固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定武漢市普通人群血清中35種有機氯農(nóng)藥與多氯聯(lián)苯

李 想, 王麗梅, 宋璐璐, 萬政策, 寇 婧, 張明燁, 呂永曼, 王友潔, 梅素容*

(1. 華中科技大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學研究所, 教育部環(huán)境與健康重點實驗室, 湖北 武漢 430030; 2. 華中科技大學公共衛(wèi)生學院兒少衛(wèi)生與婦幼保健系, 湖北 武漢 430030; 3. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院健康管理中心, 湖北 武漢 430030)

有機氯農(nóng)藥(organochlorine pesticides, OCPs)和多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署簽署的“斯德哥爾摩公約”中兩類主要的持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs),具有高毒性、持久性、生物蓄積性和遠距離遷移性[1]。我國于20世紀70～80年代陸續(xù)禁產(chǎn)禁用OCPs和PCBs,但OCPs和PCBs仍可以在自然水體、土壤、食品及大氣中廣泛檢出[2-5]。環(huán)境介質(zhì)及食品中OCPs、PCBs的普遍污染導致人群的高暴露風險,對人類造成潛在的健康危害,如內(nèi)分泌干擾效應、神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性和致癌效應等[6-9]。因此,人體內(nèi)OCPs與PCBs暴露水平與健康風險的評估至關重要。

建立靈敏快速的人體內(nèi)OCPs和PCBs的檢測方法可為環(huán)境暴露與健康風險評估提供技術支持。高脂溶性的OCPs和PCBs易蓄積于人體的脂肪組織,但在實際研究中,脂肪組織不易獲取[10]。在平衡狀態(tài)下,血液中POPs的濃度可以代表蓄積在脂肪組織中的POPs濃度[11,12];且血液獲取方便快捷,易獲得不同年齡層的樣本,因此血液被廣泛用作評價OCPs、PCBs在人體內(nèi)暴露水平的生物監(jiān)測樣本[13-15]。人體血液成分復雜,生物體內(nèi)殘留的OCPs、PCBs多處于痕量甚至超痕量水平,高效的前處理方法既可以實現(xiàn)對目標物的高效富集,又可以降低或去除基質(zhì)的干擾[16]。相較于傳統(tǒng)的液液萃取技術(liquid-liquid extraction, LLE),固相萃取技術(solid phase extraction, SPE)溶劑使用量少,樣品富集與凈化可以同時完成,使得檢測靈敏度大幅提高[17]。OCPs和PCBs的儀器分析方法包括氣相色譜-電子捕獲檢測法(GC-ECD)、氣相色譜-質(zhì)譜檢測法(GC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法(GC-MS/MS)等,其中GC-MS/MS可高效分離多種組分,特異性強、靈敏度高,適用于血液中痕量OCPs和PCBs的精準定量分析[18-20]。

目前,國內(nèi)外已有許多人體內(nèi)OCPs和PCBs殘留的檢測研究,屈偉月[21]建立的LLE串聯(lián)硅膠柱-GC-MS/MS檢測血清中12種OCPs和43種PCBs的分析方法回收率良好(79%～84%),檢測組分多,但前處理操作復雜,樣本用量大,且OCPs與PCBs不能同時檢測;Stubleski等[22]建立的96孔板固相萃取-GC-MS/MS檢測血中5種OCPs和16種PCBs的分析方法樣本用量少,檢出限在2.2～167.0 ng/L之間,但回收率不甚理想(31%～63%)。

基于此,本研究建立了一種快速簡便、樣本用量少、回收率和精密度良好的SPE-GC-MS/MS同時檢測人血清中35種OCPs和PCBs的分析方法,并應用于武漢市普通人群體內(nèi)OCPs和PCBs的濃度分布特征研究,為進一步開展人群健康效應研究提供技術支撐和基礎數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Trace 1300氣相色譜-TSQ 8000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司);氮吹儀(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);固相萃取儀(美國Agilent公司);隔膜真空泵(美國GAST公司)。

Oasis?HLB固相萃取柱(1 mL/30 mg,美國Waters公司),胎牛血清(美國Thermo Fisher公司),尿素(分析純,中國國藥集團),二氯甲烷(農(nóng)殘級,美國J. T. Baker公司),甲醇(色譜純,德國默克集團),正己烷(農(nóng)殘級,美國Sigma-Aldrich公司),純凈水(杭州娃哈哈集團)。

