江雨潔　張湘卓　陳悅　張書萌　于子璇　劉佳　陳伶利　李杰

〔摘要〕 目的 探討早發(fā)冠心病（premature coronary heart disease， PCHD）血瘀證DNA羥甲基化相關差異基因表達，以期尋找PCHD血瘀證診斷和治療的新靶點。方法 病例來自湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院PCHD患者，分為PCHD血瘀證組（A組）和PCHD非血瘀證組（B組），各6例，采用DNA羥甲基化免疫共沉淀芯片技術分析兩組的相關羥甲基化差異基因表達情況，并對其進行聚類分析、KEGG通路富集分析及GO功能富集分析。結果 A組與B組相比，高CpG密度啟動子差異羥甲基化基因數(shù)目343個，低CpG密度啟動子差異羥甲基化基因數(shù)目144個，通路富集分析得出PCHD血瘀證羥甲基化差異基因主要與細胞周期、心肌能量代謝、炎癥、內(nèi)皮損傷有關，GO功能富集分析得出PCHD血瘀證生物學功能多與細胞發(fā)育和分化、蛋白酶活性、細胞內(nèi)結構等有關。A組的CDKN1B、HDAC2、MDM2羥甲基化表達程度均較高。結論 PCHD血瘀證差異基因羥甲基化表達程度較高，這些差異基因主要與轉錄調(diào)控心肌細胞周期有關，可能影響心肌細胞周期阻滯、凋亡、衰老等，導致疾病的發(fā)生發(fā)展，為PCHD血瘀證診斷和治療提供一定的參考。

〔關鍵詞〕 早發(fā)冠心病;血瘀證;DNA羥甲基化;差異基因;表觀遺傳學

〔中圖分類號〕R25? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.022

Study on the DNA hydroxymethylation related difference genes in premature coronary heart

disease with blood stasis syndrome

JIANG Yujie， ZHANG Xiangzhuo， CHEN Yue， ZHANG Shumeng， YU Zixuan， LIU Jia， CHEN Lingli*， LI Jie*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the differential expression of DNA hydroxylmethylation related genes in premature coronary heart disease （PCHD） with blood stasis syndrome， in order to find a new target for diagnosis and treatment of PCHD with blood stasis syndrome. Methods The patients were from PCHD patients in The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine. They were divided into PCHD with blood stasis syndrome group （group A） and PCHD with non-blood stasis syndrome group （group B）， with 6 patients in each group. DNA hydroxymethylated immunoprecipitation chip technique was used to analyze the differential gene expression of related hydroxymethylation between the two groups. Cluster analysis， KEGG pathway enrichment analysis and GO function enrichment analysis were performed. Results Compared with group B， group A had 343 differential hydroxymethylation genes with high CpG density promoter and 144 differential hydroxymethylation genes with low CpG density promoter. Pathway enrichment analysis showed that the differential genes of hydroxymethylation in PCHD with blood stasis syndrome were mainly related to cell cycle， myocardial energy metabolism， inflammation and endothelial injury. Go function enrichment analysis showed that the biological functions of PCHD with blood stasis syndrome were mostly related to cell development and differentiation， protease activity， intracellular structure and so on. The degree of hydroxymethylation of CDKN1B， HDAC2， MDM2 in group A was higher than that in group B. Conclusion The expression degree of hydroxymethylation of differential genes in PCHD with blood stasis syndrome is higher. These differential genes are mainly related to transcriptional regulation of myocardial cell cycle， which may affect cardiomyocyte cycle arrest， apoptosis， senescence and so on， leading to the occurrence and development of the disease， which provides a reference for the diagnosis and treatment of PCHD with blood stasis syndrome.

〔Keywords〕 premature coronary heart disease; blood stasis syndrome; DNA hydroxymethylation; differential gene; epigenetics

冠心病（coronary heart disease， CHD）已成為全球重大公共衛(wèi)生問題之一[1]，其發(fā)病及病理機制尚未闡述清楚，但已知CHD是一種典型的多因素復雜疾病，由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而引起[2-3]，而表觀遺傳機制很好地體現(xiàn)了環(huán)境和基因的交互作用[4]。DNA羥甲基化修飾是表觀遺傳學中重要修飾形式之一，參與了多種疾病的病理生理改變，目前在心血管領域日益成為研究的熱點[5-6]。早發(fā)冠心病（premature coronary heart disease， PCHD）是指冠心病發(fā)病年齡男性<55歲和女性<65歲的冠心病[7]，已有文獻報道PCHD與脂質(zhì)代謝基因密切相關[8]，本課題組前期研究表明PCHD血瘀證與CCNA2、ARF6、PSD2基因啟動子羥甲基化水平密切相關[9-10]，CHD中醫(yī)病名為胸痹，血瘀證是胸痹最常見的證型之一[11]，進一步深入研究羥甲基化修飾PCHD血瘀證相關差異基因有利于該疾病的防治。本研究以PCHD血瘀證及非血瘀證患者為研究對象，應用DNA羥甲基化免疫共沉淀芯片技術分析PCHD血瘀證相關差異基因表達，探討疾病與基因之間的關系，以期尋找PCHD血瘀證診斷和治療的新靶點。

