李小蘭，張 瑞，郝蘭蘭，王 鴻，2，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 林果花卉研究所，甘肅 蘭州 730070)

植物經(jīng)常遭受各種生物和非生物脅迫，如鹽、干旱、寒冷、病原體和害蟲(chóng)等，這些脅迫直接或間接地影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，從而影響植物的生產(chǎn)。由于植物的許多代謝途徑都是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的，轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與特定的順式啟動(dòng)子元件結(jié)合，在植物應(yīng)對(duì)這些脅迫的響應(yīng)中起著重要作用。近年來(lái)轉(zhuǎn)錄因子越來(lái)越受到人們的關(guān)注，NAC轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答均有重要調(diào)節(jié)功能，改變NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量，不僅可以緩解果實(shí)采收后的衰老，而且可以有效抵御各種非生物脅迫。

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物在應(yīng)對(duì)不利環(huán)境脅迫中起重要作用的最大的特異性基因家族之一。NAC家族基因的名稱來(lái)源于3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子：NAM(no apical meristem)、ATAF1/2和CUC2(cup-shaped cotyledon)。NAC特定結(jié)構(gòu)域位于NAC家族蛋白的N端區(qū)域，可分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A～E)，亞域C提供NAC轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力。NAC蛋白的C端除具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域外，還具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活或抑制活性的高度分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，使NAC轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)成熟、葉片衰老、激素信號(hào)，以及生物和非生物脅迫應(yīng)答的功能。由于NAC蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要作用，不少研究已經(jīng)對(duì)擬南芥、水稻、大豆、白梨、苦蕎、白楊、葡萄、梅花、西瓜等植物進(jìn)行了全基因組分析。NAC蛋白在植物中的一個(gè)重要調(diào)控作用是提高植物的抗寒性，已有研究表明，在構(gòu)樹(shù)、蓮藕、木薯、西瓜和白梨中都發(fā)現(xiàn)了數(shù)量不等的NAC抗寒基因。近年來(lái)，Zhuo等在梅花中發(fā)現(xiàn)了15個(gè)NAC抗寒基因。但是，目前為止對(duì)NAC基因在桃抗寒方面的作用尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。

桃(L.)是薔薇科李屬桃亞屬果樹(shù)，是我國(guó)重要的落葉果樹(shù)之一，其果實(shí)色、香、味、質(zhì)俱佳，具有很高的經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近年來(lái)頗受人們的喜愛(ài)。溫度是影響桃產(chǎn)量和地理分布的關(guān)鍵因素。我國(guó)桃種植的北線是39°N～40°N，這些地區(qū)周期性發(fā)生凍害，對(duì)桃產(chǎn)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響。桃中與抗寒相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究還比較少。武肖琦利用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得與桃果實(shí)發(fā)育相關(guān)的72基因，在番茄中過(guò)表達(dá)72可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄的果實(shí)發(fā)育，加速果實(shí)成熟。因此，挖掘抗寒相關(guān)基因，為桃抗寒育種提供新的候選基因，對(duì)桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本研究根據(jù)桃基因組提供的信息，對(duì)桃NAC基因數(shù)量進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、基序組成、染色體定位，以及與擬南芥的進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了研究。另外，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析了16個(gè)基因在低溫處理不同時(shí)間的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 材料

以桃品種丁家壩為材料，于2020年9月下旬在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桃園采集12枝直徑(1±0.2)cm、長(zhǎng)短相同、朝北直立生長(zhǎng)的一年生帶葉枝條。將枝條置于室溫水培24 h，隨后將枝條隨機(jī)分為4組，用保鮮袋密封，于4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫誘導(dǎo)。分別在0、2、6、12 h隨機(jī)選取一組枝條采集葉片，選取從上往下數(shù)第7到第9片葉作為實(shí)驗(yàn)材料，立即用液氮冷凍，-80 ℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組3個(gè)枝條分別作為3個(gè)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 桃基因組中NAC基因的鑒定

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中(TAIR)(http://www. arabidopsis.org/)下載擬南芥NAC家族基因的蛋白序列和CDS序列。在桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中(GDR)(https://www.rosaceae.org/)下載桃基因注釋Excel文件，篩選結(jié)構(gòu)域?yàn)镻F02365和PF01849的基因，獲得桃NAC候選基因。進(jìn)一步運(yùn)用Pfam(https：//pfam.xfam.org/search)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)軟件確認(rèn)桃NAC候選基因的保守結(jié)構(gòu)域，最終獲得桃NAC家族基因(簡(jiǎn)稱)。利用在線網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)篩選的桃NAC家族基因進(jìn)行理化性質(zhì)分析。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

