傅曼琴，陳玉婷,2，吳繼軍，余元善，溫靖，徐玉娟*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）（2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088）

陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium，CRP），是植物橘及其栽培品種的果皮經(jīng)干燥制成[1]，陳皮中含有黃酮類、檸檬苦素類、揮發(fā)油類、生物堿類等物質(zhì)，主要以黃酮類化合物為主[1]。大量研究結(jié)果表明，陳皮在陳化期間黃酮類化合物逐漸積累，大幅度地提高了陳皮的藥用功效。黃酮類化合物有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗菌[5]、抗病毒[6]、降血脂[7]、抗過敏[8]、抗肥胖[9,10]、促消化[11]、祛痰平喘、解痙[12]、改善學(xué)習(xí)記憶能力[13]等生物活性。但傳統(tǒng)的自然陳化，時(shí)間漫長(zhǎng)，效率低且容易受到污染導(dǎo)致品質(zhì)不穩(wěn)定。另外，陳皮中黃酮類化合物難溶于水、生物利用率低，極大程度地限制了黃酮類化合物的臨床應(yīng)用，微生物轉(zhuǎn)化黃酮類化合物的反應(yīng)周期短、條件溫和，可產(chǎn)生一些新穎活性物質(zhì)用于新藥的開發(fā)以及臨床的應(yīng)用。

1 陳皮微生物

陳皮是傳統(tǒng)特色中藥材，現(xiàn)有研究報(bào)道多集中在陳皮化學(xué)成分尤其是黃酮類化合物及其生物活性，另有報(bào)道在陳皮貯藏放置過程中微生物對(duì)其中的活性物質(zhì)含量有顯著影響。陽(yáng)潔等[14]從陳皮中分離鑒定出的細(xì)菌均屬于芽胞桿菌屬Bacillus或者類芽孢桿菌屬Paenibacillus，未分離出放線菌和真菌。王福等[15]從不同批次的陳皮樣品中分離得到青霉、桔青霉、黑曲霉和黃曲霉等25株真菌。劉素娟等[16]也從陳皮樣品中共分離鑒定出子囊菌類曲霉屬和青霉屬真菌等10株真菌，黑曲霉和黃曲霉為優(yōu)勢(shì)菌群。陳聰聰[17]對(duì)廣陳皮進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，廣陳皮樣品中菌屬有假單胞菌屬Pseudomonas、乳球菌屬Lactococcus、腸球菌屬Enterococcus和節(jié)細(xì)菌屬Arthrobacter。劉麗娜[18]從不同年份陳皮中分離微生物，其中細(xì)菌屬有假單胞菌屬Pseudomonas、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、乳桿菌屬Lactobacillus等，檢測(cè)到的真菌屬有耐干霉屬Xeromyces、酵母菌屬Symmetrospora、蠟菊屬Xerochrysium、枝孢霉屬Cladosporium、被孢霉屬M(fèi)ortierella、菇屬Pleurotus、毛殼菌屬Chaetomium、赤霉屬Gibberella。張?chǎng)蔚萚19]分析了不同產(chǎn)地陳皮表面真菌群落多樣性，主要發(fā)現(xiàn)青霉屬Penicillium、曲霉屬Aspergillus、毛霉屬M(fèi)ucor、枝孢霉屬Cladosporium、鐮刀菌屬Fusarium等。

表1 陳皮微生物種屬來源Table 1 Origin of microbial species of citri reticulatae pericarpium

可見，陳皮表面含有大量微生物，且可能參與陳皮活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，對(duì)陳皮陳化品質(zhì)的形成產(chǎn)生影響。陳化時(shí)間不同，其微生物種類存在差異，年份越久的陳皮中的微生物多樣性也越豐富。陳皮中的細(xì)菌主要是芽孢桿菌屬，真菌主要是曲霉屬和青霉屬，其中黑曲霉因其安全性和強(qiáng)大的酶系成為微生物轉(zhuǎn)化的主要菌種之一，黑曲霉在食藥材陳化過程中參與了部分次生代謝產(chǎn)物的形成。陳皮微生物轉(zhuǎn)化其活性成分的機(jī)制亟待進(jìn)一步研究。

2 陳皮黃酮類活性物質(zhì)

黃酮（flavonoid，又稱類黃酮）是以2-苯基色原酮-4-酮骨架的黃酮類化合物[8]，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可將黃酮類化合物分為黃酮類（flavones），黃酮醇類（flavonol），二氫黃酮類（flavonones），二氫黃酮醇類（flavanonol），花色素類（anthocyanidins），雙苯吡酮類（xanthones），查爾酮（chalcones）和雙黃酮類（biflavonoids）等十幾種[8]。陳皮中的黃酮類化合物主要有兩種，一種是黃酮苷類，如橙皮苷（hesperidin）、柚皮苷（naringin）等，另一種是多甲氧基黃酮類，主要有川陳皮素（nobiletin）、橘皮素（tangeretin）[20]。

