陳 琳, 滕爽爽, 朱愛意, 黃曉林, 肖國強
水溫和余氯對泥蚶胚胎發(fā)育的毒性效應
陳 琳1, 2, 滕爽爽2, 朱愛意2, 黃曉林2, 肖國強1, 2
(1. 浙江海洋大學 國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心, 浙江 舟山 316022; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室 溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室, 浙江 溫州 325005)
為了研究三門灣海域溫排水污染對水生動物發(fā)育的影響, 本實驗通過室內模擬三門灣核電站溫排水的余氯殘留和溫升效應, 研究了不同溫度和不同游離余氯質量濃度耦合下對泥蚶()胚胎發(fā)育的影響。實驗水溫為29 ℃、32 ℃和35 ℃, 游離余氯質量濃度為0.025、0.050、0.100、0.200、0.400和0.800 mg/L, 同時以砂濾海水為對照組, 選取30 min胚胎細胞組成、1 h卵裂率、24 h D型幼蟲孵化率和幼蟲畸形率等4個指標進行觀察分析。結果表明, 單一溫升情況下, 32 ℃對泥蚶30 min時細胞期發(fā)育有促進作用; 35 ℃抑制了泥蚶30 min時的細胞期發(fā)育, 泥蚶1 h卵裂率顯著降低、無D型幼蟲孵化。溫度聯(lián)合游離余氯情況下, 3個溫度下隨著游離余氯質量濃度的增加, 泥蚶受精卵卵裂率均呈下降趨勢, 游離余氯對泥蚶卵裂率影響的最低可觀察效應濃度(LOEC)分別為0.400、0.200和0.800 mg/L。29 ℃和32 ℃下, 隨著余氯質量濃度的升高, D型幼蟲孵化率呈下降趨勢, 畸形率呈升高趨勢; 兩個溫度下游離余氯對泥蚶D型幼蟲孵化率和畸形率的最低可觀察效應濃度(LOEC)分別為0.100和0.050 mg/L。35 ℃下, D型幼蟲未孵出, 無最低可觀察效應濃度(LOEC)。本研究不僅可以為三門灣核電站海水中余氯污染對該海域生物和生態(tài)環(huán)境的影響提供基礎資料, 還可以為沿海電廠溫排水排放標準提供理論指導意義。
泥蚶(); 胚胎發(fā)育; 水溫; 游離余氯
核電站原子核裂變產(chǎn)生的能量只有30%~35%轉變?yōu)殡娔? 大量的廢熱通過冷卻水排放到環(huán)境中, 使海洋生物受到升溫幅度為4 ℃~12 ℃熱沖擊[1]。為了防止污損生物在冷卻系統(tǒng)內壁附著, 阻塞管道系統(tǒng), 通常要對冷卻海水作氯化處理。冷卻水通過冷卻系統(tǒng)后再排出, 其中的余氯亦隨之排放到海洋環(huán)境中。熱沖擊和余氯直接或間接地影響到海水利用行業(yè)尤其是近海和河口區(qū)的水產(chǎn)資源及養(yǎng)殖業(yè)[2-3]。
從20世紀60年代以來, 國內外研究者對海水中殘留余氯的生態(tài)效應開展了大量研究[4-18]。相比水生動物成體和幼體, 其早期胚胎發(fā)育階段對余氯的毒性更加敏感[19-20]。因此, 探究溫排水對水生動物的影響有必要對其早期胚胎發(fā)育階段進行探究。黑棘鯛()22 ℃下胚胎孵化率最高, 溫度升高或下降, 孵化率均降低; 同時, 余氯質量濃度的升高, 導致胚胎孵化率下降[21]; 大亞灣核電站余氯排放對合浦珠母貝()受精卵卵裂率有抑制作用, 該抑制作用隨著余氯質量濃度升高而增大, 游離態(tài)余氯對卵裂的抑制強于化合態(tài)余氯[22]; 鱸魚()受精卵的孵化率隨著水中的含氯量提升而降低[23]; 次氯酸鈉脅迫白鮭()胚胎發(fā)育的研究中, 從受精卵期開始脅迫, 胚胎死亡率顯著升高; 從眼期開始脅迫, 胚胎死亡率沒有顯著升高, 表明受精卵更易受余氯毒性影響[24]。
