王 崢，黃慧英，徐慶妍*，李 健*

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361102)

近年來，隨著核磁共振(NMR)技術(shù)的迅速發(fā)展，基于NMR分析的代謝組學(xué)研究逐漸成為一項(xiàng)不可或缺的研究?jī)?nèi)容，在藥物研發(fā)和醫(yī)療領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[1-5].如何準(zhǔn)確、定量判斷樣品中各種物質(zhì)的含量從而完成對(duì)藥效的評(píng)價(jià)、毒性的研究和疾病的診斷，是定量NMR(qNMR)技術(shù)在代謝組學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷等應(yīng)用中的重要研究?jī)?nèi)容之一[6].qNMR作為代謝組學(xué)的重要檢測(cè)分析手段之一，具有顯著的優(yōu)勢(shì)：首先，該技術(shù)對(duì)樣品是非破壞性的，無需對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行分離或衍生化，樣品處理簡(jiǎn)單；其次，它可同時(shí)全面分析檢測(cè)代謝產(chǎn)物的組成和實(shí)時(shí)變化，并可通過對(duì)內(nèi)源性小分子代謝物的定量分析來識(shí)別代謝標(biāo)志物，為生物體的病理或生理狀態(tài)判定提供信息.

qNMR主要通過質(zhì)子峰面積和質(zhì)子數(shù)量的比值來實(shí)現(xiàn)定量，常用定量方法包括相對(duì)定量和絕對(duì)定量[7].相對(duì)定量中代謝物的變化不會(huì)被獨(dú)立評(píng)估，而是與其他代謝物相關(guān)，因而無法與其他體系進(jìn)行對(duì)比[8-9]；而絕對(duì)定量中通常使用內(nèi)標(biāo)法，即使用已知結(jié)構(gòu)和濃度的化合物作為內(nèi)標(biāo)物，與待測(cè)樣品混合測(cè)定并通過對(duì)比定量峰的面積來實(shí)現(xiàn)定量[10].內(nèi)標(biāo)在NMR譜圖中有著穩(wěn)定的峰高和峰形[6]，將其直接添加到樣品中可以形成可靠的內(nèi)部參考標(biāo)準(zhǔn)，因而長(zhǎng)期用于qNMR代謝組學(xué)[10].

在代謝組學(xué)和臨床研究中，血液樣品為最常見的體液樣品，但血液中含有大量的蛋白，qNMR中常用的水溶性內(nèi)標(biāo)常因?yàn)榕c蛋白結(jié)合而導(dǎo)致定量誤差.例如，qNMR代謝組學(xué)常用的內(nèi)標(biāo)3-(三甲基硅基)-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉鹽(TSP-D4)、4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸(DSS)和4，4-二甲基-4-硅戊烷-三氟乙酸胺(DSA)，常因?yàn)榕c血液中蛋白結(jié)合而導(dǎo)致NMR譜圖中特征峰的變形和化學(xué)位移的變化，從而造成qNMR測(cè)定的不準(zhǔn)確性[11-13]；此外，由于TSP-D4和DSS是弱酸，它們的結(jié)構(gòu)和化學(xué)位移也容易受到測(cè)試樣品pH變化的影響[14]，為濃度的定量檢測(cè)帶來不確定性.甲酸和馬來酸也常被用作qNMR測(cè)定的內(nèi)標(biāo)，盡管二者不與蛋白結(jié)合[11,13,15]，但它們卻是天然存在的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物(如甲酸代謝和糖酵解的產(chǎn)物)，容易為qNMR的測(cè)定帶來不確定性.因此，內(nèi)標(biāo)物的選擇對(duì)qNMR測(cè)定的準(zhǔn)確性十分重要.