1 資料與方法

1.1? 診斷標準

（1）PCHD診斷標準[7]：CHD發(fā)病年齡男<55歲，女<65歲。（2）CHD診斷標準[12]：冠脈造影提示至少有1支冠狀動脈直徑狹窄≥50%。（3）中醫(yī)辨證標準：血瘀證辨證標準參照《中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標準·中醫(yī)病癥診斷療效標準》[13]。心胸陣痛，如刺如絞，固定不移，入夜為甚，伴有胸悶心悸，面色晦暗;舌質(zhì)紫暗，或有瘀斑，舌下絡脈青紫，脈沉澀或結代為心血瘀阻證。（4）CHD血瘀證評分標準：血瘀證評分參照中國中西醫(yī)結合學會活血化瘀專業(yè)委員會制定的《冠心病血瘀證診斷標準》[14]。①主要指標：胸痛位置固定，舌質(zhì)色紫暗，舌有瘀斑瘀點，冠脈造影顯示至少一支冠狀動脈狹窄≥75%，超聲或造影顯示有冠狀動脈血栓或心腔內(nèi)附壁血栓;②次要指標：胸痛夜間加重，口唇或齒齦紫暗，舌下靜脈曲張或色紫暗，冠脈造影顯示至少一支冠狀動脈狹窄≥50%且<75%，部分凝血活酶時間（acivated partial thromboplastin time， APTT）或凝血酶原時間（prothrombin time， PT）縮短;③輔助指標：面色黧黑，脈澀，冠脈非創(chuàng)傷性血管成像技術或冠脈造影顯示血管明顯鈣化或彌漫病變，纖維蛋白原升高。診斷須包含主要指標、次要指標中至少1項宏觀指標，CHD血瘀證計分≥19分可診斷為血瘀證，計分高低可用于評價CHD血瘀證的程度，不符合血瘀證標準即為非血瘀證。

1.2? 納入標準

（1）符合上述PCHD患者年齡、CHD診斷標準和中醫(yī)辨證分型標準;（2）參與研究者知情同意。

1.3? 排除標準

CHD患者兼有以下各種疾病者：（1）甲狀腺功能亢進性心肌病、糖尿性心肌病、肺源性心肌病、高血壓性心肌病、風濕性心肌病、貧血性心肌病;（2）惡性腫瘤、甲狀腺疾病、嚴重肝腎疾病、血液系統(tǒng)疾病、結締組織疾病、傳染病;（3）精神系統(tǒng)疾病;（4）受檢者依從性差，或不能完成全部臨床檢測，資料不全者。

1.4? 一般資料

所有的樣本來自2019年10月13日至2020年1月10日湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科患者，并通過湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理審批委員會的審批，根據(jù)納排標準從中選取PCHD血瘀證組（A組）和PCHD非血瘀證組（B組），各6例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

1.5? 標本采集

每例受試者空腹8 h，留取肘靜脈血10 mL，用EDTA二鈉抗凝，室溫靜置2 min，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6? DNA羥甲基化免疫共沉淀芯片分析

使用DNeasy血液組織試劑盒提取全血中基因組DNA，然后用NanoDrop 1000超微量分光光度計對DNA進行定量，再通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的完整性和質(zhì)量。DNA質(zhì)檢合格后，參照芯片標準流程進行樣本的標記、芯片雜交及清洗。首先，本研究選用的芯片為Arraystar Human 4x180K RefSeq Promoter Microarray，是一款在RefSeq基因啟動子區(qū)域內(nèi)檢測表觀遺傳修飾和轉錄因子結合位點的芯片，芯片以210 bp的間隙用大約180 000根探針覆蓋了23 148個基因啟動子區(qū)域。然后，用Cy5-9mer、Cy3-9mer引物對樣本進行標記，標記好的DNA純化后再進行芯片雜交，芯片洗滌后使用Agilent微陣列掃描儀對芯片進行掃描，該過程均由上?？党缮镉邢薰就瓿?。

