程雪 王秋水 楊玲 劉洋 謝添伊 沈海龍

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

水曲柳(FraxinusmandshuricaRupr.)是木犀科(Oleaceae)白蠟樹屬(Fraxinus)落葉喬木，為第三紀(jì)孑遺種，與胡桃楸(JuglansmandshuricaMaxim.)、黃菠蘿(PhellodendronamurenseRupr.)被稱為中國東北珍貴的“三大硬闊”樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值[1]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物體細(xì)胞在未經(jīng)性細(xì)胞融合的情況下，模擬有性的合子胚胎發(fā)生發(fā)育形成一個(gè)新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過程[2]，其具有繁殖速度快、數(shù)量多、再生頻率高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為目前最具有規(guī)?；敝碀摿Φ募夹g(shù)，同時(shí)也是植物轉(zhuǎn)基因的有效再生體系[3]。因此，掌握水曲柳體胚發(fā)生技術(shù)，深入研究其生化機(jī)理，對加速水曲柳規(guī)?；敝臣皩?shí)際生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。

過氧化氫(H2O2)是一種結(jié)構(gòu)簡單，易擴(kuò)散的小分子，為植物氧化代謝中的一部分，對植物生長發(fā)育具有雙重作用。過氧化氫(H2O2)一方面參與細(xì)胞的應(yīng)答過程和代謝途徑，另一方面積累過量會對植物細(xì)胞造成損傷[4]。針對水曲柳體胚發(fā)生已進(jìn)行了大量的研究，并對水曲柳體胚發(fā)生過程中的形態(tài)解剖、生理生化、分子機(jī)制等進(jìn)行了深入研究[5-9]，前期發(fā)現(xiàn)水曲柳體胚多數(shù)發(fā)生于褐化的外植體上，褐化現(xiàn)象與外植體細(xì)胞程序性死亡(PCD)存在密切的關(guān)系，且H2O2作為誘導(dǎo)因子參與了外植體細(xì)胞程序性死亡過程[8，10]，但H2O2對水曲柳體胚發(fā)生過程中的一些內(nèi)部生理影響尚不明確。本研究通過檢測體胚發(fā)生過程中不同時(shí)間段的抗氧化物質(zhì)(包括還原性抗壞血酸(ASA)和還原性谷胱甘肽(GSH))的質(zhì)量摩爾濃度、抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX))活性、H2O2質(zhì)量摩爾濃度、一氧化氮(NO)的質(zhì)量摩爾濃度等相關(guān)指標(biāo)，分析外源過氧化氫對水曲柳體胚發(fā)生過程中內(nèi)部生理的影響，并進(jìn)一步討論H2O2、ASA-GSH循環(huán)及NO三者之間的關(guān)系，以便為解析水曲柳子葉褐化生物學(xué)機(jī)理及體胚高頻發(fā)生提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源及處理

試驗(yàn)材料選自東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)特定的水曲柳母樹采集的成熟脫水種子。種子去翅流水沖泡3天后置于超凈工作臺內(nèi)對種子進(jìn)行表面滅菌處理：75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次，再用5%的次氯酸鈉浸泡15 min，無菌水沖洗5～6次后備用。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為培養(yǎng)基所有成分的1/2，附加成份包括：5 mg·L-1萘乙酸(NAA)、2 mg·L-16-芐基氨基嘌呤(6-BA)、400 mg·L-1酸水解酪蛋白(CH)、75 g·L-1蔗糖、6.5 g·L-1瓊脂，pH為5.8；在溫度121 ℃、壓力105 kPa對基本培養(yǎng)基高壓滅菌20 min；100 μmol·L-1H2O2用過濾滅菌器(0.22 μm孔徑)加入到滅菌后的培養(yǎng)基中，以不添加H2O2的培養(yǎng)基為對照，倒皿后待冷卻定型使用，培養(yǎng)條件為(24±2)℃暗培養(yǎng)，相對濕度為60%～70%。