2.1 黃酮苷類

陳皮中含有的黃酮苷類化合物主要是橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷和蕓香柚皮苷（圖1）[21,22]，橙皮苷由一個(gè)黃酮苷元和兩個(gè)單糖組成，是陳皮中含量最高的黃酮苷[23]，2015版藥典中定義其為陳皮的指標(biāo)性成分，其含量不得低于3.50%[24]。

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，陳皮中橙皮苷的含量呈升高趨勢(shì)[2,23,24]，劉麗娜等[25]研究發(fā)現(xiàn)不同貯藏年份陳皮橙皮苷含量在15年間增加了2.61倍。楊放晴等研究發(fā)現(xiàn)廣陳皮中黃酮類化合物的含量隨陳化時(shí)間增加總體呈增加趨勢(shì)，其中橙皮苷含量顯著增加[26]。品種和產(chǎn)地的不一，也可導(dǎo)致橙皮苷的含量變化不一。張?chǎng)蔚萚27]研究發(fā)現(xiàn)陳皮中橙皮苷的含量先增加后減少，F(xiàn)u等[28]發(fā)現(xiàn)陳皮在0～3陳化期橙皮苷的含量有所下降。魏瑩等[29]發(fā)現(xiàn)隨著陳化期的延長(zhǎng)陳皮中橙皮苷含量呈下降趨勢(shì)。陳皮中橙皮苷含量變化可能主要與陳皮中的微生物有關(guān)，劉麗娜[18]從不同年份陳皮微生物中篩選出8株具有將橙皮苷轉(zhuǎn)化為橙皮素的真菌，分別為巴西曲霉Aspergillus brasiliensis、黑曲霉Aspergillus niger、塔賓曲霉Aspergillus tubingensis、棘孢曲霉Aspergillus aculeatus、 簡(jiǎn) 青霉Penicillium simplicissimum、互生交鏈孢霉Alternariaalternata、出芽短梗霉Aureobasidium pullulans和葡萄牙棒孢酵母Clavispora lusitania。由此說明陳皮陳化過程中橙皮苷含量的變化可能與其微生物有關(guān)。此外，在不同的陳化階段，陳皮微生物多樣性及其代謝物成分變化亦有顯著差異[17,18]，表明微生物轉(zhuǎn)化對(duì)于陳皮黃酮類活性物質(zhì)的積累起到重要作用，可能是陳皮“越陳越佳”的關(guān)鍵因素。

2.2 多甲氧基黃酮類

多甲氧基黃酮是一類高度甲基化的黃酮類化合物，在柑桔屬植物中廣泛存在，尤其是柑桔果皮中，是柑橘屬植物獨(dú)有的一類天然黃酮化合物[30]。迄今為止，陳皮中鑒定出的多甲氧基黃酮類化合物有五十多種[30]，其中陳皮中含量最高的是川陳皮素[31]，其次是橘皮素、5-羥基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮和3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮[32]。張珂等從陳皮中初步鑒定了61個(gè)化學(xué)成分，主要以黃酮類化合物為主，而從陳皮中首次發(fā)現(xiàn)10個(gè)含有3-羥基-3-甲基戊二酸取代基的多甲氧基黃酮氧苷成分[33]。童超英等首次在陳皮中分離出新圣草次苷、檸檬黃素-3-O-（3-羥基-3-甲基戊二酸）葡萄糖苷及其異構(gòu)體[34]。對(duì)于不同陳化年限陳皮中多甲氧基黃酮類化合物也有研究，楊放晴[26]等用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法技術(shù)分析不同陳化時(shí)間廣陳皮中的黃酮類化合物，分析結(jié)果表明6-去甲氧基橘皮素、川陳皮素、橘皮素的相對(duì)含量增加明顯。盛釗君等[35]通過高效液相色譜與分光光度法兩種方法，測(cè)定新會(huì)柑胎仔、1年青皮、5年陳皮和10年陳皮中多甲氧基黃酮類化合物的含量，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均表明柑胎仔中多甲氧基黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于青皮或陳皮。Fu等[28]研究陳化時(shí)間與黃酮含量是否具有相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)川陳皮素、橘皮素、5-羥基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮和3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮呈增加趨勢(shì)，與劉麗娜等[25]研究1、5和15年新會(huì)陳皮時(shí)的結(jié)論相一致。相反，楊宜婷等[36]研究發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，陳皮中多甲氧基黃酮的含量降低，魏瑩等[29]發(fā)現(xiàn)川陳皮素和橘皮素含量隨陳化年限的增加（1～19年）而增加，之后出現(xiàn)反復(fù)，研究者陳彤[37]也進(jìn)行了驗(yàn)證并且發(fā)現(xiàn)七甲氧基黃酮的含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈波動(dòng)性變化，規(guī)律性不明顯。張懷等[38]研究發(fā)現(xiàn)陳化年份和川陳皮素沒有相關(guān)性，陳化年份和橘皮素呈負(fù)相關(guān)，陳化時(shí)間對(duì)陳皮橘皮素和川陳皮素的影響也與陳皮的具體產(chǎn)地、品種和采收期有關(guān)。在陳皮長(zhǎng)期陳化過程中，植物細(xì)胞逐漸失去活性，植物自身的酶影響多甲氧基黃酮類成分變化的可能性不大，那么是否與其所含微生物有關(guān)？在前文推測(cè)陳皮中真菌將橙皮苷脫糖基化生成橙皮素的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步假設(shè)黃酮苷類脫糖基化生成羥基黃酮，然后通過氧甲基化生成多甲氧基黃酮（圖2），具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 微生物轉(zhuǎn)化陳皮黃酮類化合物

