進口對蝦急性肝胰腺壞死病病原分離鑒定及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)檢測方法的建立

黃燕瓊，鄧艷，門星怡，陳婉霞，柏建山

（廣州白云機場海關(guān)國家水產(chǎn)品檢測重點實驗室，廣東廣州 510470）

對蝦急性肝胰腺壞死病（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND）是由一種攜帶著編碼毒力蛋白pVA1質(zhì)粒的特殊副溶血性弧菌引起的對蝦病害。2009年以來，急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）先后在中國、越南、馬來西亞、泰國爆發(fā)，2013年蔓延到西半球的墨西哥。該病發(fā)病快、死亡率高、流行面廣，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成極大的損失。2013年全球養(yǎng)殖對蝦產(chǎn)量較2012年減少近四分之一，其中泰國下降約50%，馬來西亞對蝦產(chǎn)量從2010年的7.0×104t下降至2011年的4.0×104t，我國自1.5×106t下降到1.3×106t，下降約17%[1]，且該病在接下來的時間仍將嚴重影響著我國對蝦產(chǎn)量，給我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展帶來威脅。因此，對AHPND病原的研究引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，仍將是今后的研究焦點和熱點，針對該病的快速檢測方法也在不斷的研究和完善中。鑒于該病的危害嚴重，目前世界動物衛(wèi)生組織（OIE）已將其列入水生動物疫病法定報告目錄。

2014年，我國對蝦養(yǎng)殖成功率仍然很低，發(fā)病率超過60%。為了滿足國內(nèi)市場的需求，我國開始大量進口對蝦，從對蝦出口大國變?yōu)檫M口國，嚴重影響了我國對蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2]。目前，從廣州口岸進境的對蝦主要是來自越南、泰國、馬來西亞三個國家，數(shù)量從2016年的1072.08 t增長到2018年的1990.83 t，金額從2016年的1404.85萬美元增長到2018年的2596.99萬美元。其中越南的對蝦進口量占總進口量的70%多，而這幾個國家的養(yǎng)殖對蝦也是急性肝胰腺壞死病爆發(fā)嚴重的國家。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)，利用4條特異性引物識別靶基因的6個區(qū)域，并加入兩條環(huán)引物加速反應(yīng)，利用一種具有鏈置換功能的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件（60～65 ℃）反應(yīng)40～60 min，即可完成反應(yīng)。LAMP的結(jié)果判斷方法很多，可以選擇熒光法，在反應(yīng)體系中加入熒光染料，用熒光檢測系統(tǒng)實時監(jiān)控，不用開蓋，可以防止氣溶膠的污染，適合實驗室檢測；也可以選擇染色法，擴增后在反應(yīng)液中加入熒光染料，混勻后看是否有顏色變化，適合實地檢測。本研究對2017～2018兩年間白云機場口岸進境的453批次對蝦樣品進行AHPND病原的分離和鑒定并進行結(jié)果分析，建立快速檢測AHPND病原的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）方法，并對其特異性、靈敏性、穩(wěn)定性進行驗證，該病原的分離鑒定結(jié)果分析為進口對蝦的檢測提供了參考數(shù)據(jù)，快速檢測方法的建立為各實驗室和基層養(yǎng)殖企業(yè)提供一種更加快速和容易操作的方法選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

白云機場口岸進境的對蝦樣品分別來自越南、泰國、馬來西亞三個國家，本研究在2017～2018年兩年間從這三個國家進境的對蝦樣品中共抽取453批次進行AHPND病原分離鑒定。每批次重2 kg，采2 g肝胰腺組織。

1.1.2 主要儀器和試劑

3K15冷凍離心機，德國Sima公司；C1000梯度PCR儀、電泳儀，美國Bio-rad公司；ABI QuantStudio7Flex實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；Multiskan GO全波長讀數(shù)儀，美國Thermo公司。

引物由北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成；甜菜堿（Betaine）和MgSO4，購自美國Sigma公司；Bst DNA polymerase large fragment、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、SYBR Green I熒光染料，購自New England Biolabs公司；DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、18-T載體克隆試劑盒、DH5α菌株、質(zhì)粒提取試劑盒、Taq酶、Mg2+、dNTPs和PCR10×Buffer反應(yīng)液，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 AHPND病原分離鑒定和感染分析

1.2.1 AHPND病原富集增菌培養(yǎng)

肝胰腺組織勻漿后按照核酸抽提試劑盒的操作要求提取基因組DNA，后進行PCR擴增。剩下的組織勻漿液按1:10的比例放入3% APW（氯化鈉堿性蛋白胨水）培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，離心棄上清，再進行核酸抽提和PCR擴增。