利用MEGA 6.0程序(http://www.megasoftware.net/mega.php)的鄰接法，使用蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap replications設(shè)置為1 000。使用MEME在線軟件(http：//meme-suite.org/tools/meme)對(duì)PpNAC蛋白序列特征進(jìn)行分析，基序數(shù)量設(shè)置為8(motif1～motif8)。利用全長(zhǎng)序列結(jié)合桃基因組注釋信息文件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，同時(shí)利用TBtools對(duì)基因結(jié)構(gòu)和保守基序進(jìn)行可視化。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育和多序列比對(duì)

為了探究桃與擬南芥NACs的進(jìn)化關(guān)系，采用Clustal W軟件對(duì)桃和擬南芥NAC蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并利用MEGA 6.0程序的鄰接法(neighbor joining，NJ)(http://www.megasoftware.net/mega.php)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，參數(shù)設(shè)置為Poission模式、完全刪除和1 000次重復(fù)。利用DNAMAN軟件對(duì)蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)。

1.2.4 染色體定位分析

根據(jù)基因在桃數(shù)據(jù)庫(kù)中的位置，用MG2C軟件(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)將所有基因定位到桃染色體上。

1.2.5 啟動(dòng)子順式作用元件分析

使用TBtools軟件結(jié)合桃基因組文件和基因結(jié)構(gòu)注釋信息文件提取基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp的序列，使用Plant CARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)，最后利用TBtools進(jìn)行可視化。

1.2.6 qRT-PCR

依據(jù)順式作用元件分析結(jié)果，選取16個(gè)含低溫響應(yīng)和逆境應(yīng)答元件較多的基因，使用DNAMAN設(shè)計(jì)家族基因特異性引物(表 1)，并在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。cDNA合成采用Prime Script RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)，并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用SYBR Green熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以作為內(nèi)參基因。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s；60 ℃ 60 s；50 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃NAC基因的鑒定與理化性質(zhì)

根據(jù)PF02365和PF01849結(jié)構(gòu)域在桃基因注釋Excel文件中搜索，共篩選出119個(gè)桃NAC基因家族成員。根據(jù)以往研究中提出的命名方法，將119個(gè)桃NAC基因命名為001～119。這些基因的基本信息如表2所示，包括桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋號(hào)、染色體位置、氨基酸數(shù)量、分子量和等電點(diǎn)(pI)。119個(gè)基因除119位于染色體骨架上之外，其余基因均定位在桃的8條染色體上；編碼的氨基酸數(shù)量在68(026)～862(PpNAC077)，平均氨基酸長(zhǎng)度為352 aa；分子量為7.2(PpNAC026)～96.1(PpNAC077)ku，平均分子量為39.8ku；等電點(diǎn)在4.3(PpNAC019和PpNAC100)～9.5(PpNAC047)。

2.2 桃NAC基因家族的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

進(jìn)化樹(shù)結(jié)果(圖1)顯示，119個(gè)被劃分為12個(gè)亞族(Ⅰ～Ⅻ)，每個(gè)亞族的成員數(shù)量為1～22。其中，第Ⅹ亞族成員數(shù)量最少，只包含1個(gè)基因；第Ⅰ亞族成員數(shù)量最多，包含22個(gè)基因。為了鑒定的結(jié)構(gòu)多樣性，分析了單個(gè)基因序列中的外顯子-內(nèi)含子數(shù)量。結(jié)果(圖1-B)顯示：19個(gè)基因沒(méi)有內(nèi)含子，除026外均處于第Ⅷ和第Ⅸ亞族中；其余基因至少包含1個(gè)內(nèi)含子(005、017、023、034、069、071、086、091、092、095)，最多包含9個(gè)內(nèi)含子(029)。同一亞族內(nèi)的基因內(nèi)含子數(shù)量和長(zhǎng)度基本一致，例如，第Ⅵ和第Ⅶ亞族中除了少數(shù)基因外，大多數(shù)基因都含有2個(gè)內(nèi)含子，第Ⅷ和第Ⅸ亞族中多數(shù)基因不含內(nèi)含子。

