交集,通過R語言Venn圖繪制所得結(jié)果如圖2(c)和圖2(d)所示。從圖2(c)和圖2(d)可以得到上調(diào)交集差異基因437個和下調(diào)交集差異基因49個。

圖2 腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞差異基因表達(dá)Fig.2 Differential gene expression in stromal cells and immune cells in tumor microenvironment

2.3 Smad3相關(guān)免疫差異基因篩選

以Smad3基因中位值為中心點,將樣本分成高表達(dá)組和低表達(dá)組,R語言limma包比較高低表達(dá)組獲得差異基因,將差異基因與Immport免疫基因綜合分析,獲得Smad3基因高低表達(dá)相關(guān)免疫差異基因,繪制差異熱圖見圖3(a)。進(jìn)一步將差異基因分類,以差異倍數(shù)logFC(fold change)為橫坐標(biāo),錯誤發(fā)現(xiàn)率log10(FDR)(false discovery rate)為縱坐標(biāo)繪制差異基因火山圖,見圖3(b)。

2.4 Smad3差異基因GO富集分析

將免疫差異基因進(jìn)行GO分析。GO-BP生物過程分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要跟體液免疫有關(guān),粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞液參與其中。GO-CC細(xì)胞成分主要為分泌顆粒腔、胞質(zhì)小腔泡、囊腔、含膠原蛋白細(xì)胞外基質(zhì)、特殊顆粒腔、血液微粒、三級顆粒腔、免疫球蛋白復(fù)合物。GO-MF分子功能為受體配體活性、細(xì)胞因子活性、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體、趨化因子活化(見圖4)。

圖3 Smad3相關(guān)免疫差異基因篩選Fig.3 Smad3-related immune differential gene

圖4 Smad3相關(guān)免疫差異基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of Smad3-related immune differential gene

2.5 PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

通過String 網(wǎng)站進(jìn)行PPI分析,選取自信度大于0.9的相關(guān)蛋白基因,進(jìn)一步通過節(jié)點數(shù)分析,找到與Smad3差異基因中節(jié)點最多的蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP9具有最多的節(jié)點數(shù),共計14個,如圖5所示。

圖5 Smad3差異基因蛋白節(jié)點數(shù)統(tǒng)計Fig.5 Number of adjacent nodes of Smad3 differential gene

2.6 腫瘤微環(huán)境與Smad3免疫相關(guān)差異基因

將腫瘤微環(huán)境得到的上調(diào)和下調(diào)共計487個差異基因與PPI蛋白互作的15個節(jié)點基因聯(lián)合作Venn交集圖,得到了唯一的交集基因MMP9,見圖6(a)。另外,利用CIBERSORT網(wǎng)站對MMP9進(jìn)行分析,具體分析結(jié)果見圖6(c)。結(jié)果顯示MMP9在大部分的免疫細(xì)胞中都有不同程度的改變,其中M0型巨噬細(xì)胞顯示出較高的相關(guān)性(R=0.74,P<2.2e-16),見圖6(b)。

圖6 MMP9與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞相關(guān)性分析Fig.6 The correlation analysis between MMP9 and immune cells in tumor microenvironment

2.7 Smad3抑制劑對4T1小鼠腫瘤的影響

對4T1乳腺癌小鼠模型進(jìn)行為期15 d的SIS3干預(yù)實驗,抑制Smad3的磷酸化從而抑制Smad3的正常功能,研究發(fā)現(xiàn)在治療結(jié)束時,各干預(yù)組的腫瘤均小于未干預(yù)組,其中濃度越高腫瘤越小。圖7(a)顯示了在治療15 d處死小鼠剝離腫瘤后的各組腫瘤大小。對3個平行組的小鼠腫瘤進(jìn)行稱重,繪制了的直方圖,提示SIS3濃度越高腫瘤質(zhì)量越小(見圖7(b))。在整個15 d的治療干預(yù)過程中,腫瘤體積的大小呈現(xiàn)出了與劑量的相關(guān)性,其中4 μg/g的干預(yù)劑量腫瘤生長最緩慢,體積最小(見圖7(c))。通過Westen blot 蛋白免疫印跡對腫瘤組織內(nèi)的Smad3和磷酸化的Samd3(p-Samd3)以及MMP9的含量進(jìn)行對比分析,可以看到在Smad3相同的水平下,高劑量(4 μg/g)干預(yù)組的Smad3磷酸化顯著被抑制,p-Smad3表達(dá)減少,同時MMP9的含量也有所下降,整體表現(xiàn)出劑量的相關(guān)性(見圖7(d))。

3 討論

在腫瘤微環(huán)境中TGF-β/Smad3通路占有主導(dǎo)地位,Smad3/Smad2磷酸化后能夠聯(lián)合Smad4進(jìn)入細(xì)胞核,啟動相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的進(jìn)程。其中Smad3作為主要的效應(yīng)蛋白在腫瘤發(fā)展中具有促進(jìn)作用。Smad3對細(xì)胞外基質(zhì)蛋白起到關(guān)鍵作用,抑制Smad3磷酸化能降低腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力,減小轉(zhuǎn)移的幾率[5]。研究指出降低Smad3磷酸化程度,能夠顯著減少腫瘤細(xì)胞的增殖[6],這一結(jié)果與我們的結(jié)果相同,SIS3抑制Smad3的磷酸化,從而減少了腫瘤細(xì)胞的生長。以上均表明,TGF-β/Smad3在腫瘤微環(huán)境中能夠幫助EMT的形成,幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視,改變細(xì)胞外基質(zhì),利于腫瘤自身的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。另外,Smad3通過調(diào)控例如NK細(xì)胞[7]、巨噬細(xì)胞[8]、Treg[9]等免疫細(xì)胞,幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。Smad3可作為治療腫瘤的一個潛在靶點[10],同時也被作為腫瘤的檢測標(biāo)志[11]。

圖7 Smad3磷酸化抑制能減緩小鼠腫瘤生長Fig.7 Smad3 phosphorylation inhibition on tumor growth mitigation in mice

研究通過對乳腺癌腫瘤細(xì)胞微環(huán)境進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在微環(huán)境中免疫細(xì)胞與乳腺癌病人的生存具有極大的關(guān)聯(lián)性。進(jìn)一步以Smad3分組,將病人進(jìn)行分組與免疫基因關(guān)聯(lián),得到了唯一的相關(guān)蛋白MMP9。MMP是細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的重要成分,能夠降解ECM的各種成分,反應(yīng)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)SIS3[12]作為Smad3的抑制劑,它能夠減緩腫瘤的生長并且降低腫瘤內(nèi)金屬蛋白酶的含量[13-14]。研究也證實Smad3磷酸化抑制后能夠降低MMP9的表達(dá),抑制腫瘤的生長。也有相關(guān)報道指出,Smad3與MMP9之間存在相互關(guān)聯(lián)[15-16],但不是腫瘤細(xì)胞。研究也證明了Smad3與MMP9在腫瘤細(xì)胞中有相關(guān)性,Smad3磷酸化程度越高,MMP9的表達(dá)越高。

總之,研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出Smad3腫瘤微環(huán)境中免疫相關(guān)的基因MMP9,MMP9的表達(dá)與Smad3磷酸化程度呈現(xiàn)出正相關(guān),Smad3磷酸化抑制后MMP9表達(dá)降低,腫瘤生長也緩慢,Smad3可以作為一個潛在的治療靶點用于乳腺癌的治療,另外p-Smad3/MMP9也可以作為檢驗乳腺癌轉(zhuǎn)移的一個檢測標(biāo)志。