1.2.2 AHPND病原特定基因的PCR擴增

PCR擴增使用OIE《水生動物疾病診斷手冊第2.2.1章》中推薦的引物AP3，檢測AHPND致病相關(guān)的基因pVA1。引物序列為：AP3-F：5’-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3’ ；AR3-R：5’-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3’[3]。反應(yīng)體系（25 μL）為：2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+free），0.7 μL 50 mmol/L MgCl2，0.4 μL 10 mmol/L dNTP Mix，0.5 μL 10 μmol/L AP3上游引物，0.5 μL 10 μmol/L AP3下游引物，1.25 U Taq酶，DNA模板2 μL，DEPC水補至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；4 ℃保溫。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄結(jié)果。AHPND致病相關(guān)的基因pVA1的目的片段為333 bp，在333 bp處有明顯條帶的判定為AHPND病原可疑。

1.2.3 AHPND病原菌株分離

將可疑的肝胰腺組織培養(yǎng)液用無菌接種環(huán)蘸取后于TCBS（硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖）瓊脂平板上劃線分離，劃5～10個平板，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～18 h。挑取符合典型副溶血弧菌的可疑菌落，分別接種到5 mL 3% APW培養(yǎng)基的試管中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～18 h，后用細菌DNA提取試劑盒提取菌液基因組DNA，再進行PCR擴增（反應(yīng)體系和條件如1.2.2）。

1.2.4 AHPND病原菌株鑒定

擴增產(chǎn)物為可疑AHPND陽性的則進行生化鑒定（按照GB 4789.7-2013進行），確定是否符合副溶血性弧菌生化反應(yīng)結(jié)果。同時將菌液PCR產(chǎn)物送測序，經(jīng)BLAST比對后，確定該分離的菌株是否為攜帶致病基因pVA1的特殊副溶血性弧菌。

1.2.5 AHPND病原分離鑒定結(jié)果分析

對453批次的進境對蝦感染AHPND病原的分離鑒定結(jié)果進行分析，確定越南、泰國、馬來西亞三個國家進境對蝦感染AHPND病原的陽性檢出率情況。

1.3 AHPND-LAMP引物的設(shè)計合成，構(gòu)建反應(yīng)體系和優(yōu)化反應(yīng)條件

1.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)文獻報道，以急性肝胰腺壞死病病原質(zhì)粒pVA1的AP2基因作為靶基因，采用引物設(shè)計軟件Primer Explorer 4.0設(shè)計包括環(huán)引物在內(nèi)的6條LAMP引物，利用BLAST工具對引物序列進行特異性比對，并利用DNAMAN和Oligo 7.0軟件對引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯配等情況進行分析。引物由北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成，利用BLAST工具對引物序列進行特異性比對，使用陽性樣品，分別對引物進行篩選，選取表現(xiàn)最好的引物。引物序列見表1。

表1 LAMP引物序列Table 1 Sequence of primers for the LAMP

1.3.2 AHPND病原檢測靶標基因pVA1的AP2質(zhì)粒構(gòu)建

用LAMP引物的外引物F3、B3對AHPND病原基因組DNA進行PCR擴增，使用Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，按照說明書步驟進行DNA片段的回收，使用Takara公司的pMDTM 18-T Vector Cloning Kit試劑盒，按照說明書步驟進行質(zhì)粒構(gòu)建，使用Takara公司的Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒，按照說明書步驟進行質(zhì)粒的提取。用Multiskan GO全波長讀數(shù)儀檢測質(zhì)粒DNA的濃度，將質(zhì)粒置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 AHPND-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

本研究采用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系及條件，25 μL反應(yīng)體系含有：8 mmol/L dNTP mix、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、100 mmol/L MgSO4水溶液、5 mol/L甜菜堿、F3 0.2 μmol/L、B3 0.2 μmol/L、FIP 1.6 μmol/L、

BIP 1.6 μmol/L、LF 0.8 μmol/L、LB 0.8 μmol/L、DNA

聚合酶8 U、10×SYBR Green I 0.5 μL，待檢樣品2 μL，用超純水補齊至25 μL，最后在體系表面加密封油防止污染。設(shè)置陽性對照和15次陰性對照平行，在熒光檢測系統(tǒng)中，63 ℃反應(yīng)45～60 min。如果用染色法則將反應(yīng)液置于金屬浴或水浴鍋中63 ℃反應(yīng)30～45 min，再把1 μL 1000×SYBR Green I顯色液小心滴在反應(yīng)管蓋中間，然后顛倒混勻反應(yīng)管，觀察反應(yīng)液顏色，若呈現(xiàn)黃綠色則為陽性，呈現(xiàn)橙色則為陰性。