為了解決以上qNMR代謝組學(xué)分析中存在的問題，迫切需要尋找新的內(nèi)標(biāo)物.理想的內(nèi)標(biāo)需要滿足以下要求：1)與蛋白沒有相互作用；2)在NMR譜圖中特征峰的化學(xué)位移與血液樣品中的內(nèi)源性代謝物有明顯區(qū)別，便于通過特征峰的峰面積測(cè)定實(shí)現(xiàn)血液樣品的定量檢測(cè)分析.本研究通過對(duì)一系列芳香族化合物的分析發(fā)現(xiàn)：對(duì)苯二甲酸二鈉(圖1)在脂肪區(qū)沒有氫原子，芳環(huán)區(qū)的4個(gè)氫原子出峰位置相同，其信號(hào)峰為一個(gè)尖銳的單峰，易于準(zhǔn)確計(jì)算積分面積且遠(yuǎn)離大多數(shù)內(nèi)源性代謝物的信號(hào)峰；同時(shí)該內(nèi)標(biāo)不易揮發(fā)，性質(zhì)穩(wěn)定，也不是代謝途徑中的天然內(nèi)源性代謝產(chǎn)物.因此，對(duì)苯二甲酸二鈉有望成為qNMR代謝組學(xué)分析中新的內(nèi)標(biāo)物.

圖1 對(duì)苯二甲酸二鈉結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker AVANCE Ⅲ 600 MHz超導(dǎo)NMR波譜儀(Bruker),BBO正相觀察寬帶探頭(Bruker),BVT 3200數(shù)字控溫儀(Bruker),臺(tái)式酸度計(jì)(Mettler Toledo)，氘代水(Sigma-Aldrich，氘代度>99.8%)，對(duì)苯二甲酸二鈉(安耐吉化學(xué)，分析純，99%)，對(duì)苯二甲酸(安耐吉化學(xué)，分析純，99%)，對(duì)苯二酚(安耐吉化學(xué)，分析純，99%)，對(duì)苯醌(安耐吉化學(xué)，分析純，98%)，草酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，99%)，離心管(Eppendorf)，SPF級(jí)BALB/c小鼠(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，腸癌患者血液樣品(由廈門中山醫(yī)院和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供).

1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取對(duì)苯二甲酸二鈉(內(nèi)標(biāo))適量，用氘代水配制成濃度為10 mmol/L的內(nèi)標(biāo)溶液，pH=7.4.同時(shí)在pH酸度計(jì)的指示下，用NaOH飽和溶液調(diào)節(jié)對(duì)苯二甲酸二鈉氘水溶液為pH=9.0的測(cè)試溶液，用對(duì)苯二甲酸飽和溶液調(diào)節(jié)對(duì)苯二甲酸二鈉氘水溶液為pH=6.0的測(cè)試溶液.

精密稱取對(duì)苯二甲酸、對(duì)苯二酚和對(duì)苯醌適量，分別用氘代水配制成10 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.3 NMR測(cè)試的樣品制備

1.3.1 血液樣品的制備

對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血，讓血液滴入事先滅菌的1.5 mL離心管中，得到全血；取小鼠全血，用0.1 mol/L草酸鈉作為抗凝劑，抗凝劑與血液按體積比1∶9混合進(jìn)行抗凝處理后，冰上放置30 min，3 000 r/min離心10 min，得到血漿；取小鼠全血于冰上放置1 h，3 000 r/min離心10 min，得到血清.

取腸癌患者的血液樣品并保存于常規(guī)生化采血管(檸檬酸鈉抗凝)后用干冰低溫運(yùn)輸，測(cè)試前將采血管中血液樣品混勻.

分別取100 μL小鼠全血、血漿、血清及腸癌患者的全血樣品，加入550 μL氘代水，3 000 r/min離心2 min 后，得到血液樣品待測(cè)液；取590 μL該血液樣品待測(cè)液，加入1.2節(jié)所述內(nèi)標(biāo)溶液至總體積為600 μL，混合均勻后置于5 mm核磁管中待測(cè).

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備

分別取1.2節(jié)所述內(nèi)標(biāo)溶液、測(cè)試溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液600 μL，置于5 mm核磁管中待測(cè).

1.4 樣品的qNMR測(cè)試

測(cè)試條件：實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃,氘代試劑為D2O.所有血液樣品均采用CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)脈沖序列采集信息，參數(shù)如下：譜寬(SWH)為12 335.50 Hz，采樣時(shí)間(AQ)為1.63 s，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)(TD)為40 212，掃描次數(shù)(NS)為96次，延遲時(shí)間(D1)為2 s，回波時(shí)間(2nτ)為144 ms.所有標(biāo)準(zhǔn)樣品的氘水溶液采用NOESY(Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)脈沖序列采集信息，參數(shù)如下：SWH為10 000 Hz，AQ為1.63 s，TD為32 768，NS為40次，D1為2 s，混合時(shí)間(D8)為120 ms.

