干魚(yú)腥草藥材及飲片的指紋圖譜建立、化學(xué)計(jì)量學(xué)分析及含量測(cè)定

王靜 朱廣飛 梁思予 張科衛(wèi) 陸兔林 毛春芹

中圖分類(lèi)號(hào) R917;R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）08-0923-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.08.04

摘 要 目的 建立干魚(yú)腥草藥材及飲片的指紋圖譜，并進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，同時(shí)測(cè)定其中新綠原酸等5種黃酮類(lèi)成分的含量。方法 采用高效液相色譜（HPLC）法，以槲皮苷為參照，繪制10批干魚(yú)腥草藥材及飲片的HPLC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰;采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），以變量重要性投影（VIP）值大于1為標(biāo)準(zhǔn)篩選影響干魚(yú)腥草藥材及飲片質(zhì)量的差異性成分;采用同一HPLC法測(cè)定干魚(yú)腥草藥材及飲片中新綠原酸等5種成分的含量。結(jié)果 10批干魚(yú)腥草藥材及飲片均有20個(gè)共有峰，相似度均大于0.960;共指認(rèn)了其中5個(gè)共有峰，分別為新綠原酸（1號(hào)峰）、綠原酸（3號(hào)峰）、隱綠原酸（4號(hào)峰）、蘆?。?號(hào)峰）、槲皮苷（11號(hào)峰）。PCA和PLS-DA結(jié)果均顯示，干魚(yú)腥草藥材及飲片各自分為一類(lèi);VIP值大于1的共有峰依次為7號(hào)峰（蘆丁）、20號(hào)峰、5號(hào)峰、13號(hào)峰、2號(hào)峰、18號(hào)峰、3號(hào)峰（綠原酸）、14號(hào)峰、17號(hào)峰和19號(hào)峰。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和槲皮苷檢測(cè)質(zhì)量濃度的線(xiàn)性范圍分別為3.77～60.29 μg/mL（r=0.999 7）、1.40～22.42 μg/mL（r=0.999 5）、3.76～60.22 μg/mL（r=0.999 9）、2.19～35.06 μg/mL（r=0.999 9）、25.49～407.88 μg/mL（r=0.999 7）;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%;干魚(yú)腥草藥材及飲片中上述5種成分的平均加樣回收率分別為98.72%～101.12%、98.86%～100.63%（RSD均小于3%，n=9）。干魚(yú)腥草藥材中上述5種成分的平均含量分別為0.87、0.33、0.59、0.61、6.17 mg/g，飲片中分別為0.42、0.11、0.26、0.23、3.16 mg/g。結(jié)論 所建指紋圖譜及含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可行，可用于干魚(yú)腥草藥材及飲片的質(zhì)量控制;蘆丁等成分可能是影響其藥材及飲片質(zhì)量的差異性成分;干魚(yú)腥草藥材經(jīng)炮制后，新綠原酸等5種黃酮類(lèi)成分的平均含量均有所降低。

關(guān)鍵詞 干魚(yú)腥草;藥材;飲片;指紋圖譜;含量測(cè)定;高效液相色譜法;化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

Study on the fingerprint establishment， chemometrics analysis and content determination of dried Houttuynia cordata and its decoction pieces

WANG Jing，ZHU Guangfei，LIANG Siyu，ZHANG Kewei，LU Tulin，MAO Chunqin（School of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To establish the fingerprints of dried Houttuynia cordata and its decoction pieces， conduct chemometrics analysis and determine the contents of 5 flavonoids such as neochlorogenic acid. METHODS High performance liquid chromatography （HPLC） method was adopted. Using quercitrin as reference， HPLC fingerprints of 10 batches of dried H. cordata and its decoction pieces were drawn. The similarity evaluation was conducted by Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）， the common peaks were also confirmed. SIMCA-P 14.1 software was applied for principal component analysis （PCA） and partial least square-discriminant analysis （PLS-DA）， and the variable importance in projection （VIP） value more than 1 was considered as a standard to screen the differential components affecting the quality of these two products; meanwhile， the contents of 5 components such as neochlorogenic acid in both products were determined by the same HPLC method. RESULTS There were 20 common peaks in 10 batches of dried H. cordata and 10 batches of its decoction pieces with the similarity values more than 0.960. A total of 5 common peaks were identified， which were neochlorogenic acid （peak 1）， chlorogenic acid （peak 3）， cryptochlorogenic acid （peak 4）， rutin （peak 7） and quercitrin （peak 11）. The results of PCA and PLS-DA showed that dried H. cordata could be distinguished from its decoction pieces obviously; the common peaks with VIP value greater than 1 were as follows： peak 7 （rutin）， peak 20， peak 5， peak 13， peak 2， peak 18， peak 3 （chlorogenic acid）， peak 14， peak 17 and peak 19. The linear range of neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， rutin and quercitrin were 3.77-60.29 μg/mL （r=0.999 7）， 1.40-22.42 μg/mL （r=0.999 5）， 3.76-60.22 μg/mL （r=0.999 9）， 2.19-35.06 μg/mL （r=0.999 9） and 25.49-407.88 μg/mL （r=0.999 7）， respec- tively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 3%. The average recoveries of the above components in these two products were 98.72%-101.12% and 98.86%-100.63% with RSDs less than 3% （n=9）. In dried H. cordata， the average contents of 5 components were 0.87， 0.33， 0.59， 0.61 and 6.17 mg/g， while the average contents were 0.42， 0.11， 0.26， 0.23 and 3.16 mg/g in its decoction pieces， respectively. CONCLUSIONS HPLC fingerprint and the method of content determination are stable and feasible， which could be used for the quality control of dried H. cordata and its decoction pieces. Besides， rutin and other components may be the differential components which could affect the quality of these two products; the average contents of the 5 flavonoids such as neochlorogenic acid in dried H. cordata all decrease after processing.