1.7? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。計量資料以“x±s”表示，符合正態(tài)分布、方差齊者，采用t檢驗，反之則用秩和檢驗;計數(shù)資料用“%”表示，采用卡方檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.8? 生物信息學分析

1.8.1? 羥甲基化富集峰分析? 使用Nimblescan v2.5提供的滑動窗口（1500 bp）峰值算法從標準化的log2-ratio數(shù)據(jù)開始查找分析MeDIP芯片數(shù)據(jù)。并確定這些探針的log2-ration值分布是否符合正態(tài)性，然后通過Kolmogorov-Smirnov檢測得到的-log10 p-value值，均來自特定探針滑動窗口。若發(fā)現(xiàn)相鄰探針的-log10 p-value值明顯高于設定的閾值，那么這幾個探針區(qū)域就是一個富集峰（enrichment peak， EP）。EP必須是至少大于兩個探針最小p-value的閾值。

1.8.2? 羥甲基化差異富集峰分析? 當進行兩組樣品比較來篩選差異富集峰（differential enrichment peak， DEP）即差異羥甲基化區(qū)域時，使用每組探針的log2-ratio的均值來計算探針的M'值。M'=PCHD血瘀證組的Average（log2 MeDIPE/Input）-PCHD非血瘀證組的Average（log2 MeDIPC/Input），然后基于M'值再次運行NimbleScan的peak-finding程序來搜索羥甲基化peaks。當兩組中至少有一組的median（log2 MeDIP/Input）≥0.3且median（M'）>0并在兩組中任意一個peak對應的探針至少有一半變異系數(shù)≤0.8即篩選為差異羥甲基化區(qū)域。啟動子在轉錄起始位點的上游0.7 kb至下游0.2 kb有一個500 bp的區(qū)間，該區(qū)間的（G+C）-fraction≥0.55，并且CpG的觀測/期望比≥0.6，則為高CpG密度啟動子，說明羥甲基化程度高。啟動子不包含CpG的觀測/期望比≥0.4的500 bp長的區(qū)域，則為低CpG密度啟動子，說明羥甲基化程度低。通過聚類分析直觀展示DEP探針在樣本中的DNA羥甲基化情況，然后對差異基因進行通路富集分析和基因本體（gene ontology， GO）富集分析，以探討羥甲基化差異基因主要影響的通路和生物學功能。

2 結果

2.1? 啟動子羥甲基化差異基因數(shù)目

A組與B組相比，高CpG密度啟動子差異羥甲基化基因數(shù)目343個，低CpG密度啟動子差異羥甲基化基因數(shù)目144個?？梢奝CHD血瘀證與非血瘀證相比差異基因羥甲基化修飾程度較高。

2.2? 差異羥甲基化DEP聚類分析

對DEP的結果做聚類分析，聚類圖以直觀的展示DEP的探針在各個樣本中的DNA羥甲基化情況，B組羥甲基化程度低于A組，見圖1。

2.3? 羥甲基化差異基因通路分析

使用KEGG數(shù)據(jù)庫分析兩組羥甲基化差異基因所在顯著性（P<0.05）富集通路，主要與癌癥轉錄失調(diào)、長壽調(diào)節(jié)途徑、甲狀腺激素信號通路、半乳糖代謝、擴張型心肌病、黏多糖生物合成、內(nèi)吞作用等通路相關，見表2。

2.4? 羥甲基化差異基因GO富集分析

根據(jù)芯片檢測結果，對羥甲基化差異基因進行GO功能分析。GO數(shù)據(jù)庫總共有三大類，分別是生物學過程（biological process， BP）、細胞組分（cellular component， CC）和分子功能（molecular function， MF），各自描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能，所處的細胞環(huán)境，以及參與的生物學過程。A組與B組相比，羥甲基化差異基因BP差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），主要與細胞通訊調(diào)節(jié)、信號轉導調(diào)節(jié)、信號調(diào)節(jié)、細胞增殖的負調(diào)控、細胞死亡、細胞對過氧化氫的反應、神經(jīng)元發(fā)育、枝晶發(fā)育、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的負調(diào)控、蛋白酪氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)等相關;CC差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），主要與細胞頂端、頂端質(zhì)膜、轉錄延伸因子復合物、質(zhì)膜區(qū)、細胞內(nèi)膜結合細胞器、細胞外、細胞器膜、細胞內(nèi)、細胞內(nèi)細胞器、膜結合細胞器等相關;MF差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），主要與蛋白質(zhì)復合物支架、腎上腺素能受體結合、肽酶激活劑活性、肽酶激活劑活性參與細胞凋亡過程、離子型谷氨酸受體結合、蛋白質(zhì)結合、蛋白質(zhì)自締合、酶結合、氧化還原酶活性等相關。見圖2-4。