1.3.4 靈敏性分析

將陽性對照質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，分別以1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL八個梯度濃度作為模板和陰性對照（滅菌超純水），用優(yōu)化的熒光法、染色法進行檢測，以確定AHPND-LAMP反應(yīng)體系的靈敏性。同時使用相同稀釋度的模板進行普通PCR反應(yīng)，對比兩種方法的檢測靈敏性。

1.3.5 特異性分析

用建立的AHPND-LAMP的反應(yīng)體系和條件對含傳染性皮下和造血器官壞死病毒（IHHNV）、對蝦白斑綜合癥?。╓SSV）、斑節(jié)對蝦桿狀病毒（MBV）、蝦細菌性肝胰腺壞死?。∟HPB）、對蝦桿狀病毒（BP）、對蝦黃頭病毒（YHV）、對蝦桃拉病毒（TSV）和副溶血弧菌DNA（不含pVA1基因）及AHPND病原的陽性模板進行擴增和結(jié)果判定。IHHNV、WSSV、MBV、YHV、副溶血弧菌均由本實驗室分離、鑒定并保存，NHPB、BP、TSV由廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司贈予。

1.3.6 穩(wěn)定性分析

以濃度為100 pg/μL和1 pg/μL的陽性質(zhì)粒為模板DNA，各自設(shè)置15次平行，同時設(shè)置陰性對照（滅菌超純水），用優(yōu)化的AHPND-LAMP反應(yīng)體系和條件進行熒光法檢測，計算Ct值的標準差（SD）和變異系數(shù)（CV），以確定AHPND-LAMP方法的穩(wěn)定性。

1.3.7 AHPND-LAMP方法與普通PCR方法的比對

用AHPND-LAMP熒光法對37批次進境對蝦樣品（越南21批次、泰國9批次、馬來西亞7批次）進行AHPND病原的檢測，并與普通PCR檢測方法進行比對。

2 結(jié)果與討論

2.1 AHPND病原分離鑒定和結(jié)果分析

分離的菌株符合副溶血性弧菌生化反應(yīng)結(jié)果，同時菌液PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫的AHPND參考序列（BAVF00000000.1）[4]的同源性達到98%～99%，則確定該分離的菌株為攜帶致病基因pVA1的特殊副溶血性弧菌[4-6]。

由于廣州白云機場口岸進境的對蝦是食用養(yǎng)殖鮮活對蝦，進境時外觀上觀察都是健康的。采用無菌接種環(huán)蘸取肝胰腺組織劃線接種到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后很難分離出形態(tài)一致的優(yōu)勢菌群。本研究采用兩種病原的分離方法，一種是直接用對蝦的肝胰腺組織抽提基因組DNA后進行PCR擴增，分離病原；另一種是采用OIE《水生動物疾病診斷手冊第2.2.1章》中的要求，把肝胰腺組織富集培養(yǎng)后抽提基因組DNA，進行PCR擴增再分離病原。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：取對蝦的肝胰腺組織不富集培養(yǎng)直接進行PCR檢測，檢出核酸陽性13批次，感染率僅2.87%，且無法分離出陽性菌株；取肝胰腺組織經(jīng)過富集增菌培養(yǎng)后，檢出核酸陽性73批次，感染率則高達16.11%。自越南、泰國、馬來西亞進境的453批次對蝦樣品中，越南的對蝦樣品陽性感染率最高，達到21.79%，分離出11株陽性菌株，分離成功率為15.07%。泰國進境對蝦感染率只有0.05%，未分離出陽性菌株。而馬來西亞的進境對蝦未檢出AHPND病原（見表2）。

表2 2017～2018年進境對蝦AHPND分離鑒定情況Table 2 Identification results of imported shrimp in 2017~2018

由此可見，針對病原含量不高的亞臨床感染樣品或環(huán)境樣品，富集增菌培養(yǎng)后再進行檢測，對于檢測實驗室來講，是非常必要的，可以防止大量的漏檢情況出現(xiàn)。采肝胰腺→富集增菌培養(yǎng)→PCR初篩→分離菌株→菌株鑒定，是比較好的AHPND病原分離方法[7-11]。

2.2 AHPND-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

觀察AHPND-LAMP反應(yīng)結(jié)果，熒光法最佳的反應(yīng)條件是63 ℃ 30 s；63 ℃ 15 s，63 ℃ 45 s，60個循環(huán)，最佳的反應(yīng)時間是60 min 30 s（見圖1）；而染色法最佳的反應(yīng)時間是45 min。