KEYWORDS ? dried Houttuynia cordata; medicinal material; decoction pieces; fingerprint; content determination; high performance liquid chromatography; chemometrics analysis

魚(yú)腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草或干燥地上部分，其味辛，性微寒，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的功效[1]。該藥主要含有揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)等成分，具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等作用，常與其他中藥配伍用于呼吸道感染、扁桃體炎、流行性腮腺炎、角膜炎、病毒性腸炎、鼻咽癌等的治療[2-4]。目前，含魚(yú)腥草的成方制劑和單味制劑使用廣泛，如被2020年版《中國(guó)藥典》（一部）收錄的連花清瘟膠囊（顆粒）、魚(yú)腥草滴眼液、復(fù)方魚(yú)腥草片（合劑）、急支糖漿等。魚(yú)腥草的化學(xué)成分復(fù)雜，2020年版《中國(guó)藥典》（一部）“魚(yú)腥草”項(xiàng)下含鮮魚(yú)腥草和干魚(yú)腥草，但質(zhì)量控制均僅以外觀(guān)性狀、顯微、薄層色譜、理化鑒別為主[1]，缺乏全面反映其質(zhì)量的客觀(guān)指標(biāo)及含量測(cè)定項(xiàng)。筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，含魚(yú)腥草的眼用制劑主要以其揮發(fā)油類(lèi)成分（甲基正壬酮、魚(yú)腥草素）為質(zhì)量控制指標(biāo)[1，5]，而口服制劑則多以黃酮類(lèi)成分（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷等）為質(zhì)量控制指標(biāo)[6-8]，且上述黃酮類(lèi)成分亦為魚(yú)腥草中含量較高的活性成分[9-10]?？紤]在實(shí)際大工業(yè)生產(chǎn)中，所用原料基本均為干魚(yú)腥草藥材及飲片，因此本研究擬對(duì)干魚(yú)腥草藥材及飲片中的黃酮類(lèi)成分（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和槲皮苷）進(jìn)行分析。

中藥指紋圖譜是控制中藥及其制劑質(zhì)量的有效手段，可較全面地反映中藥及其制劑中化學(xué)成分的種類(lèi)與含量，可對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面表征并實(shí)現(xiàn)對(duì)多種藥效成分的綜合評(píng)價(jià)[11]?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)是篩選中藥質(zhì)量標(biāo)志物的重要數(shù)學(xué)方法，具有較好的預(yù)測(cè)精度和廣泛的適用性，可分為非監(jiān)督模式識(shí)別方法和監(jiān)督模式識(shí)別方法，前者主要包括主成分分析（principal componet analysis，PCA）、聚類(lèi)分析等，后者主要包括偏最小二乘法-判別分析（partial least square-discrimination analysis，PLS-DA）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等[12]。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，能有助于研究者對(duì)指紋圖譜的有效信息進(jìn)行提取和處理，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于中藥材及飲片的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)[11-12]?；诖?，本研究擬建立干魚(yú)腥草藥材及飲片的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析其藥材與飲片的差異;與此同時(shí)，擬采用同一HPLC法測(cè)定干魚(yú)腥草藥材及飲片中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和槲皮苷5種黃酮類(lèi)成分的含量，旨在為全面控制其整體質(zhì)量、進(jìn)一步開(kāi)發(fā)相關(guān)制劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20AD型HPLC儀及配備的DGC-20A型在線(xiàn)脫氣系統(tǒng)、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、CTO-20AC型柱溫箱、SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器（日本Shimadzu公司），MS-105D型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），F(xiàn)A1104N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