泥蚶()屬軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Lamellibranchia)、列齒目(Taxodonta)、蚶科(Arcidae)、泥蚶屬(), 是三門灣海區(qū)重要的經(jīng)濟物種之一。相比于有回避能力的魚類和蝦類, 泥蚶這種活動能力弱的附著類生物更容易受到溫排水的影響, 更不會主動遷移逃離溫排水污染區(qū)產(chǎn)卵, 故在早期胚胎發(fā)育階段尤其容易受到溫排水脅迫, 且容易被卷吸進冷卻系統(tǒng)內或隨風浪或海流漂移至溫排水排放區(qū)[25]。泥蚶成貝和稚貝均有較完善的生理構造和自我保護機制, 較泥蚶受精卵更有利于抵御外界惡劣環(huán)境, 本研究以三門灣主要經(jīng)濟養(yǎng)殖動物泥蚶的受精卵為對象, 分析溫度、游離余氯及兩種因子交互作用對泥蚶受精卵發(fā)育的影響, 根據(jù)三門灣核電站溫排水前期調查結果, 設置本實驗溫度和游離余氯梯度開展研究。本研究可望為中國沿海電廠溫排水溫度和殘留余氯質量濃度限值提供基礎數(shù)據(jù)支撐。
實驗所用的泥蚶二齡親貝為泥蚶水產(chǎn)新品種“樂清灣1號”群體, 由浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江基地提供。選擇活力良好且性腺飽滿的個體用于實驗。
次氯酸鈉(NaClO)和40%甲醛溶液(CH2O)購自國藥集團化學試劑有限公司, 均為分析純試劑, 用蒸餾水配成1.5 mg/mL的游離余氯母液, 實驗時按照終濃度稀釋。
實驗設置3個水溫條件: 29 ℃、32 ℃和35 ℃, 均由加熱棒水浴控溫; 在每個水溫條件下設0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400和0.800 mg/L總計7個游離余氯質量濃度條件, 其中以游離余氯為0 mg/L的過濾海水為對照, 每組設3個平行, 實驗在500 mL燒杯中進行, 實驗試液總量為500 mL, 各組預先調節(jié)好水溫, 再加入游離余氯母液。陰干加流水刺激誘導親貝排放受精卵, 將開始排放的親貝挑出來分開雌雄, 取再次排放的精卵混合受精, 迅速收集受精卵進行實驗。由于游離余氯衰減較快, 故實驗期間各組12 h時再添加一次游離余氯母液, 添加量按照終濃度及燒杯中試液量計算。受精30 min、1 h、24 h后, 吸取燒杯內30 mL含受精卵的海水(吸取前攪拌吹打均勻), 移入裝有1 mL 8%甲醛溶液的50 mL尖頭離心管內固定, 分別用于統(tǒng)計各組胚胎細胞組成、卵裂率、D型幼蟲孵化率和D型幼蟲畸形率。
采取法國PONSEL便攜式水質分析儀(Multy8302)及其配套試劑測定海水中的余氯的含量(國家環(huán)境保護標準HJ586-2010[26], DPD法, 量程0.1~6 mg/L)。
所得數(shù)據(jù)使用平均值±標準差(Mean±SD)表示, 采用 SPSS 22.0統(tǒng)計軟件的Tukey或Dunnett’s T3多重比較方法分析各組卵裂率、胚胎細胞組成、D型幼蟲孵化率和D型幼蟲畸形率是否具有顯著性差異, 當<0.05時統(tǒng)計具有顯著性差異; 當方差齊性時采用Tukey進行多重比較, 當方差不齊時采用Dunnett’s T3進行多重比較。以單因素方差分析(One-way analysis of variance, ANOVA)檢驗相同溫度下不同游離余氯質量濃度對卵裂率、胚胎細胞組成、D型幼蟲孵化率和D型幼蟲畸形率的顯著性差異,<0.05為差異顯著。以雙因素方差分析Two- way ANOVA (SPSS 22.0)檢驗溫度、游離余氯這兩個因素相互作用是否顯著影響泥蚶胚胎發(fā)育,< 0.05為差異顯著。而后采用OriginPro和Excel進行畫圖。
通過毒性試驗確定化學物質對生物的最低可觀察濃度效應(lowest observed effect concentration, LOEC)通常是開展毒理學研究的重要目的。本研究根據(jù)OECD的方法[27], 確定游離余氯對泥蚶受精卵卵裂率的LOEC值, 即各溫度條件下的實驗組卵裂率與該溫度條件下的對照組卵裂率進行單因素方差分析, 與對照組具有顯著性差異(<0.05)實驗組中最低的余氯質量濃度即為LOEC值。
由表1可知, 泥蚶30 min胚胎細胞組成中, 35 ℃時受精卵所占比例顯著升高(<0.05); 32 ℃和35 ℃時2細胞所占比例顯著升高(<0.05); 32 ℃和35 ℃時4細胞所占比例顯著降低(<0.05); 32 ℃時8細胞所占比例顯著升高(<0.05)。35 ℃時卵裂率顯著降低(<0.05)。35 ℃時D型幼蟲孵化率顯著降低(<0.05), 胚胎未發(fā)育到D型幼蟲階段, 停留在擔輪幼蟲階段; 32 ℃時, D型幼蟲畸形率顯著升高(<0.05)。