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，設(shè)置儀器參數(shù)、溫度控制、調(diào)諧、勻場(chǎng)、采樣，得到1H-NMR譜圖.對(duì)譜圖進(jìn)行相位調(diào)整并調(diào)平基線，選擇對(duì)苯二甲酸二鈉(內(nèi)標(biāo))和乳酸的峰作為定量參考峰，并對(duì)其進(jìn)行積分.乳酸雙峰的左側(cè)譜峰化學(xué)位移為1.33.根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典2015年版 四部》附錄的內(nèi)標(biāo)定量法[16]，按以下公式計(jì)算乳酸的絕對(duì)含量：

cl=(Al×Vi×Ni×ci)/(Ai×Vl×Nl),

其中，Nl為被測(cè)樣定量峰包含的質(zhì)子數(shù)，Ni為內(nèi)標(biāo)定量峰包含的質(zhì)子數(shù)，Al為被測(cè)樣定量峰的積分面積，Ai為內(nèi)標(biāo)定量峰的積分面積，cl為被測(cè)樣濃度(mmol/L)，ci為內(nèi)標(biāo)濃度(mmol/L)，Vi為加入的內(nèi)標(biāo)體積(μL)，Vl為加入的被測(cè)樣體積(μL).

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標(biāo)化合物的篩選

針對(duì)目前常用內(nèi)標(biāo)物易與蛋白發(fā)生作用,或其本身為天然內(nèi)源性代謝產(chǎn)物等影響qNMR代謝組學(xué)血液樣品分析準(zhǔn)確性的問題，分析顯示大部分小分子內(nèi)源性代謝物信號(hào)峰集中在δ0～6.00，如果從芳香類化合物中選取合適的分子作為內(nèi)標(biāo)物將有可能解決上述問題.首先選用對(duì)苯二酚、對(duì)苯醌、對(duì)苯二甲酸作為內(nèi)標(biāo)物分子，采用CPMG序列研究其在qNMR檢測(cè)中的應(yīng)用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明：這些化合物在小鼠全血樣品中的NMR信號(hào)峰都為相對(duì)獨(dú)立、尖銳的單峰，在δ6.60～8.00，明顯區(qū)別于血液樣品中內(nèi)源性小分子代謝物的信號(hào)峰δ0～6.00，具備作為內(nèi)標(biāo)物的基本條件.

圖2 小鼠全血樣品中對(duì)苯二酚、對(duì)苯二甲酸和對(duì)苯醌的1H-NMR譜圖

除了對(duì)內(nèi)標(biāo)物特征峰的獨(dú)立化學(xué)位移的要求，對(duì)于血液樣品檢測(cè)還要求內(nèi)標(biāo)物具有低毒性和水溶性，以避免破壞血液樣品中的物質(zhì)影響制樣穩(wěn)定性和結(jié)果可重復(fù)性.已有研究表明對(duì)苯二酚和對(duì)苯醌的毒性較大[17-18]，不適合于血液樣品的檢測(cè)，且對(duì)苯二酚在暴露于空氣中時(shí)非常容易發(fā)生氧化而導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)變化.對(duì)苯二甲酸的毒性和穩(wěn)定性均能夠滿足要求，但該類化合物的水溶性差[19].在應(yīng)用中為了保證內(nèi)標(biāo)物的量，需使用較大體積的內(nèi)標(biāo)液，內(nèi)標(biāo)物溶解度差不僅不利于保證批間制樣的穩(wěn)定性，而且為達(dá)到相同的內(nèi)標(biāo)濃度會(huì)使血液樣品的濃度降低并影響NMR譜圖的信噪比.因此,考慮使用對(duì)苯二甲酸鹽來改善內(nèi)標(biāo)的水溶性問題.鈉離子是血液中最多的陽離子，在維持正常滲透壓和調(diào)節(jié)酸堿平衡上有著重要的意義，因此本研究考察了以對(duì)苯二甲酸二鈉為血液樣品qNMR內(nèi)標(biāo)的情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)苯二甲酸二鈉既可以保留對(duì)苯二甲酸低毒和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，又能夠很好地解決水溶性差的問題.人體血液的正常pH范圍為7.3～7.4，對(duì)苯二甲酸二鈉的氘水溶液pH為7.4.分別在pH 6.0，7.4和9.0條件下考察內(nèi)標(biāo)對(duì)酸堿環(huán)境的敏感性，采用NOESY序列進(jìn)行研究，結(jié)果表明：在上述pH條件下其化學(xué)位移均不發(fā)生改變，為7.88，可見對(duì)pH的變化極不敏感(圖3).因此，確定對(duì)苯二甲酸二鈉作為優(yōu)選的qNMR代謝組學(xué)內(nèi)標(biāo).