1.3 生理指標(biāo)測定

在培養(yǎng)期間對5、7、14、21、28、35、42、49、56 d的外植體取樣并用液氮速凍，-80 ℃保存以備后續(xù)進(jìn)行生理生化分析。還原性抗壞血酸(ASA)、氧化性抗壞血酸(DHA)質(zhì)量摩爾濃度測定用的Fe3+還原法[11]；還原性谷胱甘肽(GSH)、氧化性谷胱甘肽(GSSG)質(zhì)量摩爾濃度按照參考文獻(xiàn)[12]的方法測定；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性按照參考文獻(xiàn)[13]的方法測定；過氧化氫(H2O2)質(zhì)量摩爾濃度、一氧化氮(NO)質(zhì)量摩爾濃度、一氧化氮合酶(NOS)活性、硝酸還原酶(NR)活性按照參考文獻(xiàn)[10]的方法測定；丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度硫代巴比妥酸法用測定[14]；超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性按照參考文獻(xiàn)[15]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，利用SPSS(v21.0，SPSS Inc)對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(對百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦平方根后再進(jìn)行方差分析)和相關(guān)性分析，使用Duncan法進(jìn)行多重比較，最后用Sigmaplot(v12.5，SYSTAT)軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)的影響

由表1可知，H2O2的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)ASA質(zhì)量摩爾濃度的積累(P<0.05)。對照組與H2O2添加組總抗壞血酸(T-ASA)的質(zhì)量摩爾濃度均呈現(xiàn)升-降-升-降-升-降的變化趨勢。其中，兩組均在42 d時(shí)達(dá)到峰值，質(zhì)量摩爾濃度分別為2.18、2.40 μmol·g-1，且H2O2添加組比對照組高9.7%；培養(yǎng)5 d時(shí)，二者T-ASA的質(zhì)量摩爾濃度最低，H2O2添加組低于對照組12.82%。對照組與H2O2添加組的ASA質(zhì)量摩爾濃度變化趨勢與T-ASA質(zhì)量摩爾濃度變化趨勢完全一致。

對照組的DHA質(zhì)量摩爾濃度變化呈升-降-升-降-升趨勢，而H2O2添加組的DHA質(zhì)量摩爾濃度變化趨勢則與對照組的DHA質(zhì)量摩爾濃度變化趨勢完全相反。其中，對照組的DHA質(zhì)量摩爾濃度在14 d時(shí)最高(0.47 μmol·g-1)，35 d時(shí)質(zhì)量摩爾濃度最低(0.04 μmol·g-1)，H2O2添加組的DHA質(zhì)量摩爾濃度在42 d時(shí)最高(0.49 μmol·g-1)，7 d時(shí)最低(0.16 μmol·g-1)。對照組的m(ASA)∶m(DHA)比值呈升-降-升-降-升的趨勢，而H2O2添加組的m(ASA)∶m(DHA)比值則呈現(xiàn)相反的趨勢。二者均在14 d到28 d時(shí)呈上升的趨勢，對照組急劇上升，而H2O2添加組為緩慢上升，在49 d后二者均呈現(xiàn)上升趨勢。

由表2可知，H2O2的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)GSH的水平變化(P<0.05)。對照組的T-GSH的質(zhì)量摩爾濃度呈降-升-降-升的變化趨勢，而H2O2添加組的T-GSH的質(zhì)量摩爾濃度呈完全相反的趨勢為升-降-升-降。兩組在7 d時(shí)，T-GSH的質(zhì)量摩爾濃度相差較大，H2O2添加組的T-GSH的質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照組217.15%。對照組和H2O2添加組的GSH的質(zhì)量摩爾濃度變化在5 d到21 d完全相反，而在21 d后二者的變化趨勢相同。前期在14 d時(shí)，二者GSH的質(zhì)量摩爾濃度相差較大，H2O2添加組的GSH質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照組222.60%，后期在49 d時(shí)，對照組的GSH的質(zhì)量摩爾濃度顯著高于H2O2添加組96.51%。對照組和H2O2添加組GSSG的質(zhì)量摩爾濃度在5 d到14 d期間呈現(xiàn)相反的變化趨勢，而在14 d后二者的變化趨勢相同均為降-升-降。其中，在7 d時(shí)，H2O2顯著提高了細(xì)胞內(nèi)GSSG的質(zhì)量摩爾濃度(0.29 μmol·g-1)，比對照組顯著提高了207.87%。對照組和H2O2添加組m(GSH)∶m(GSSG)的比值變化趨勢一致均為：降-升-降-升-降-升，且對照組的變化幅度大，H2O2添加組反之。對照組在5、49、56 d，m(GSH)∶m(GSSG)的比值高于H2O2添加組，其余均低于H2O2添加組。