表1 溫度對泥蚶胚胎發(fā)育的影響
注: 因D型幼蟲畸形率=(畸形D型幼蟲數(shù)÷總D型幼蟲數(shù))×100%, 總D型幼蟲數(shù)為0時, D型幼蟲畸形率無法計算, 用—表示(表3同); 同列同一項目肩標不同字母表示差異顯著(<0.05)
由圖1可知, 29 ℃條件下, 游離余氯質量濃度為0.1 mg/L時, 4細胞所占比例顯著減少(<0.05), 游離余氯對胚胎發(fā)育存在一定的滯后作用。32 ℃條件下,游離余氯質量濃度為0.05 mg/L時, 8細胞比例顯著降低; 游離余氯質量濃度為0.1 mg/L時, 4細胞比例顯著增加, 游離余氯質量濃度為0.8 mg/L時, 4細胞比例顯著降低。35 ℃條件下, 各濃度組胚胎相對于29 ℃和32 ℃都滯后發(fā)育。
圖1 3個溫度下游離余氯脅迫對泥蚶30 min胚胎細胞組成的影響
不同溫度條件下不同游離余氯質量濃度對泥蚶30 min胚胎細胞組成的影響進行雙因素方差分析(表2),結果顯示溫度會顯著影響游離余氯對泥蚶30 min胚胎細胞組成中受精卵、2細胞和4細胞造成的比例變化, 溫度和游離余氯質量濃度之間存在協(xié)同作用。
由圖2可知, 29 ℃、32 ℃和35 ℃條件下, 隨著游離余氯質量濃度的增加, 泥蚶受精卵卵裂率均呈下降趨勢。29 ℃下, 0.4 mg/L游離余氯質量濃度組卵裂率顯著降低; 32 ℃下, 0.2 mg/L游離余氯組卵裂率顯著降低; 溫度提升, LOEC值降低, 可能是由于產(chǎn)生了溫升耦合毒性。35 ℃下, 0.8 mg/L游離余氯質量濃度組卵裂率顯著降低, 從對照組可知, 卵裂率受該溫度(35 ℃)影響較大, 該溫度下對照組卵裂率較29 ℃和32 ℃顯著下降(表1)。此時, 溫度是影響泥蚶受精卵卵裂率的主要因子。
表2 溫度和游離余氯對泥蚶胚胎發(fā)育的影響
注: *. 差異顯著(<0.05); **. 差異極顯著(<0.01)
圖2 溫度和游離余氯脅迫下泥蚶受精卵卵裂率
同一溫度不同游離余氯質量濃度下, 不同字母表示差異顯著(< 0.05)
Different letters indicate significant differences during different con-centrations of free residual chlorine at the same temperature(<0.05)
不同溫度條件下不同游離余氯質量濃度對泥蚶受精卵卵裂率的影響進行雙因素方差分析(表2), 結果顯示溫度和游離余氯質量濃度之間不存在協(xié)同作用, 溫度不會顯著影響游離余氯對泥蚶受精卵卵裂率的抑制效應。
由表3可知, 29 ℃和32 ℃條件下, 隨著游離余氯質量濃度的升高, D型幼蟲孵化率呈下降趨勢, 畸形率呈升高趨勢; 游離余氯質量濃度為0.1 mg/L時, D型幼蟲孵化率顯著降低(<0.05); 游離余氯質量濃度為0.05 mg/L時, 畸形率也顯著升高(<0.05), 可見D型幼蟲對余氯敏感, 即使0.1 mg/L質量濃度下泥蚶受精卵有80%左右的卵裂率(圖2)。但也無法繼續(xù)發(fā)育成正常的D型幼蟲。當溫度為29 ℃和32 ℃, 游離余氯質量濃度為0.2、0.4和0.8 mg/L時, 胚胎未孵化成D型幼蟲; 35 ℃條件下, 所有濃度組別泥蚶受精卵均無法發(fā)育成D型幼蟲。
表3 溫度和游離余氯脅迫下泥蚶D型幼蟲孵化率與畸形率
注: 同列同一項目肩標不同字母表示差異顯著(<0.05)
不同溫升條件下不同游離余氯質量濃度對泥蚶D型幼蟲孵化率、D型幼蟲畸形率的影響進行雙因素方差分析(表2), 結果顯示溫度會顯著影響游離余氯對泥蚶D型幼蟲孵化的抑制效應, 溫度和游離余氯質量濃度之間存在協(xié)同作用; 溫度不會顯著影響游離余氯對泥蚶D型幼蟲致畸效應, 溫度和游離余氯質量濃度之間不存在協(xié)同作用。
溫度是影響貝類受精卵孵化的重要因素, 不同的貝類受精卵孵化所要求的溫度條件不同, 并對溫度的適應范圍也有明顯的差異[28]。至今, 國內外多位學者已針對溫度對貝類受精卵孵化的影響開展了大量的研究, 這些工作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供了理論指導和科學依據(jù)。皺紋盤鮑()胚胎發(fā)育的最適合溫度為22 ℃~24 ℃[29]; 波紋巴非蛤()胚胎發(fā)育最適合的溫度為30 ℃[30]; 青蛤()胚胎發(fā)育最適合的溫度為26 ℃~ 30 ℃[31]; 毛蚶()胚胎發(fā)育最適合的溫度為25 ℃~30 ℃[32]; 紫彩血蛤()胚胎發(fā)育最適合溫度為15 ℃~20 ℃[33]; 泥蚶()的最適溫度為25 ℃~31 ℃[34]。