微生物對(duì)陳皮黃酮類化合物的轉(zhuǎn)化主要表現(xiàn)在陳化過程中，陳皮微生物代謝所產(chǎn)生的酶使其黃酮類化合物的組成及含量產(chǎn)生顯著變化。王福等[15]通過將陳皮微生物接入無菌陳皮中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陳皮霉變后，橙皮苷的含量呈增加趨勢(shì)。劉麗娜等[18]發(fā)現(xiàn)8株真菌對(duì)橙皮苷有轉(zhuǎn)化作用，但對(duì)其轉(zhuǎn)化機(jī)制并未研究。Wang等[39]研究發(fā)現(xiàn)將黑曲霉接種陳皮后，川陳皮素的含量呈增加趨勢(shì)，橙皮苷的含量先增加后降低。楊丹等[40]研究黑曲霉發(fā)酵對(duì)陳皮黃酮類化合物的影響，結(jié)果表明與未發(fā)酵陳皮相比，發(fā)酵陳皮黃酮含量較高，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，橙皮苷含量和川陳皮素含量逐漸升高，總黃酮和橘皮素的含量先增加后降低。張?chǎng)蔚萚41]研究發(fā)現(xiàn)，將黑曲霉接種陳皮樣品后，黃酮成分含量均高于接種前，表明黑曲霉的轉(zhuǎn)化對(duì)陳皮活性化合物的積累發(fā)揮了重要作用。微生物轉(zhuǎn)化黃酮類物質(zhì)發(fā)生的主要反應(yīng)有甲氧基化、糖基化、羥基化等，真菌脫糖基化、羥基化、在羥基上進(jìn)行甲基化等。

3.1 糖基化反應(yīng)

糖基化反應(yīng)是活性化合物結(jié)構(gòu)修飾或合成的重要反應(yīng)，黃酮類化合物化合物的理化性質(zhì)可極大程度的被改變。Dymarska等[42]利用昆蟲病原真菌Isaria fumosoroseaKCH J2作為生物催化劑，發(fā)現(xiàn)糖基化主要發(fā)生在6-甲基黃酮的8位和4'位上（圖3），同時(shí)糖基的引入提高了6-甲基黃酮的水溶性、穩(wěn)定性及其生物利用率。Dymarska等[43]利用I. fumosorosea（J1.4和J1.6）和KCH J2對(duì)槲皮素、黃芩素、3-羥基黃酮和3-甲氧基黃酮（圖3）四種黃酮類化合物進(jìn)行糖基化反應(yīng)并獲得了相應(yīng)的吡喃葡萄糖苷，糖基化后的產(chǎn)物水溶性都顯著提高。Chiang等[44]通過Bacillus subtilisATCC 6633的糖基轉(zhuǎn)移酶BsGT110將8-羥基黃豆苷元轉(zhuǎn)化成了2種新的異黃酮苷類化合物：8-羥基黃豆苷元-7-O-β-葡萄糖苷和8-羥基黃豆苷元-8-O-β-葡萄糖苷，新的異黃酮糖苷的水溶性分別是8-羥基黃豆苷元的9倍和4.9倍，且其穩(wěn)定性較8-羥基黃豆苷元顯著提高，這兩種新的異黃酮苷類化合物在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)具有潛在的應(yīng)用前景。