表1 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)積累的影響

處 理ASA質(zhì)量摩爾濃度/μmol·g-15d7d14d21d28d35d42d49d56dCK(0.63±0.04)h(1.74±0.03b(0.94±0.01)g(1.55±0.03)d(1.64±0.01)c(1.23±0.04)f(1.87±0.04)a(1.48±0.03)e(0.93±0.01)g添加H2O2(0.41±0.04)h(1.87±0.04a(0.62±0.02)g(1.29±0.01)d(1.70±0.03)b(1.57±0.05)c(1.91±0.05)a(1.21±0.03)e(0.96±0.01)f

處 理DHA質(zhì)量摩爾濃度/μmol·g-15d7d14d21d28d35d42d49d56dCK(0.12±0.05)cd0.38±0.03)ab0.47±0.07)a0.17±0.03)c0.19±0.01)c0.04±0.01)d(0.32±0.10)b(0.31±0.06)b0.41±0.03)ab添加H2O2(0.24±0.03)cd0.16±0.03)e0.29±0.03)bc0.26±0.03)bcd0.18±0.03)e0.25±0.03)bcd(0.49±0.05)a(0.31±0.02)b(0.22±0.01)de

處 理m(ASA)∶m(DHA)5d7d14d21d28d35d42d49d56dCK(5.42±0.32)c(11.44±0.77)a(1.69±0.06)d(2.00±0.47)d(8.05±1.18)b(2.12±0.04)d(8.86±0.05)b(3.83±0.17)cd(5.03±0.11)c添加H2O2(5.86±0.15)a(5.59±0.12)a(3.92±0.18)b(4.73±0.11)ab(5.71±0.14)a(3.98±0.05)b(0.29±0.63)c(3.67±0.91)b(4.44±0.17)b

表2 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響

處 理GSH質(zhì)量摩爾濃度/μmol·g-15d7d14d21d28d35d42d49d56dCK(0.09±0.02)d(0.12±0.01)c(0.08±0.01)d(0.23±0.01)ab(0.20±0.01)b(0.06±0.01)e(0.25±0.01)ab(0.28±0.01)a(0.19±0.01)b添加H2O2(0.20±0.01)b(0.12±0.01)c(0.26±0.01)a(0.13±0.01)c(0.11±0.01)cd(0.10±0.01)d(0.12±0.01)cd(0.14±0.01)c(0.10±0.01)d

處 理GSSG質(zhì)量摩爾濃度/μmol·g-15d7d14d21d28d35d42d49d56dCK(0.19±0.01)e(0.09±0.01)g(0.28±0.01)c(0.20±0.01)d(0.07±0.01)h(0.30±0.01)b(0.33±0.01)a(0.23±0.01)d(0.15±0.01)f添加H2O2(0.18±0.01)cd(0.29±0.01)a(0.22±0.01)bc(0.12±0.01)de(0.11±0.01)f(0.24±0.01)cd(0.31±0.01)b(0.17±0.01)ef(0.17±0.01)f

處 理m(GSH)∶m(GSSG)5d7d14d21d28d35d42d49d56dCK(3.61±0.04)a(0.49±0.03)f(1.59±0.07)d(3.17±0.03)b(0.26±0.01)f(0.36±0.04)f(3.19±0.04)b(1.07±0.03)e(2.08±0.15)c添加H2O2(3.19±0.04)b(2.11±0.04)c(2.34±0.02)c(3.18±0.20)b(1.24±0.03)d(2.25±0.05)c(3.62±0.05)a(0.46±0.03)e(1.63±0.11)d