表1 引物信息

表2 桃NAC家族基因成員的相關(guān)信息

續(xù)表2 Continued Table 2

續(xù)表2 Continued Table 2

由圖1-A可以看出，motif1+motif8、motif5、motif4+motif2、motif6+motif3和motif7分別組成了NAC的子結(jié)構(gòu)域A、B、C、D和E。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，大部分保守基序位于NAC結(jié)構(gòu)域的N端區(qū)域，表明這些保守基序?qū)Φ墓δ芫哂兄匾饬x。從出現(xiàn)頻率來(lái)看，motif1、motif3和motif7出現(xiàn)頻率最高，幾乎覆蓋了從Ⅰ到Ⅻ的所有亞族，表明motif1、motif3和motif7是的重要保守基序。此外，聚集在同一亞族中的基序組成和排列順序基本相同，推測(cè)特定的基序組成和排列順序可能與不同亞族的特定功能有關(guān)。

2.3 PpNACs多序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)119個(gè)PpNACs的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析可知，NAC結(jié)構(gòu)域的子域A、C和D是保守的，而B(niǎo)和E是發(fā)散的(圖2)。詳細(xì)檢查子域B和E發(fā)現(xiàn)，Ⅻ亞族序列的子域B和E都不保守。由于子域A、C、和D保守，推測(cè)他們?cè)贜AC家族基因的功能中發(fā)揮重要作用，發(fā)散的子域B和E可能與NAC家族基因的特定功能有關(guān)。

CDS中間的區(qū)域是內(nèi)含子。The region in the middle of the CDS was intron.圖1 PpNAC基因的基序分析(A)和基因結(jié)構(gòu)(B)Fig.1 Gene structure and motif analysis of PpNACs in peach

圖2 桃NAC的多序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of NAC in peach

通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析將桃和擬南芥的NAC分為18個(gè)亞族(a～r)(圖3)。119個(gè)PpNACs分布在除亞族c、d和h外的15個(gè)亞族上，每個(gè)亞族包含1～23個(gè)成員。其中，p亞族包含成員數(shù)量最少，只包含1個(gè)，e亞族包含成員數(shù)量最多，有23個(gè)成員。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥與桃之間存在一些密切相關(guān)的NACs(比如PpNAC005、PpNAC080和ANAC006，PpNAC118和ANAC74等)，這些PpNACs可能與擬南芥的同源ANACs具有相似的功能。

2.4 PpNACs基因的染色體定位分析

根據(jù)119個(gè)基因在桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的位置，使用MapChart軟件繪制了其在染色體上的分布情況，其中，118個(gè)基因不均勻地分布在1到8號(hào)染色體上，119被定位在未定位的支架上(scaffold-53)(圖4)。2號(hào)染色體上分布的基因數(shù)量最多，占比21%；其次是4號(hào)染色體，占比18%；3號(hào)、5號(hào)和8號(hào)染色體分布的基因數(shù)量最少，分別包含8、11和11個(gè)基因。

☆，擬南芥；★，桃。☆，Arabidopsis; ★， Peach.圖3 桃和擬南芥NAC家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of NAC family members in peach and Arabidopsis

2.5 PpNACs的順式作用元件

在桃NAC家族基因起始密碼子上游2 000 bp序列中共篩選出9種類(lèi)型的順勢(shì)調(diào)控元件：(1)脫落酸響應(yīng)原件298個(gè)；(2)光響應(yīng)原件1331個(gè)；(3)茉莉酸甲酯響應(yīng)原件382個(gè)；(4)防御和應(yīng)激響應(yīng)原件52個(gè)；(5)水楊酸響應(yīng)原件84個(gè)；(6)低溫響應(yīng)原件92個(gè)；(7)生長(zhǎng)素響應(yīng)原件103個(gè)；(8)類(lèi)黃酮響應(yīng)原件10個(gè)；(9)赤霉素響應(yīng)原件121個(gè)(圖5)。推測(cè)NAC家族基因在桃應(yīng)對(duì)生物與非生物脅迫響應(yīng)發(fā)揮重要作用。

2.6 PpNACs在低溫脅迫下的表達(dá)模式

挑選16個(gè)含低溫響應(yīng)和逆境應(yīng)答元件較多的基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果(圖6)表明，4℃低溫脅迫下，所選的16個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量在低溫脅迫不同時(shí)間均表現(xiàn)為上調(diào)；015、037、048和064在低溫脅迫2 h時(shí)，與對(duì)照相比表達(dá)量上調(diào)不明顯；與低溫處理2 h相比，048、052、077和117在低溫處理6 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)不顯著；在低溫處理12 h時(shí)，所有的基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著上調(diào)。表明桃NAC轉(zhuǎn)錄因子家族可能在桃的抗寒過(guò)程中發(fā)揮重要功能，并且需要在一定時(shí)間的低溫脅迫后才能顯著上調(diào)表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