3.2 脫糖基化反應(yīng)

微生物脫糖基化黃酮糖苷以提高苷元的含量是非常普遍的，Da silva等[44]用橙皮苷酶和柚皮苷酶分別處理橙皮苷和柚皮苷發(fā)生脫糖基化反應(yīng)，脫掉鼠李糖轉(zhuǎn)變成為橙皮素-7-O-葡萄糖苷和柚皮素-7-O-葡萄糖苷，發(fā)現(xiàn)脫糖基化后的產(chǎn)物比橙皮苷和柚皮苷的抗氧化活性強(qiáng)。郭瑞等[45]研究發(fā)現(xiàn)有8種益生菌可使2種主要異黃酮苷類成分轉(zhuǎn)化為各自苷元，其中最佳菌株為植物乳桿菌，隨著植物乳桿菌發(fā)酵黃芪時(shí)間的延長(zhǎng)，2種異黃酮苷的轉(zhuǎn)化率也隨之增加，最終可達(dá)80.00%以上。Hsiao等[46]研究了浸泡和加熱黑豆奶加工過程中花青素和異黃酮的轉(zhuǎn)化，以β-葡萄糖苷酶為生物催化劑，飛燕草苷-3-O-葡萄糖苷和花青素-3-O-葡萄糖苷通過脫糖基化反應(yīng)生成飛燕草苷和花青素。黃玉軍等[47]從乳酸菌中篩選出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，豆乳經(jīng)產(chǎn)酶目標(biāo)菌株發(fā)酵后大豆異黃酮苷元總量均有顯著提高。Gaya等[48]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌和雙歧桿菌能催化大豆異黃酮、葛根素和染料木素進(jìn)行脫糖基化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的黃酮苷元。You等[49]利用黑曲霉的α-L-鼠李糖酶為生物催化劑，催化蘆?。▓D4）進(jìn)行脫糖基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為槲皮素-3-葡萄糖苷。

3.3 羥基化反應(yīng)

羥基化反應(yīng)是微生物轉(zhuǎn)化中常見的結(jié)構(gòu)修飾反應(yīng)，是在化合物的特定位置引入羥基，激活不活潑的C-H鍵（表2）。利用A. nigerMB和切美辛青霉113（Penicillium chermesinum113）發(fā)酵，黃烷酮羥基化為6-羥基黃烷酮和4'-羥基黃烷酮，6-羥基黃烷酮羥基化為6,4'二羥基黃烷酮[50]。在菌株A. nigerNBRC 4414作用下7,4'-二甲氧基異黃酮羥基化為6-羥基-7,4'-二甲氧基異黃酮，轉(zhuǎn)化率為36.00%[51]。柚皮素在菌株A.nigerCGMCC 3. 4628作用下，C-6，C-8位羥基化分別生成6-羥基柚皮素，8-羥基柚皮素，轉(zhuǎn)化率分別為38.00%和43.00%[52]。白曲霉A. candidus生物轉(zhuǎn)化異雄酮可生成10種羥基化衍生物，羥基化主要發(fā)生在C-1α，C-11α和C-15β位[53]。利用鏈霉菌MA-4680發(fā)酵，大豆苷元和染料木素發(fā)生羥基化反應(yīng)生成3',4',7-三羥基異黃酮，3',4',5,7-四羥基異黃酮，羥基化后的產(chǎn)物抗氧化活性顯著增強(qiáng)[54]。

表2 微生物對(duì)黃酮類化合物的羥基化作用Table 2 Hydroxylation of flavonoids by microbial

表3 微生物對(duì)黃酮類化合物的O-去甲基化作用Table 3 O-demethylation of flavonoids by microbes

3.4 甲基化反應(yīng)

甲基化反應(yīng)是黃酮類化合物重要的修飾反應(yīng)，甲基化修飾后可以增強(qiáng)天然活性物質(zhì)的活性，從Streptomycessp.KCTC 0041BP菌株中獲得的甲基轉(zhuǎn)移酶能夠以區(qū)域選擇性方式向4'-OH添加甲基[55]，通常在4'-OH處具有甲基化的類黃酮趨向于生物有效且化學(xué)穩(wěn)定，因此該轉(zhuǎn)移酶可用于生產(chǎn)多種生物活性分子及其衍生物。灰色鏈霉菌（S. griseus）對(duì)黃酮醇類（如槲皮素和漆黃素）的O-甲基化大多發(fā)生在C-3'和C-4'位，對(duì)黃酮類（如木犀草素和黃芩素）的O-甲基化大多發(fā)生在C-6（OH）位[56]。在球孢白僵菌ATCC 7159的發(fā)酵作用下槲皮素甲基化為3'-甲氧基槲皮素[57]。Kostrzewa-Suslow等[58]篩選出曲霉和青霉將7-羥基黃烷酮鄰甲基化為7-甲氧基黃烷酮和3',4'-二羥基-7-甲氧基黃烷酮。Kostrzewa-Suslow等利用Chaetomiumsp菌株催化黃芩苷生成5,7-二羥基-6-甲氧基黃酮[59]。