由表3可知，H2O2的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)APX活性(P<0.05)。在5 d到7 d和49 d到56 d，對照組和H2O2添加組的APX活性變化趨勢呈相反方向，其余變化趨勢均一致。在5 d時(shí)，兩組的APX活性相差較大，對照組的APX活性為0.88 U·g-1，H2O2添加組的APX活性為3.72 U·g-1，H2O2的添加顯著提高了細(xì)胞內(nèi)APX活性，且高于對照組322.48%，在56 d時(shí)，兩組的APX活性相近，H2O2添加組高于對照組3.03%。在28 d時(shí)，H2O2添加組的APX活性低于對照組18.83%，其余均高于對照組。

表3 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)APX活性的影響

2.2 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的影響

由表4可知，H2O2的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)H2O2質(zhì)量摩爾濃度(P<0.05)。對照組和H2O2添加組均呈先升高后降低的趨勢。對照組H2O2的質(zhì)量摩爾濃度在整個(gè)取材期均低于H2O2添加組，且兩組均在21 d時(shí)H2O2質(zhì)量摩爾濃度最高，分別為0.39、0.53 μmol·g-1，H2O2添加組的H2O2質(zhì)量摩爾濃度高于對照組35.25%。兩組在14 d時(shí)，H2O2質(zhì)量摩爾濃度相差較大，H2O2添加組的H2O2質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照組277.05%。

表4 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)H2O2質(zhì)量摩爾濃度的影響

由表5可知，H2O2的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度(P<0.05)。49到56 d，對照組和H2O2添加的MDA質(zhì)量摩爾濃度變化趨勢相反(對照組上升、H2O2添加組下降)，其余均呈現(xiàn)一致的變化趨勢(升-降)。其中，兩組在7 d細(xì)胞內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度均最高，分別為48.07、38.96 μmol·g-1，且對照組的MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著高于H2O2添加組23.40%。

表5 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

由表6可知，H2O2的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶(SOD、CAT)活性(P<0.05)。對照組和H2O2添加組的SOD活性呈一致的變化趨勢(升-降)。二者均在14 d達(dá)到高峰，SOD活性分別為1 229.79、1 070.83 U·g-1，且對照組的SOD活性高于H2O2添加組14.84%。兩組在5 d時(shí)，SOD活性最低，分別為171.57、172.28 U·g-1，H2O2添加組的SOD活性略高于對照組0.4%。

表6 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

由表7可知，H2O2的添加影響了外植體細(xì)胞內(nèi)CAT的活性。對照組和H2O2添加組的CAT活性呈一致的變化趨勢(升-降)。二者均在21 d達(dá)到峰值，CAT活性分別為947.3、897.8 U·g-1·min-1，CAT活性對照組的CAT活性高于H2O2添加組5.51%，除5、28、35 d，H2O2添加組CAT活性高于對照組，其余均低于對照組。

表7 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的影響

2.3 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)合成代謝的影響

由表8可知，H2O2的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)NO質(zhì)量摩爾濃度(P<0.05)。對照組和H2O2添加組NO質(zhì)量摩爾濃度總體呈現(xiàn)一致的變化趨勢(降-升-降-升)，但在14 d到21 d和49 d到56 d，兩組NO質(zhì)量摩爾濃度趨勢相反。且對照組在5 d達(dá)到高峰(3.64 μmol·g-1)，對照組的NO質(zhì)量摩爾濃度高于H2O2添加組29.13%，H2O2添加組在28 d達(dá)到高峰(3.82 μmol·g-1)，H2O2添加組高于對照組119.48%。