2.3 AHPND-LAMP靈敏性檢測

將陽性質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋后進行LAMP檢測，當模板濃度為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL時有明顯的擴增曲線和顏色變化，可見質(zhì)粒的檢測限為1 fg/μL（圖2a，b）。采用普通PCR方法對同樣濃度的質(zhì)粒模板進行擴增，當模板濃度為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL時有目標條帶，可見其檢測限為100 fg/μL（見圖3）。綜合上述檢測方法的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本文建立的AHPND-LAMP檢測方法具有很高的靈敏度，且LAMP方法的靈敏度比PCR方法高出兩個數(shù)量級。

2.4 AHPND-LAMP特異性檢測

使用優(yōu)化后的AHPND-LAMP反應(yīng)方法，對10種蝦類疫病進行檢測，熒光法只有AHPND出現(xiàn)明顯的擴增曲線，其他疫病沒有擴增曲線；染色法只有AHPND出現(xiàn)黃綠色，其他疫病都是橙色。說明設(shè)計的AHPND-LAMP反應(yīng)引物特異性良好（見圖4）。

2.5 AHPND-LAMP穩(wěn)定性檢測

用100 pg/μL和1 pg/μL的質(zhì)粒模板進行15次重復(fù)試驗，驗證AHPND-LAMP熒光反應(yīng)方法的穩(wěn)定性。如圖5所示，模板濃度為100 pg/μL和1 pg/μL的15次平行試驗中，均產(chǎn)生“S”型擴增曲線，陰性對照無擴增；同一個模板濃度出峰時間相差不大，Ct值的變異系數(shù)小于3%（見表3）。由此可見，本文建立的AHPND-LAMP方法具有良好的穩(wěn)定性。

表3 LAMP法檢測AHPND病原的穩(wěn)定性試驗Table 3 Assessment of stability for the AHPND-LAMP assay

2.6 LAMP方法與普通PCR方法的比對

對進境的對蝦肝胰腺組織樣品富集培養(yǎng)后進行AHPND-LAMP熒光法檢測，并與普通PCR檢測方法進行比對。共37個實際樣本，其中LAMP檢測有13個AHPND病原陽性樣本，陽性率為35.13%，陽性檢出率高于普通PCR檢測結(jié)果（見表4）。說明本研究建立的LAMP方法對實際樣品檢測的適用性良好。

表4 實際樣品中LAMP和PCR方法檢測AHPND病原的結(jié)果Table 4 Detection results of samples by LAMP method and PCR method

3 結(jié)論

3.1 目前，關(guān)于對蝦急性肝胰腺壞死?。ˋcute Hepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND）的研究更多的是聚焦在病原的確定、致病機理分析和檢測方法的建立方面，針對不同樣品的病原分離鑒定的研究較少涉及。在病原的分離鑒定上，都是直接采用無菌接種環(huán)蘸取肝胰腺組織劃線接種到培養(yǎng)基上進行菌株分離，這種分離方法適用于病原含量高的樣品，不適用于病原含量不高的亞臨床感染樣品或環(huán)境樣品。本研究在分離AHPND的病原時發(fā)現(xiàn)針對病原含量不高的亞臨床感染樣品或環(huán)境樣品，富集增菌培養(yǎng)后再進行檢測，對于檢測實驗室來講，是非常必要的，不僅可以防止大量的漏檢情況出現(xiàn)，而且可以提高病原的檢出率。采樣→富集增菌培養(yǎng)→PCR初篩→分離菌株→菌株鑒定，是比較好的病原分離方法。但是在病原菌株分離過程中發(fā)現(xiàn)，進行肝胰腺組織富集增菌培養(yǎng)的時候，AHPND的病原菌株在大量增殖的同時，存在于肝胰腺中的普通副溶血性弧菌也在大量的增殖，而且普通副溶血性弧菌常常會形成優(yōu)勢菌群，壓制AHPND的病原菌株生長，劃板挑菌時，常常挑到的是普通副溶血性弧菌，這給AHPND病原菌株的準確分離帶來很大的干擾。使用OIE《水生動物疾病診斷手冊第2.2.1章》的富集增菌方法來分離AHPND的病原菌株，對于樣品量多的檢測，仍不是一個十分高效的方法。所以如何優(yōu)化AHPND病原菌株的分離鑒定方法，仍是檢測上需要進一步研究解決的問題。

3.2 本研究建立的AHPND病原LAMP檢測方法，其特異性好，僅AHPND病原具有明顯的擴增曲線和顏色變化，沒有交叉反應(yīng)，靈敏度可達到1 fg/μL，比普通PCR方法高100倍。對實際樣品進行檢測時，陽性檢出率高于PCR檢測結(jié)果。傳統(tǒng)的PCR方法至少需要2～3 h，而LAMP方法可在60 min 30 s內(nèi)完成反應(yīng)。本檢測方法非常適用于基層實驗室，為AHPND病原的快速鑒定、流行病學調(diào)查和風險監(jiān)控等提供了更好的方法選擇。