在單一溫度對泥蚶胚胎發(fā)育影響實驗中, 選取卵裂率、30 min胚胎細胞組成、24 h D型幼蟲畸形率、24 h D型幼蟲畸形率作為指標進行衡量, 來評定溫度對泥蚶胚胎發(fā)育的影響。該結果與溫度對其他貝類胚胎發(fā)育的影響基本一致[35]。蘭國寶等[34]研究認為水溫的升高有助于提高貝類胚胎發(fā)育的速度, 當水溫在21 ℃時, 從受精卵發(fā)育到D型幼體需要近60 h, 而當水溫在31 ℃~33 ℃時, 胚胎發(fā)育達D型幼蟲僅需要12~13 h。本研究發(fā)現(xiàn)32 ℃條件下泥蚶胚胎發(fā)育速度明顯快于29 ℃, 30min時, 29 ℃對照組, 4細胞占比80.0%; 32 ℃對照組, 4細胞占比33.5%, 8細胞占比37.0%; 35 ℃對照組, 2細胞占比39.2%, 4細胞占比23.7%。35 ℃發(fā)育較慢。這與孫虎山等[33]研究認為“高溫”可使紫彩血蛤胚胎畸形、滯育, 且胚胎的畸形、滯育現(xiàn)象隨溫度的升高而加重相符。給胚胎適當?shù)臏囟妊a償, 有利于胚胎中一些蛋白質的表達, 提高酶的活性, 加速發(fā)育; 但溫度過高容易使細胞程序性死亡, 導致胚胎畸形, 也會導致酶活性降低, 降低新陳代謝活動, 使胚胎滯育[35]。
在已有的研究中, 谷宇婷等[37]研究了溫升聯(lián)合海洋酸化對皺紋盤鮑受精和胚胎發(fā)育的影響, 結果表明溫升會加劇海洋酸化對皺紋盤鮑受精和胚胎發(fā)育造成的負面影響; 王云彪等[38]研究了溫度對Pb、Cd、Hg、Cu脅迫下秀麗隱桿線蟲()毒性的影響, 結果表明, Cu和Hg脅迫24 h下, 隨著環(huán)境溫度的升高, 秀麗隱桿線蟲LC50值與繁殖力降低, 溫升增加了重金屬的毒性; 在溫度聯(lián)合其他污染物對生物的毒性影響研究中, 溫度作為一個非常重要的生態(tài)因子, 不僅與生物的生命活動、生理代謝息息相關, 而且對其他污染物物理化學性質有一定的影響作用, 從而間接對生物產(chǎn)生影響。溫度越高, 通常會增大另一物質對生物的毒性, 例如溫度的升高可以引起水體可利用形式的重金屬活性增強及濃度的增加, 進而引起該污染物的毒性增加[39]。本研究中, 29 ℃時, 造成泥蚶受精卵卵裂顯著性降低的游離余氯質量濃度為0.4 mg/L; 32 ℃時, 造成泥蚶受精卵卵裂率顯著性降低的游離余氯質量濃度為0.2 mg/L, 在29 ℃~32 ℃下, 游離余氯對泥蚶受精卵卵裂率影響的最低可觀察效應濃度(LOEC)隨著溫度的升高而降低, 也驗證了該理論。
32 ℃時, 造成泥蚶受精卵卵裂率顯著性降低的游離余氯質量濃度為0.2 mg/L; 35 ℃時, 造成泥蚶受精卵卵裂率顯著性降低的游離余氯質量濃度為0.8 mg/L; 在32 ℃~35 ℃下, 游離余氯對泥蚶受精卵卵裂率影響的最低可觀察效應濃度(LOEC)隨著溫度的升高而升高, 表明在32 ℃~35 ℃下, 游離余氯毒性并未隨著水溫升高而增大。這點與溫度聯(lián)合其他污染物導致污染物毒性隨著水溫升高而增大不同, 推測這與游離余氯易衰減的特性有關, 隨著溫度的升高, 游離余氯衰減的越快, 從而影響了游離余氯的毒性。游離余氯的毒性效應與溫度之間的非線性關系反映出溫度聯(lián)合游離余氯對泥蚶胚胎發(fā)育毒性效應的復雜性[40]。相似情況在晁敏等[21]的研究中也有出現(xiàn)過, 在22 ℃~30 ℃內, 游離余氯的毒性并未隨著水溫升高而增加, 22 ℃下毒性最強, 26 ℃下毒性最弱, 研究者推測是由于隨著溫度的增加, 游離余氯的衰減和轉化為非毒形式的速度加快, 從而影響了氯的毒性。
本研究表明0.2 mg/L質量濃度下, 已無D型幼蟲孵化; 0.1 mg/L質量濃度下, D型幼蟲畸形率為100%。三門灣核電站鄰近海域游離余氯質量濃度為0.01~0.18 mg/L, 會對泥蚶的胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響, 長期如此, 三門灣核電站鄰近海域泥蚶數(shù)量將會劇減。此外, 從三門灣沿岸核電工業(yè)的發(fā)展來考慮, 余氯排放量有可能增加, 鄰近海域余氯污染情況可能還會變化, 因此有必要采取一定的措施來遏制這一嚴峻形勢。