新綠原酸對(duì)照品（批號(hào)DSTDX001503）、隱綠原酸對(duì)照品（批號(hào)DSTDY003502）均購(gòu)自成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司，綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-202018）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，蘆丁對(duì)照品（批號(hào)Y06J8S37439）、槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)18082102）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%;乙腈、乙酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

10批干魚(yú)腥草藥材（編號(hào)YC1～YC10）及10批飲片（編號(hào)YP1～YP10）均購(gòu)自湖北省襄陽(yáng)市、重慶市忠縣、四川省宜賓市的中藥材市場(chǎng)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為三白草科植物蕺菜H. cordata Thunb.的干燥地上部分。10批干魚(yú)腥草藥材及飲片的來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 干魚(yú)腥草藥材及飲片HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 以Merck Purospher Star LP RP-18 Endcapped（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.05%乙酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～26 min，8%A;26～31 min，8%A→14%A;31～61 min，14%A→24%A，61～86 min，24%A→39%A;86～104 min，39%A→74%A;104～108 min，74%A→95%A）;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋?zhuān)瞥缮鲜?種成分質(zhì)量濃度分別為120.576、44.832、120.448、70.128、815.760 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過(guò)三號(hào)篩，下同）約1.0 g，精密稱(chēng)定，置于圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇30 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取干魚(yú)腥草藥材（編號(hào)YC1）、干魚(yú)腥草飲片（編號(hào)YP1）樣品粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖。以槲皮苷為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，干魚(yú)腥草藥材中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.22%～0.97%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.98%～1.64%（n=6）;干魚(yú)腥草飲片中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.23%～1.14%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD為1.09%～1.84%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取干魚(yú)腥草藥材（編號(hào)YC1）、干魚(yú)腥草飲片（編號(hào)YP1）樣品粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以槲皮苷為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，干魚(yú)腥草藥材中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.39%～1.21%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為1.62%～2.39%（n=6）;干魚(yú)腥草飲片中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.56%～1.20%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為1.78%～2.54%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取干魚(yú)腥草藥材（編號(hào)YC1）、干魚(yú)腥草飲片（編號(hào)YP1）樣品粉末，各6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以槲皮苷為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，干魚(yú)腥草藥材中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為1.07%～1.82%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為1.01%～2.10%（n=6）;干魚(yú)腥草飲片中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.99%～1.83%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為1.02%～2.23%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 指紋圖譜的建立 分別取10批干魚(yú)腥草藥材及飲片樣品粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將上述色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以任意樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，經(jīng)全峰匹配后得到干魚(yú)腥草藥材及飲片的疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R）。結(jié)果顯示，10批干魚(yú)腥草藥材及飲片均有20個(gè)共有峰，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.1.8 共有峰的指認(rèn) 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將所得色譜圖（圖3A）與“2.1.7”項(xiàng)下干魚(yú)腥草藥材及飲片的色譜圖進(jìn)行比對(duì)，共指認(rèn)了5個(gè)共有峰，分別為新綠原酸（1號(hào)峰）、綠原酸（3號(hào)峰）、隱綠原酸（4號(hào)峰）、蘆?。?號(hào)峰）、槲皮苷（11號(hào)峰）。因槲皮苷的峰面積較大且周?chē)€(xiàn)平穩(wěn)，干擾峰較少，故選擇槲皮苷為參照。此外，與干魚(yú)腥草藥材相比，其飲片樣品色譜中的5號(hào)峰和14號(hào)峰的峰面積均顯著增加，可用于區(qū)分干魚(yú)腥草藥材和飲片。

2.1.9 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)干魚(yú)腥草藥材及飲片指紋圖譜的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，與對(duì)照指紋圖譜比較，干魚(yú)腥草藥材及飲片指紋圖譜的相似度均大于0.960，表明各樣品化學(xué)成分的種類(lèi)一致性良好，詳見(jiàn)表2。

2.2 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.2.1 PCA 為探討干魚(yú)腥草藥材及飲片的成分差異，本研究以10批干魚(yú)腥草藥材及10批飲片共有峰的相對(duì)峰面積為變量，采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，干魚(yú)腥草藥材及飲片的主成分空間分布有各自特定的區(qū)域，沿主成分1軸左右分開(kāi)，其中干魚(yú)腥草藥材分布于得分圖的右側(cè)，其飲片分布于得分圖的左側(cè)，表明兩者化學(xué)成分存在差異。