3.5 脫甲基化反應(yīng)

微生物對(duì)多甲氧基黃酮類化合物的去甲基化傾向于發(fā)生在B環(huán)的C-3'和C-4'位置（表2），5,6,7,3',4'-五甲氧基黃酮在菌株A. nigerNBRC4414作用下脫甲基生成4'-甲基-5,6,7,3'-四甲氧基黃酮[51]，兩種黃酮類化合物對(duì)化學(xué)誘變劑均具有顯著的抗誘變活性，且4'-甲基-5,6,7,3'-四甲氧基黃酮表現(xiàn)出比底物更高的抗誘變活性。在菌株A. niger的作用下塞尼汀、6,7,4'三甲氧基異黃酮和5,7,4'-三甲氧基異黃酮脫甲基化分別生成4'羥基-5,6,7,3'-四甲氧基黃酮、4'羥基-6,7-二甲氧基異黃酮和4'羥基-5,7-二甲氧基異黃酮[51]，7-甲氧基黃酮與之相似，在C-7位脫甲基，生成相應(yīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[51]。5,6,7,8,4'-五甲氧基黃酮在菌株A. nigerATCC 984199作用下C-4'位脫甲基生成4'-羥基-5,6,7,8-四甲氧基黃酮，轉(zhuǎn)化率為71%。3-羥基橘紅素在菌株A.nigerATCC 9142作用下C-4'位脫甲基生成3,4'-二羥基-5,6,7,8-四甲氧基黃酮，轉(zhuǎn)化率為60.00%，而川陳皮素在這兩種菌株的發(fā)酵作用下轉(zhuǎn)化慢且代謝物含量少，證實(shí)了微生物轉(zhuǎn)化具有特定選擇性[60]。

3.6 脫氫反應(yīng)

Kostrzewa-Suslow等[61]通過曲霉屬菌株對(duì)黃烷酮脫氫反應(yīng)進(jìn)行了一些研究。7-羥基二氫黃酮在菌株A.nigerKB作用下發(fā)生羰基還原反應(yīng)，在菌株A. niger13/5作用下C-2，C-3位脫氫化，其中產(chǎn)量最高的產(chǎn)物分別是7-羥基黃烷-4-醇，7-羥基黃酮。在菌株A.ochraceus 456作用下發(fā)生脫氫反應(yīng)，隨后羥基化形成4'-羥基-7-甲氧基黃酮。A. niger6/2也選擇性地將6-羥基黃烷酮的C2-C3處脫氫生成6-羥基黃酮作為單一產(chǎn)物[62]。

4 展望

陳皮為傳統(tǒng)中藥材，對(duì)于陳皮的生物活性、活性物質(zhì)以及陳皮中微生物已經(jīng)進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究。陳皮中活性物質(zhì)主要以黃酮類化合物為主，黃酮類化合物存在溶解度差，生物利用度低、含量低、難純化等問題，很難被開發(fā)利用。微生物轉(zhuǎn)化因其具有反應(yīng)溫和，安全性高，產(chǎn)生新穎化合物等優(yōu)點(diǎn)，從而可以提高了化合物的生物利用率。陳皮為久貯藥材的代表，其陳化過程中伴隨著微生物的生長(zhǎng)，已報(bào)道的有黑曲霉、朱黃青霉和桔青霉等。將真菌反接陳皮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)黑曲霉對(duì)黃酮類成分的影響較大，將黑曲霉反接陳皮培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)黃酮含量的變化，以黃酮含量上升為指標(biāo)篩選具有轉(zhuǎn)化功能菌株，下一步研究應(yīng)在于結(jié)合代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)明確其促進(jìn)黃酮形成的反應(yīng)途徑，以及在代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)和功能酶活，闡明在陳皮陳化過程中，微生物轉(zhuǎn)化陳皮黃酮的代謝機(jī)制，進(jìn)而為科學(xué)倉(cāng)儲(chǔ)、調(diào)控陳化過程中，提升陳皮品質(zhì)提供理論依據(jù)。