17種OCPs混合標準溶液(含α-六六六(α-HCH)、β-六六六(β-HCH)、γ-六六六(γ-HCH)、δ-六六六(δ-HCH)、p,p′-滴滴伊(p,p′-DDE)、p,p′-滴滴滴(p,p′-DDD)、p,p′-滴滴涕(p,p′-DDT)、艾氏劑(aldrin)、狄氏劑(diedrin)、異狄氏劑(endrin)、異狄氏劑醛(endrin aldehyde)、α-氯丹(α-chlordane)、γ-氯丹(γ-chlordane)、硫丹Ⅱ(endosulfan Ⅱ)、硫丹硫酸鹽(endosulfan sulfate)、環(huán)氧七氯(heptachlor epoxide)、甲氧滴滴涕(methoxychlor))和18種PCBs混合標準溶液(含PCB-28、PCB-52、PCB-77、PCB-81、PCB-101、PCB-105、PCB-114、PCB-118、PCB-123、PCB-126、PCB-138、PCB-153、PCB-156、PCB-157、PCB-167、PCB-169、PCB-180、PCB-189)均購自美國AccuStandard公司。4種OCPs同位素內(nèi)標13C6-γ-HCH、13C12-p,p′-DDE、13C12-p,p′-DDD、13C12-p,p′-DDT和18種13C12-PCBs同位素內(nèi)標均購自美國CIL公司。

1.2 標準溶液的配制

混合標準貯備液:用正己烷稀釋17種OCPs和18種PCBs混合標準溶液,配制成1 μg/mL的35種OCPs和PCBs混合標準貯備液,于-20 ℃保存。

標準工作溶液:準確量取一定量混合標準貯備液,用正己烷稀釋,配制成50、20、10、5、2、1、0.50、0.20、0.10 ng/mL的系列標準溶液。

1.3 樣品前處理

每份血清樣本取100 μL,加入10 μL質(zhì)量濃度為100 ng/mL的同位素內(nèi)標溶液,渦旋混勻后置于4 ℃過夜;取出樣本,用100 μL純凈水稀釋,加入100 mg尿素,渦旋混勻,超聲25 min;依次用3 mL二氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL純凈水活化平衡Oasis?HLB小柱;將樣品全部過柱,并用1 mL純凈水潤洗樣品管兩次,將液體全部導入HLB小柱,流速0.5～1 mL/min;用6 mL純凈水淋洗HLB小柱,真空抽干45 min;用5 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液(1∶1, v/v)洗脫,收集全部洗脫液。洗脫液氮吹近干,用正己烷定容至100 μL,進樣測定。

1.4 分析條件

色譜條件:DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國Agilent公司);以高純氦氣(99.999%)作為載氣,柱流量1.0 mL/min,恒流模式;不分流進樣模式,進樣量1 μL;進樣口溫度250 ℃。色譜柱升溫程序:初始溫度60 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至180 ℃,保持1 min,以3 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:三重四極桿質(zhì)譜儀,配備電子轟擊離子源,電離電壓70 eV;離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃;定量分析采用多反應監(jiān)測(MRM)模式,內(nèi)標法定量。

1.5 血清樣本采集

2018～2019年在武漢市同濟醫(yī)院體檢中心采集武漢市普通人群血清樣本共4 132份,依據(jù)采樣時間(2018年秋季、2019年春季)、年齡(10個年齡組:≤30歲;31～35歲;36～40歲;41～45歲;46～50歲;51～55歲;56～60歲;61～65歲;66～70歲;>70歲)和性別將血清樣本混合為40個樣本池。本研究得到華中科技大學同濟醫(yī)學院倫理委員會批準,招募志愿者均簽署知情同意書。

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

按1.4節(jié)分析條件建立全掃描方法,根據(jù)化合物信息確定母離子后運行子離子掃描,選擇豐度最高的兩對離子對作為目標化合物的定量離子對和定性離子對,并確定每對離子對的最佳碰撞能量。優(yōu)化后各目標物和內(nèi)標的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表 1 35種目標物與22種內(nèi)標的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.2 方法學評價

2.2.1線性范圍、方法檢出限與定量限

按1.3節(jié)前處理流程處理空白胎牛血清之后,向其中加入不同濃度的混合標準溶液,配制質(zhì)量濃度為0.01～50.0 ng/mL的基質(zhì)匹配標準溶液,采用上述分析條件,以內(nèi)標法進行定量分析,目標物標準曲線的線性范圍、相關系數(shù)(r2)及方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)見表2。35種OCPs和PCBs在0.05～50.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好,相關系數(shù)在0.989～0.999之間;以3倍信噪比相對應的濃度作為方法的檢出限,以10倍信噪比確定方法的定量限,35種OCPs和PCBs的檢出限在1.2～71.4 ng/L之間,定量限在4.1～238.1 ng/L之間。

2.2.2方法的準確度與精密度

采用胎牛血清進行加標回收率試驗,分別向胎牛血清中添加不同濃度的混合標準溶液,每一組濃度做6個平行樣,計算加標回收率和相對標準偏差(RSD)。在檢測樣本的同時檢測空白胎牛血清和超純水基質(zhì),監(jiān)測儀器性能是否穩(wěn)定并控制實驗過程中可能存在的污染情況。35種OCPs和PCBs的加標回收率在72.6%～142%之間,RSD小于25%(見表3)。

表 3 35種分析物在胎牛血清中3個水平下的加標回收率和精密度(n=6)