2.2.2 PLS-DA 為更好地觀(guān)察組間差異，本研究以10批干魚(yú)腥草藥材及飲片共有峰的相對(duì)峰面積為變量，采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PLS-DA，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，模型的累積解釋度（R 2X、R 2Y）分別為0.582、0.843，累積預(yù)測(cè)度（Q 2）為0.669，均大于0.5，表明所建數(shù)學(xué)模型可靠[13]。干魚(yú)腥草藥材及飲片各自分為一類(lèi)，沿主成分1軸明顯分開(kāi)，其中干魚(yú)腥草藥材分布于得分圖的左側(cè)，其飲片分布于得分圖的右側(cè)，與上述PCA結(jié)果基本一致。

為明確影響干魚(yú)腥草藥材及飲片質(zhì)量的差異性成分，本研究以10批干魚(yú)腥草藥材及飲片共有峰的相對(duì)峰面積為變量，采用SIMCA-P 14.1軟件對(duì)各共有峰對(duì)應(yīng)成分的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值進(jìn)行分析，以VIP值>1為標(biāo)準(zhǔn)篩選出貢獻(xiàn)較大的差異性成分[12]，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，VIP值>1的共有峰依次為7號(hào)峰（蘆?。?0號(hào)峰、5號(hào)峰、13號(hào)峰、2號(hào)峰、18號(hào)峰、3號(hào)峰（綠原酸）、14號(hào)峰、17號(hào)峰和19號(hào)峰，這些共有峰對(duì)應(yīng)的成分可能是影響干魚(yú)腥草藥材及飲片質(zhì)量的差異性成分。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 同“2.1.2”項(xiàng)。

2.3.3 供試品溶液的制備 同“2.1.3”項(xiàng)。

2.3.4 空白溶液的制備 不加樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下“精密加入70%乙醇30 mL……即得”操作，即得空白溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖3）。由圖3可知，各成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于3 000，空白溶液對(duì)各成分的測(cè)定無(wú)干擾。

2.3.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋?zhuān)瞥尚戮G原酸質(zhì)量濃度分別為3.77、7.54、15.07、30.14、60.29 μg/mL，綠原酸分別為1.40、2.80、5.60、11.21、22.42 μg/mL，隱綠原酸分別為3.76、7.53、15.06、30.11、60.22 μg/mL，蘆丁分別為2.19、4.38、8.77、17.53、35.06 μg/mL，槲皮苷分別為25.49、50.99、101.97、203.94、407.88 μg/mL的系列工作溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取“2.3.6”項(xiàng)下某系列工作溶液（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷質(zhì)量濃度分別為15.07、5.60、15.06、8.77、101.97 μg/mL）適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷峰面積的RSD分別為0.55%、1.01%、1.11%、0.94%、0.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下干魚(yú)腥草藥材（編號(hào)YC1）、干魚(yú)腥草飲片（編號(hào)YP1）供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，干魚(yú)腥草藥材中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷峰面積的RSD分別為1.06%、1.28%、1.69%、1.86%、0.09%（n=6），干魚(yú)腥草飲片中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷峰面積的RSD分別為1.14%、1.33%、1.75%、2.30%、0.12%（n=6），表明上述供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取干魚(yú)腥草藥材（編號(hào)YC1）、干魚(yú)腥草飲片（編號(hào)YP1）樣品粉末，各6份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中各待測(cè)成分的含量。結(jié)果顯示，干魚(yú)腥草藥材中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷含量的RSD分別為1.98%、1.68%、1.73%、2.67%、0.20%（n=6），干魚(yú)腥草飲片中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷含量的RSD分別為1.72%、1.56%、1.93%、2.41%、0.31%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的干魚(yú)腥草藥材（編號(hào)YC1）樣品粉末0.5 g，共9份，分別加入混合對(duì)照品溶液（精密稱(chēng)取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋?zhuān)瞥筛鞒煞仲|(zhì)量濃度分別為490.256、278.568、364.648、293.760、3 065.904 μg/mL的混合對(duì)照品溶液）0.5、1.0、1.5 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。精密稱(chēng)取已知含量的干魚(yú)腥草飲片（編號(hào)YP1）樣品粉末0.5 g，共9份，分別加入混合對(duì)照品溶液（精密稱(chēng)取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋?zhuān)瞥筛鞒煞仲|(zhì)量濃度分別為122.564、46.428、76.768、78.336、1 249.072 μg/mL的混合對(duì)照品溶液）0.5、1.0、1.5 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.3.11 樣品含量測(cè)定 取10批干魚(yú)腥草藥材及飲片樣品粉末，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品含量。每樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，將干魚(yú)腥草藥材炮制為飲片后，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷的平均含量均不同程度地降低，其中蘆丁的降幅最大，約為62.3%。