表8 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)NO質(zhì)量摩爾濃度的影響

由表9可知，H2O2的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)NO合成相關(guān)酶(NR、NOS)活性(P<0.05)。對照組的NR活性呈升-降-升-降-升趨勢，H2O2添加組對外植體細(xì)胞內(nèi)NR活性的影響趨勢呈升-降趨勢。除7、14 d，對照組的NR活性低于H2O2添加組，其余對照組的NR活性均高于H2O2添加組。對照組NR活性在56 d達(dá)到高峰(1.55 U·mg-1)，高于H2O2添加組的NR活性264.80%；H2O2添加組在14 d達(dá)到高峰(1.45 U·mg-1)，略高于對照組1.53%。

表9 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)NR活性的影響

由表10可知，對照組和H2O2添加組的NOS活性整體呈現(xiàn)一致的變化趨勢(升-降-升-降)，但除5～7 d、14～21 d和42～49 d期間兩組變化趨勢一致外，其余變化趨勢均相反。對照組的NOS活性在7 d達(dá)到峰值(0.64 U·mg-1)，比H2O2添加組顯著高于308.35%；H2O2添加組的NOS活性在35 d達(dá)到高峰(0.90 U·mg-1)，比對照組顯著高842.08%，且兩組在28～35 d期間NOS活性相差較大。

表10 外源H2O2對外植體細(xì)胞內(nèi)NOS活性的影響

2.4 生理指標(biāo)的相關(guān)性

由表11可知，T-ASA與ASA呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，m(ASA)∶m(DHA)與DHA呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，GSH與T-ASA呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，GSH與ASA呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，GSSG與T-GSH呈極顯著正相關(guān)性關(guān)系(P<0.01)，SOD與H2O2呈顯著正相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)，CAT與H2O2呈極顯著正相關(guān)性關(guān)系(P<0.01)，CAT與SOD呈顯著正相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)，NR與MDA呈顯著正相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)，NR與SOD呈顯著正相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)，NR與CAT呈顯著正相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)，其余均無顯著相關(guān)性。

表11 外源H2O2處理水曲柳外植體各生理指標(biāo)的相關(guān)性

續(xù)(表11)

3 結(jié)論與討論

活性氧(ROS)是一類具有化學(xué)活性的氧分子，包括單線態(tài)氧(1O2)、超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH)等[16]。研究發(fā)現(xiàn)GSH、ASA和H2O2三者具有緊密聯(lián)系，抗壞血酸過氧化物酶(APX)催化ASA清除H2O2，同時(shí)ASA氧化生成脫氫抗壞血酸(DHA)；脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)催化GSH還原DHA再生為ASA，伴隨著GSH氧化生成GSSG[17-18]。GSH和ASA是植物體內(nèi)兩種重要的非酶類抗氧化物質(zhì)，參與的ASA-GSH循環(huán)為清除活性氧自由基系統(tǒng)[19]。本研究中，外源加入H2O2時(shí)，總體來看，T-ASA、ASA、DHA、質(zhì)量摩爾濃度及m(ASA)∶m(DHA)均為前期低于對照組，中期高于對照組，后期又低于對照組的變化模式；T-GSH、GSH、GSSG質(zhì)量摩爾濃度及m(GSH)∶m(GSSG)前期高于對照組，其余均低于對照組。張琳等[20]研究外源H2O2作用下對ASA的影響發(fā)現(xiàn)，H2O2處理的ASA質(zhì)量摩爾濃度呈先降低后升高的變化趨勢，且始終保持在較低水平，GSH呈降-升-降的變化趨勢，這與本研究結(jié)果相似。但與劉忠靜等[21]研究發(fā)現(xiàn)的外源H2O2預(yù)處理使黃瓜葉片的ASA和GSH質(zhì)量摩爾濃度明顯增加的結(jié)果不一致，不同的植物使用相同外源物質(zhì)，但所用質(zhì)量摩爾濃度不同，其結(jié)果也不相同。同時(shí)相關(guān)性分析顯示，外源H2O2的添加使子葉內(nèi)部ASA、GSH呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此認(rèn)為水曲柳體胚發(fā)生中ASA、GSH具有緊密的聯(lián)系。外源H2O2的添加對水曲柳體胚發(fā)生過程中ASA質(zhì)量摩爾濃度的影響主要在于中期階段，而對GSH的影響在于前期，體胚發(fā)生過程中內(nèi)部的ASA、GSH具有緊密的聯(lián)系，但其機(jī)理還需試驗(yàn)進(jìn)一步去揭示。