2.3 方法學比較

血清樣本珍貴,不易獲取,其他文獻報道的檢測方法的樣本使用量一般不少于500 μL[23-26],本研究檢測血清用量只需要100 μL。Wittsiepe等[27]和Stubleski等[22]的方法樣本使用量少,分別為200 μL和150 μL,但檢測的OCPs組分少,加標回收率不甚理想(見表4),本研究檢測組分多,檢出限低,準確度與精密度高。同時,本方法操作簡便,經(jīng)過固相萃取就能有效去除雜質(zhì)和富集痕量待測組分,簡化了繁瑣的前處理步驟,在大樣本人群監(jiān)測中能節(jié)約大量人力物力。

2.4 武漢市普通人群體內(nèi)OCPs和PCBs的濃度分布特征研究

采用所建立的方法檢測血清樣本池中35種OCPs和PCBs濃度,從表5的結果發(fā)現(xiàn):①武漢市普通人群血清中OCPs和PCBs的污染普遍存在,且以OCPs為主,其濃度水平依次為:p,p′-滴滴伊>β-六六六>γ-六六六>p,p′-滴滴涕>狄氏劑,其中p,p′-滴滴伊、p,p′-滴滴滴和甲氧滴滴涕檢出率達100%; ②本研究武漢市普通人群中OCPs的濃度水平與北京市普通人群暴露水平一致,低于江蘇普通人群OCPs暴露水平[28,29]。p,p′-滴滴伊/p,p′-滴滴涕比值通常作為p,p′-滴滴涕歷史累積的指標,該比值小于10表明p,p′-滴滴伊主要來源于滴滴涕的近期暴露,比值大于10表明p,p′-滴滴伊來源于滴滴涕的歷史暴露[30],本研究中p,p′-滴滴伊/p,p′-滴滴涕比值為58,推斷武漢市普通人群血清中p,p′-滴滴伊的蓄積可能主要來自于滴滴涕的歷史殘留; ③從PCBs同系物組成來看,武漢市普通人群血清中主要以PCB-28、PCB-153和PCB-52為主,非類二噁英PCBs是主要成分,與國內(nèi)其他人群體內(nèi)PCBs的組成特征基本一致[31]。

2.5 血清中OCPs和PCBs濃度水平與年齡、性別的關系

血清中OCPs濃度隨年齡增加呈升高趨勢(見圖1a), 66歲以上人群血清中OCPs濃度顯著高于66歲以下人群(p<0.05),與我國萊州灣地區(qū)、吉林伊通等地人群血清樣本池中OCPs濃度變化趨勢一致,這可能是由于隨著時間推移,經(jīng)由各種途徑暴露的OCPs在人體中出現(xiàn)累積效應,提示年齡是影響人體OCPs負荷水平的重要因素[32,33]。46～55歲以及61～65歲人群血清中PCBs濃度水平略高于其他年齡組,但無顯著性差異(見圖1b),與Meng等[34]的研究結果一致,這可能是因為雖然我國從20世紀80年代開始禁止生產(chǎn)使用PCBs,但工業(yè)焚燒和廢舊電器的泄漏使得我國居民處于PCBs的持續(xù)暴露中[35,36]。

表 5 血清樣本中OCPs和PCBs的質(zhì)量濃度(n=40)

圖 1 不同年齡、性別血清樣本池中OCPs和PCBs的濃度分布(n=40)Fig. 1 Concentration distributions of OCPs and PCBs in pooled serum by age and gender (n=40)

60歲以下女性血清中OCPs濃度水平和相同年齡段男性血清中OCPs濃度水平無顯著性差異,而60歲以上女性血清中OCPs濃度水平較高,是相同年齡段男性血清中OCPs濃度的2～3倍(p<0.05,見圖1a),與Thomas等[37]、Porta等[38]的研究結果基本一致,這可能與男女飲食習慣的差異有關。與男性相比,女性偏向于攝入更多的蔬菜水果,而蔬菜水果中往往含有較高的OCPs殘留[39]。男性和女性血清中PCBs濃度水平無統(tǒng)計學差異(見圖1b),與Zheng等[40]、Du等[41]的研究結果一致。不同季節(jié)(2018年秋季、2019年春季)收集的血清樣本池OCPs和PCBs濃度水平也無統(tǒng)計學差異,可能是因為春秋兩季人群膳食模式和食物來源無明顯變化。

3 結論

本研究建立了固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術同時檢測人血清中35種OCPs和PCBs的方法,該方法檢出限低、回收率及精密度良好,且樣本用量少,操作簡便,檢測組分多,適用于環(huán)境健康研究中大樣本人群的生物監(jiān)測,為OCPs和PCBs的人體內(nèi)暴露水平與健康風險評估提供技術支持。利用建立的方法檢測了武漢市普通人群血清樣本中OCPs和PCBs的濃度水平,武漢市普通人群廣泛暴露于OCPs和PCBs,且以OCPs為主,非類二噁英PCBs是PCBs的主要成分。血清中OCPs濃度隨年齡增長呈升高趨勢,OCPs濃度在60歲以上存在性別差異,不同性別血清中PCBs濃度無統(tǒng)計學差異。