3 討論

本課題組前期分別對(duì)供試品溶液的提取溶劑、提取方式、料液比和加熱回流時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，當(dāng)以70%乙醇為提取溶劑、料液比為1 ∶ 30（g/mL）、加熱回流時(shí)間為30 min時(shí)，提取效率最高，所得色譜圖的基線(xiàn)較平穩(wěn)、各色譜峰分離度較好且雜質(zhì)干擾較小。綜合考慮，最終確定供試品溶液的制備方法如下：取樣品粉末約1.0 g，加入70%乙醇30 mL，加熱回流30 min。本課題組前期采用二極管陣列檢測(cè)器在190～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，待測(cè)樣品在320 nm波長(zhǎng)下所得色譜信息較全面，色譜峰峰形整體良好，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。此外，本課題組前期還考察了乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%乙酸溶液3個(gè)流動(dòng)相體系的分離效果，結(jié)果顯示，當(dāng)以乙腈-0.05%乙酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，各色譜峰分離效果較好且雜質(zhì)干擾較小。

目前，關(guān)于魚(yú)腥草的研究大多為魚(yú)腥草藥材，且僅限于指紋圖譜研究[14-16]或含量測(cè)定[17-21]，而兩者結(jié)合的研究較少。雖然，張婷婷等[22]、盧紅梅等[23]將定性與定量分析相結(jié)合，但只研究了其中1～3種黃酮類(lèi)成分，較為局限，不能全面反映魚(yú)腥草的質(zhì)量。何兵等[10]雖然在建立魚(yú)腥草藥材指紋圖譜的基礎(chǔ)上，采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定了其中多個(gè)成分的含量，但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求較高。同時(shí)，筆者通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，尚少有關(guān)于魚(yú)腥草飲片的研究，考慮到鮮魚(yú)腥草在采集和儲(chǔ)存方面存在一定困難，且制劑生產(chǎn)所用原料多為干魚(yú)腥草藥材及飲片，因此本研究以干魚(yú)腥草藥材及飲片為對(duì)象，建立了兩者的HPLC指紋圖譜。結(jié)果顯示，10批干魚(yú)腥草藥材及飲片均有20個(gè)共有峰，與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.960，表明干魚(yú)腥草藥材經(jīng)炮制后，其化學(xué)成分的種類(lèi)未發(fā)生明顯改變。筆者在分析各共有峰的峰面積時(shí)發(fā)現(xiàn)，干魚(yú)腥草藥材經(jīng)炮制后，其5號(hào)峰和14號(hào)峰的峰面積明顯增加，推測(cè)其原因可能與水處理和加熱（干燥）過(guò)程有關(guān)。因此，筆者認(rèn)為，上述兩色譜峰的峰面積可用于區(qū)分干魚(yú)腥草藥材和飲片。PCA和PLS-DA結(jié)果均顯示，干魚(yú)腥草藥材和飲片各自分為一類(lèi)，7號(hào)峰（蘆?。?、20號(hào)峰、5號(hào)峰、13號(hào)峰、2號(hào)峰、18號(hào)峰、3號(hào)峰（綠原酸）、14號(hào)峰、17號(hào)峰和19號(hào)峰對(duì)應(yīng)的成分可能是影響干魚(yú)腥草藥材及飲片質(zhì)量的差異性成分。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，干魚(yú)腥草藥材中新綠原酸等5種成分的含量分別為0.29～1.68、0.15～0.67、0.23～1.44、0.43～0.95、3.82～8.74 mg/g，其平均含量分別為0.87、0.33、0.59、0.61、6.17 mg/g;干魚(yú)腥草飲片中上述5種成分的含量分別為0.19～0.60、0.05～0.20、0.15～0.38、0.12～0.38、2.00～4.87 mg/g，其平均含量分別為0.42、0.11、0.26、0.23、3.16 mg/g，表明干魚(yú)腥草藥材經(jīng)炮制后，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮苷的平均含量均有不同程度的降低，其原因可能為炮制過(guò)程中的水洗和干燥步驟使上述成分有所損失[24-25]。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜及含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可行，可用于干魚(yú)腥草藥材及飲片的質(zhì)量控制;蘆丁等成分可能是影響其藥材及飲片質(zhì)量的差異性成分;干魚(yú)腥草藥材經(jīng)炮制后，新綠原酸等5種黃酮類(lèi)成分的平均含量均有所降低。

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（收稿日期：2021-09-29 修回日期：2022-01-20）

（編輯：陳 宏）