植物細(xì)胞內(nèi)活性氧主要通過超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)清除，即酶促清除系統(tǒng)。SOD、CAT、APX活性及H2O2質(zhì)量摩爾濃度對保持植物細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡具有重要作用[22]。本試驗(yàn)表明，外源H2O2的添加明顯提高了APX、SOD酶的活性，但并未對CAT活性有明顯的提高。這與陳貴華等[23]發(fā)現(xiàn)外源H2O2提高了鹽脅迫下苦菜幼苗細(xì)胞SOD、APX酶的活性結(jié)果一致，但與其CAT酶活性結(jié)果不一致。表明同一外源添加物處理不同的植物材料，其結(jié)果不具有完全相似性。但這與劉建新等[24]發(fā)現(xiàn)的150 μmol·L-1H2O2處理提高了SOD、APX活性，降低了CAT活性結(jié)果具有完全相似性。同時(shí)相關(guān)性分析顯示，外源H2O2的添加使子葉外植體內(nèi)部SOD、CAT呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證明了酶促之間的相互作用。

100 μmol·L-1H2O2處理不但影響了水曲柳體胚發(fā)生過程中的抗氧化物質(zhì)量摩爾濃度、抗氧化物酶活性，而且還影響其膜脂質(zhì)過氧化和NO。質(zhì)膜相對透性的大小是膜傷害的重要標(biāo)志，MDA質(zhì)量摩爾濃度作為膜脂過氧化的重要指標(biāo)，其積累是活性氧毒害作用的表現(xiàn)，MDA質(zhì)量摩爾濃度越高，則損傷越大[25]。NO是生物體內(nèi)普遍存在的活性分子，參與調(diào)節(jié)多個(gè)生理進(jìn)程，且低濃度的NO可誘導(dǎo)抗氧化酶基因的表達(dá)以清除活性氧，保護(hù)植物免受氧化脅迫傷害[26-27]。本試驗(yàn)顯示，外源H2O2處理顯著提高了細(xì)胞的H2O2質(zhì)量摩爾濃度，降低了細(xì)胞內(nèi)的MDA質(zhì)量摩爾濃度。這與劉建新等[24，28]的H2O2處理均不同程度降低了燕麥葉片及幼苗H2O2和丙二醛質(zhì)量摩爾濃度結(jié)果不完全一致。但與劉建新等[29]發(fā)現(xiàn)5 mmol·L-1的外源H2O2處理顯著增加了葉中H2O2質(zhì)量摩爾濃度結(jié)果一致。表明外源H2O2的添加降低了對水曲柳子葉細(xì)胞膜的傷害，但增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度?；钚匝醯脑黾硬⑽磦Φ阶尤~細(xì)胞膜，活性氧對水曲柳子葉的作用機(jī)理需進(jìn)一步研究。同時(shí)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源H2O2前期降低了NO質(zhì)量摩爾濃度，后期NO質(zhì)量摩爾濃度均高于對照組；NR活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；NOS活性與NR活性完全相反，前期低于對照組，中后期顯著高于對照組。且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)NO、NOS、NR三者之間無相關(guān)性，H2O2的添加前期降低NO、NOS活性，后期對其起促進(jìn)作用，而對NR的作用與NO、NOS完全相反。

綜上所述，外源H2O2對水曲柳體胚發(fā)生過程中不同時(shí)間段的抗氧化物質(zhì)、抗氧化酶及膜脂過氧化等生理指標(biāo)均產(chǎn)生一定影響，且一些指標(biāo)彼此具有相關(guān)性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)體胚發(fā)生過程中內(nèi)部的ASA、GSH具有緊密的聯(lián)系。因此，在未來的研究中，需進(jìn)一步研究ASA、GSH與體胚發(fā)生的作用機(jī)理。