在本研究設置的溫度范圍內(29 ℃~35 ℃), 32 ℃促進了泥蚶30 min時細胞期發(fā)育、對泥蚶受精卵卵裂率、D型幼蟲孵化率沒有顯著性影響, D型幼蟲畸形率顯著性降低; 35 ℃抑制了泥蚶30 min時的細胞期發(fā)育、使泥蚶受精卵卵裂率顯著降低、無D型幼蟲孵化。
溫度聯(lián)合游離余氯情況下, 3個溫度下隨著游離余氯質量濃度的增加, 均抑制了泥蚶30 min時細胞期發(fā)育, 泥蚶受精卵卵裂率均呈下降趨勢, 游離余氯對泥蚶受精卵卵裂率影響的最低可觀察效應質量濃度(LOEC)分別為0.400、0.200、0.800 mg/L。29 ℃和32 ℃下, 隨著濃度的升高, D型幼蟲孵化率呈下降趨勢, 畸形率呈升高趨勢, 兩個溫度下游離余氯對泥蚶D型幼蟲孵化率和畸形率的最低可觀察效應質量濃度(LOEC)分別為0.100和0.050 mg/L。35 ℃下, D型幼蟲未孵出, 無最低可觀察效應濃度(LOEC)。
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Toxic effects of water temperature and residual chlorine on embryonic development of
CHEN Lin1, 2, TENG Shuang-shuang2, ZHU Ai-yi2, HUANG Xiao-lin2,XIAO Guo-qiang1, 2
(1. Zhejiang Ocean University, National Engineering Research Center For Marine Aquaculture, Zhoushan 316022, China; 2. Zhejiang Mariculture Research Institute; Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bioresource; Wenzhou Key Laboratory of Marine Biological Genetics and Breeding, Wenzhou 325005, China)
To investigate the effects of warm drainage pollution in Sanmen Bay on the development of aquatic animals, the influence of free residual chlorine on the embryonic development ofunder different temperature conditions was studied through laboratory simulations. Three different water temperatures were set at 29 ℃, 32 ℃, nd 35 ℃, and six different gradients of free residual chlorine concentration were set at 0.025, 0.050, 0.100, 0.200, 0.400, and 0.800 mg/L. Simultaneously, filtered seawater was taken as the control. The influence of thermal drainage on the embryonic development ofwas analyzed by counting the change of the embryonic cell composition, cleavage rate, D-shaped larva hatching rate, and malformation rate. The results of a single temperature rise revealed that 32 ℃ promoted cell development