2.5? 啟動子羥甲基化差異基因篩選

根據(jù)通路富集分析、GO功能分析，結合P值、M'值的中位值等指標，篩選CDKN1B、HDAC2、MDM2 3個差異基因，見圖5、表3。

3 討論

中醫(yī)學認為，CHD與外邪侵襲、七情內(nèi)傷、膏粱厚味、年老久病等因素相關。該病病機復雜，總屬本虛標實，心脈痹阻。胸痹與血瘀證息息相關，中醫(yī)古籍對此有大量的記載，如《素問·脈要精微論》“夫脈者，血之府也……澀則心痛”，指出瘀血阻滯、心脈不通，可導致心痛?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》曰：“厥氣上逆，寒氣積于胸中而不瀉，不瀉則濕氣去，寒獨留，則血凝泣，凝則脈不通”，指出寒凝血瘀，凝滯心脈?！吨夂髠浼狈健吩唬骸靶乇灾?，令人心中堅辟急痛，絞急如刺，不得仰俯，或血脈瘀阻”，可見血瘀證為CHD發(fā)生發(fā)展的主要病因。 DNA羥甲基化是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一種DNA修飾方法，在生物學上的重要性及其作為表觀遺傳標記的作用近年來才得到重視。在染色體10/11易位（ten-eleven translocation， TET）家族蛋白酶催化下，DNA CpG島的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine， 5mC）氧化成5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine， 5hmC）這一過程稱為DNA羥甲基化[15]。越來越多的證據(jù)表明，作為TET家族成員的5hmC及其TET2酶在動脈粥樣硬化中起著重要作用，不僅參與血管平滑肌細胞表型的調(diào)節(jié)，而且與內(nèi)皮功能障礙和炎癥免疫反應密切相關[16-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者與對照組基因體中5hmC的富集有顯著差異，用5hmC標記可以很好地將冠心病患者與對照組個體區(qū)分，循環(huán)游離DNA中的5hmC標記對心肌梗死的預測潛力優(yōu)于心肌肌鈣蛋白和肌紅蛋白[20]。DNA基因體或啟動子區(qū)等部位發(fā)生羥甲基化修飾后能促進基因的表達，直接影響基因組的結構和功能，從而調(diào)節(jié)細胞發(fā)育和干細胞的多能性，而它的異常改變是許多疾病發(fā)生基礎[21]。故而本研究以PCHD血瘀證患者為研究對象，利用DNA羥甲基化免疫共沉淀芯片技術分析其差異基因的表達，以探討其發(fā)病及病理機制。結果顯示，共有487個羥甲基化差異基因與PCHD血瘀證相關，其中，高CpG密度啟動子差異羥甲基化基因數(shù)目343個，低CpG密度啟動子差異羥甲基化基因數(shù)目144個。

通路富集分析得出PCHD血瘀證與細胞周期、心肌能量代謝、炎癥、內(nèi)皮損傷關系密切。內(nèi)吞作用是細胞從細胞表面除去配體、營養(yǎng)物質(zhì)、質(zhì)膜蛋白和脂質(zhì)，并將其帶入細胞內(nèi)部的一種機制。有研究表明，心肌梗死后心臟內(nèi)蛋白復合體2被磷酸化，提示缺氧條件可能觸發(fā)網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用，網(wǎng)格蛋白介導的心肌細胞內(nèi)吞將循環(huán)miRNA轉運到細胞中起關鍵作用，從而發(fā)揮抗心肌細胞凋亡作用[22]。亦有研究表明，小窩蛋白（caveolin）參與低密度脂蛋白內(nèi)吞作用，介導動脈粥樣硬化[23]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)吞作用富集顯著且位于該通路的小窩蛋白呈高羥甲基化狀態(tài)可能通過參與內(nèi)吞作用介導心肌細胞周期及內(nèi)皮損傷有關。長壽調(diào)節(jié)通路是介導衰老的重要通路，衰老是分子、細胞和器官損傷累積的復雜過程，可導致功能喪失，增加疾病與死亡的易感性。研究發(fā)現(xiàn)，與衰老相關的遺傳基因與冠心病風險關系密切[24]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，長壽調(diào)節(jié)途徑中的富集顯著且位于該通路的HDAC2呈高羥甲基化狀態(tài)，可能與該通路參與調(diào)節(jié)衰老有關。GO功能富集分析得出，PCHD血瘀證生物學功能多與細胞發(fā)育和分化、蛋白酶活性、細胞內(nèi)結構等有關。