圖3 對(duì)苯二甲酸二鈉在不同pH的氘水溶液中的1H-NMR譜圖

2.2 對(duì)苯二甲酸二鈉內(nèi)標(biāo)與蛋白結(jié)合情況的評(píng)價(jià)

通常內(nèi)標(biāo)物與蛋白的結(jié)合程度可以從二者混合后內(nèi)標(biāo)特征峰的半峰寬和峰面積兩方面進(jìn)行評(píng)價(jià).半峰寬變寬的程度越小,峰面積減少的程度越低，說明內(nèi)標(biāo)與蛋白的結(jié)合程度越小，也就表明該物質(zhì)越適合作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量分析[20].由于β-葡萄糖較α-葡萄糖的耦合常數(shù)更大，譜峰裂分更清晰，所以用β-葡萄糖δ4.64處譜峰作為半峰寬參考[21].乳酸雖然與蛋白相結(jié)合，但其游離與結(jié)合的量之比為常數(shù)[22]，且在δ4.14 處的譜峰不存在和脂類譜峰重疊的干擾，因此以乳酸δ4.14處譜峰作為峰面積的參考.用半峰寬比(內(nèi)標(biāo)/β-葡萄糖)和峰面積比(內(nèi)標(biāo)/乳酸)來評(píng)價(jià)蛋白結(jié)合程度，詳細(xì)考察對(duì)苯二甲酸二鈉內(nèi)標(biāo)與蛋白的結(jié)合情況.將苯二甲酸二鈉作為內(nèi)標(biāo)分別加入同一只小鼠的全血、血漿和血清中(n=3)，使用CPMG序列采集獲得相應(yīng)待測(cè)血液樣品的1H-NMR譜圖(圖4).參照文獻(xiàn)[18]報(bào)道的方法，計(jì)算對(duì)苯二甲酸二鈉在小鼠全血、血漿和血清中的半峰寬比和峰面積比.

圖4 對(duì)苯二甲酸二鈉在小鼠全血、血漿和血清中的1H-NMR譜圖

從圖4可以看出：對(duì)苯二甲酸二鈉在小鼠全血、血漿和血清中的化學(xué)位移均為7.88，化學(xué)位移的改變，說明該內(nèi)標(biāo)沒有與待測(cè)血液樣品中的物質(zhì)發(fā)生作用；同時(shí)該內(nèi)標(biāo)在小鼠全血、血漿和血清中的半峰寬比和峰面積比表現(xiàn)較為一致，說明該內(nèi)標(biāo)不與血液樣品中的蛋白相結(jié)合.如表1所示，與已知內(nèi)標(biāo)(DSA、TSP、二甲基亞砜、三噁烷、馬來酸、甲酸鈉)在小鼠血漿中蛋白結(jié)合參數(shù)[20,23-25]相比，對(duì)苯二甲酸二鈉的半峰寬比和峰面積比最小，可見該內(nèi)標(biāo)與蛋白的結(jié)合程度最弱.這些結(jié)果進(jìn)一步表明對(duì)苯二甲酸二鈉可作為qNMR檢測(cè)血液樣品中代謝物的優(yōu)選內(nèi)標(biāo).

表1 內(nèi)標(biāo)與蛋白結(jié)合程度的結(jié)果

2.3 以乳酸為代表的代謝物定量表征

以對(duì)苯二甲酸二鈉作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)小鼠血液中的乳酸濃度進(jìn)行定量分析.取同一只小鼠的全血、血漿和血清樣品(n=3)進(jìn)行測(cè)試，當(dāng)將對(duì)苯二甲酸二鈉的化學(xué)位移為7.88時(shí)，乳酸的化學(xué)位移為4.14，根據(jù)1.4節(jié)所述公式計(jì)算乳酸濃度(表2).