植物特異性NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。由于NAC基因在植物中的重要作用，許多NAC轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在擬南芥、水稻、楊樹(shù)和甘蔗等模式植物和非模式植物中進(jìn)行了全基因組鑒定和功能表征。本研究通過(guò)全基因組分析，共鑒定了119個(gè)基因，并將其命名為001～119?；蚣易宄蓡T數(shù)量多于馬鈴薯(110個(gè))、擬南芥(105個(gè))、大豆(101個(gè))、木薯(96個(gè))、葡萄(79個(gè))和甘蔗(88個(gè))，少于水稻(151個(gè))和楊樹(shù)(163個(gè))，成員數(shù)量的大小差異可能是由于各物種進(jìn)化和分化過(guò)程中的全基因組多倍體事件造成的。

圖4 桃NAC家族基因的染色體定位Fig.4 Chromosomal localization of NAC family genes in peach

圖5 桃NAC家族基因的順式作用元件Fig.5 Cis-acting elements of NAC family genes in peach

PpNAC家族成員在基因長(zhǎng)度、蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)等方面存在較大差異，但基因結(jié)構(gòu)相對(duì)保守。根據(jù)家族成員聚類(lèi)關(guān)系，將所有的蛋白分為12個(gè)亞族。同一亞族的成員關(guān)系密切，具有相似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和位置，推測(cè)可能在桃的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中具有相似的功能，這與前人對(duì)白梨和亞洲梨的研究結(jié)果基本一致；但同一亞族成員之間也存在一定的差異，如外顯子的大小、相對(duì)位置和數(shù)量等，例如，第Ⅱ亞族中077的外顯子數(shù)量多于同一亞族中其余成員數(shù)量，并且同一亞族中094的外顯子數(shù)量明顯多于其他成員。這一結(jié)果可能是由于進(jìn)化過(guò)程中基因片段的剪接或插入，產(chǎn)生了新的基因功能所致。此外，同一亞族大多數(shù)成員的motif數(shù)量和排列順序基本相似，表明這些蛋白質(zhì)具有保守功能，這與NACs相關(guān)功能被很好的保存的結(jié)果相印證。由于擬南芥的NACs基因研究較深入，根據(jù)擬南芥NACs基因的同源性預(yù)測(cè)PpNACs的功能和進(jìn)化關(guān)系，所有的NAC蛋白被分為18個(gè)亞族(a-r)，并且聚類(lèi)在同一分支中的基因具有功能多樣性，例如，31、92和98屬于q亞族，它們不僅與植物衰老和頂端分生組織的形成有關(guān)，而且與器官的形成有關(guān)；值得注意的是，c、d和h亞族中沒(méi)有包含PpNAC成員，而b、e和m亞族中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何擬南芥的NAC成員，這表明NAC在各個(gè)物種中的進(jìn)化存在差異。氨基酸序列比對(duì)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，motif1+motif8、motif6、motif3+motif4、motif2+motif5和motif7分別代表NAC結(jié)構(gòu)域的子域A、B、C、D和E。大多數(shù)桃NAC蛋白同時(shí)包含motif1-motif8基序，驗(yàn)證了NAC蛋白的高度保守性，但也有幾個(gè)亞族的蛋白僅包含其中幾種motifs，表明該亞族的基因可能具有不同的功能，這與苦蕎中的研究結(jié)果一致。順式作用元件分析表明，這些序列主要包含9類(lèi)原件，占比較大的是光響應(yīng)原件、逆境響應(yīng)原件、低溫響應(yīng)原件和類(lèi)黃酮響應(yīng)原件，這些元件在桃生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)逆境脅迫過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。16個(gè)含低溫響應(yīng)與逆境應(yīng)答元件較多的基因在低溫脅迫下明顯上調(diào)，猜測(cè)其可能參與桃對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。

圖6 低溫脅迫下桃NAC基因的表達(dá)水平Fig.6 Expression levelof PpNAC genes in peach under low temperature stress

綜上，基因在桃對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，因此可能成為桃抗寒性相關(guān)的候選基因。