細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑1B（cyclin depe？鄄

ndent kinase inhibitor 1B， CDKN1B），別名KIP1、MEN4、CDKN4、MEN1B、P27，該基因編碼的蛋白與細胞周期素E-CDK2或細胞周期素D-CDK4復合物結合并阻止其激活，從而控制細胞周期在G1期的進程[25]。心肌細胞周期的改變可導致諸多心血管疾病，故而通過調(diào)節(jié)CDKN1B的表達可能會成為治療心血管疾病的關鍵介質(zhì)[26]。研究發(fā)現(xiàn)，CDKN1B的過度表達能選擇性抑制巨噬細胞的增殖，從而阻止動脈粥樣硬化的進展[27]。本研究CDKN1B在PCHD血瘀證中呈高羥甲基化狀態(tài)，故推測CDKN1B可能導致細胞凋亡或自噬缺陷，控制G1細胞周期進程，從而影響PCHD血瘀證進程。

組蛋白脫乙酰酶2 （histone deacetylase 2， HDAC2），負責核心組蛋白N端賴氨酸殘基的脫乙?；谵D錄調(diào)控、細胞周期進程和發(fā)育事件中起著重要作用[28]。越來越多的證據(jù)表明，該基因調(diào)控心肌肥厚、纖維化、凋亡和能量代謝等過程，是內(nèi)皮依賴性血管舒張和動脈粥樣硬化的關鍵調(diào)節(jié)因子，抑制HDAC2被認為是抗纖維化、抗肥厚的有效方法[29-31]。Zhang 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，TET2通過HDACs介導IL-6的活性抑制，從而在炎癥消退過程中清除組蛋白乙?；?，表明在炎癥消退過程中，HDAC2是組蛋白去乙?；閷У囊种艻L-6的關鍵酶。本研究中發(fā)現(xiàn)該基因呈高羥甲基化水平，可能與其轉錄調(diào)控心肌細胞周期和介導炎癥有關。

MDM2癌基因（murine double minute 2， MDM2），別名ACTFS、HDMX、HDM2，該基因編碼核定位的E3泛素連接酶，編碼的蛋白可通過靶向腫瘤抑制蛋白以促進蛋白酶體降解來促進腫瘤形成。目前，關于MDM2羥甲基化在PCHD血瘀證方面的研究尚未報道，相關報道主要集中在癌癥方面，Ye等[33]研究發(fā)現(xiàn)，MDM2在肝細胞癌中呈低羥甲基化水平，細胞周期通路富集顯著。該基因受腫瘤蛋白p53（tumor protein p53， TP53）轉錄調(diào)控，調(diào)節(jié)靶基因的表達，誘導細胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA修復或代謝改變[34]。TP53為平滑肌細胞進入增殖期的負性生長調(diào)節(jié)劑，影響心臟結構、收縮力、線粒體生物發(fā)生、糖酵解和氧化磷酸化能力，是心臟轉錄組的主要調(diào)節(jié)因子[35-36]，并通過調(diào)控MDM2的表達影響心肌細胞凋亡、衰老等方面在心血管疾病中發(fā)揮重要作用[37-38]。同時，CDKN1B、HDAC2均與TP53相關，CDKN1B表達受TP53密切調(diào)控，并介導TP53依賴的G1細胞周期在多種應激刺激下的阻滯，HDAC2為TP53的共激活劑，參與DNA損傷后的早期分子事件[39]。其關系如圖5所示，提示這3個差異基因在PCHD血瘀證中呈高羥甲基化水平與調(diào)控心肌細胞周期密切相關。

綜上所述，CDKN1B、HDAC2、MDM2可能直接或間接轉錄調(diào)控心肌細胞周期，在PCHD血瘀證中均呈高羥甲基化水平，可能影響心肌細胞周期阻滯、凋亡、衰老等，導致疾病的發(fā)生發(fā)展。但其具體的作用機制仍需深入探索，因此，后續(xù)將進一步通過RT-PCR驗證本研究篩選出的差異基因，同時也會擴大樣本量及實驗組別獲取更多的實驗數(shù)據(jù)，提高實驗的科學性、精確性、嚴謹性，進一步利用中醫(yī)藥多靶點、多途徑的干預以達到精準治療的目的。

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