for 30 minutes after fertilization, whereas 35 ℃ inhibited cell development for 30 minutes after fertilization. The 1 h cleavage rate was significantly decreased, and the D-shaped larva hatching rate was zero at 35 ℃. Under the condition of temperature combined with free residual chlorine, the cleavage rate decreased along with the elevated concentration of free residual chlorine, and the lowest observed effect concentration (LOEC) values of free residual chlorine to the cleavage rate ofwere determined to be 0.400, 0.200, and 0.800 mg/L at 29 ℃, 32 ℃, and 35 ℃, respectively. The D-shaped larva hatching rate decreased, and the malformation rate increased along with the elevated concentration of free residual chlorine at 29 ℃ and 32 ℃, respectively.The LOEC values of free residual chlorine to the hatching rate ofD-type larvae and the malformation rate were determined to be 0.100 mg/L and 0.050 mg/L, respectively. The D-shaped larva hatching rate was zero, and there was no LOEC value at 35 ℃. This study provides not only basic data for the impact of residual chlorine pollution on the biological and ecological environment in the Sanmen Bay Nuclear Power Plant but also theoretical guidance for formulating the discharge standard of warm water drainage of coastal power plants.
; embryonic development; water temperature; free residual chlorine
Aug. 7, 2021
X503.225
A
1000-3096(2022)04-0025-09
10.11759/hykx20210807001
2021-08-07;
2021-10-08
國家重點研發(fā)計劃項目(2020YFD0900802, 2018YFD0901405-2);國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目(CARS-49)
[The National Key Research and Development Program of China, Nos. 2020YFD0900802, 2018YFD0901405-2; China Agriculture Research System of MOF and MARA, No. CARS-49]
陳琳(1998—), 女, 湖南株洲人, 碩士研究生, 主要從事海水養(yǎng)殖生態(tài)相關研究, E-mail: 1163769119@qq.com; 肖國強(1978—),通信作者, E-mail: xiaogq1978@163.com
(本文編輯: 譚雪靜)