表2 小鼠全血、血漿、血清中乳酸濃度

從表2可以看出，小鼠全血、血漿、血清中乳酸濃度(1.92～3.56 mmol/L)與文獻(xiàn)[26-27]報(bào)道的正常小鼠的乳酸濃度(1.0～5.6 mmol/L)結(jié)果相吻合，均在正常生理范圍內(nèi).該結(jié)果驗(yàn)證了對(duì)苯二甲酸二鈉內(nèi)標(biāo)應(yīng)用于血液樣品中代謝物定量分析的可行性.

2.4 對(duì)苯二甲酸二鈉內(nèi)標(biāo)在腸癌患者全血樣品分析中的應(yīng)用

乳酸是癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中重要的檢測(cè)指標(biāo).2018年Simona Corso研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)：癌細(xì)胞在治療過程中處于抗癌藥物的環(huán)境下，新陳代謝會(huì)發(fā)生改變，引起糖酵解從而導(dǎo)致乳酸增加；增加的乳酸會(huì)進(jìn)一步刺激癌細(xì)胞周圍間質(zhì)細(xì)胞使其分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)靶標(biāo)藥物的抗藥性；在疾病的動(dòng)物模型中也證實(shí)，采用藥物抑制癌細(xì)胞分泌乳酸可以削弱癌細(xì)胞的抗藥性[28].另有研究提出，循環(huán)乳酸在腫瘤組織中提供了主要的代謝燃料并促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)[29].因此，對(duì)乳酸的定量檢測(cè)可能成為對(duì)癌癥的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)的有效手段.

以對(duì)苯二甲酸二鈉為內(nèi)標(biāo)，對(duì)20例腸癌患者的全血樣品進(jìn)行qNMR檢測(cè)，并按照1.4節(jié)所述方法計(jì)算乳酸濃度，結(jié)果如表3所示.在所有樣品中，對(duì)苯二甲酸二鈉均表現(xiàn)出穩(wěn)定性好、溶解性好、出峰簡(jiǎn)單、不干擾待測(cè)樣品等性質(zhì)，所測(cè)結(jié)果穩(wěn)定.

表3 腸癌患者全血樣品中乳酸濃度

在正常生理?xiàng)l件下，靜息狀態(tài)時(shí)人體血液的乳酸濃度為1～2 mmol/L，而在劇烈運(yùn)動(dòng)下乳酸濃度可達(dá)20 mmol/L[30].已有研究表明，癌癥患者血液中的乳酸水平與腫瘤的發(fā)生程度有著緊密的聯(lián)系[31-32].從表3可以看出，腸癌患者血液中的乳酸濃度為6.98～38.40 mmol/L，根據(jù)臨床信息得知該組腸癌患者在住院期間處于靜息狀態(tài)，而其血液中的乳酸濃度明顯高于正常人體靜息狀態(tài)下的值，提示基于乳酸濃度測(cè)定的血液qNMR代謝組學(xué)檢測(cè)有望作為腸癌疾病發(fā)展監(jiān)測(cè)的重要手段.

3 結(jié) 論

本研究從分析內(nèi)標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)出發(fā)，系統(tǒng)考察了對(duì)苯二酚、對(duì)苯醌、對(duì)苯二甲酸以及對(duì)苯二甲酸二鈉作為qNMR檢測(cè)分析內(nèi)標(biāo)物的可行性.結(jié)果表明對(duì)苯二甲酸二鈉不與血液樣品中的蛋白發(fā)生作用，與內(nèi)源代謝物能有效區(qū)分并且較為穩(wěn)定，有效解決了常用內(nèi)標(biāo)在qNMR代謝組學(xué)分析中易與蛋白結(jié)合、與內(nèi)源性代謝物譜峰重疊等問題，可用作理想的內(nèi)標(biāo)物.將此基于對(duì)苯二甲酸二鈉的qNMR代謝組學(xué)分析方法應(yīng)用于乳酸濃度的定量測(cè)定，結(jié)果初步揭示了腸癌病人的血液樣品中乳酸濃度與疾病臨床進(jìn)展階段的相關(guān)性.綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一種qNMR代謝組學(xué)的理想內(nèi)標(biāo)對(duì)苯二甲酸二鈉，建立了qNMR代謝組學(xué)在血液中的分析方法.該方法有望用于與疾病進(jìn)展相關(guān)的代謝物鑒定和監(jiān)測(cè)，為疾病的臨床輔助診斷和監(jiān)測(cè)提供一種方便、快捷的分析手段.