孫小涵，馬 鈺，黃凱悅，田彥梅，顧 欣

（寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021）

西瓜連作可導致土壤物理、化學和生物性質(zhì)發(fā)生變化，生產(chǎn)性能降低，還會引起土壤真菌化，尤其引起病原真菌數(shù)量增加，致使西瓜開花坐果后易發(fā)生枯萎病，造成西瓜產(chǎn)量、品質(zhì)下降，甚至絕收，產(chǎn)生嚴重的連作障礙[1]，而且枯萎病發(fā)病率有隨連作年限增長而增加的趨勢[2]。西瓜枯萎病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON），尤以溫室栽培和大棚種植環(huán)境易發(fā)病。

連作可導致作物根系分泌物在土壤中積累，分泌物達到一定濃度后會對植株產(chǎn)生毒害作用，這是引起連作障礙的主要因素之一[3—4]。其中，酚酸類物質(zhì)作為重要的化感物質(zhì)，一方面會降低土壤中某些養(yǎng)分的含量[5]，影響土壤中多種酶的活性[6]；另一方面會改變土壤微生物區(qū)系[7]。有研究表明，土壤酚酸的種類、濃度及無機養(yǎng)分與土壤微生物類群分布存在一定關系[8]。土壤中酚酸的累積可直接影響土壤的理化性質(zhì)，從而使土壤微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、生物量和活性發(fā)生改變，某些種類的微生物在數(shù)量及活性上顯著增加或趨于增長，同時另一些微生物則呈下降趨勢[9—10]。西瓜根系分泌物及其中的酚酸物質(zhì)對FON產(chǎn)孢、萌發(fā)及生長往往具有“低濃度促進，高濃度抑制”的作用規(guī)律，而水稻根系分泌物及其中的酚酸物質(zhì)則抑制FON產(chǎn)孢及萌發(fā)[11]。有研究表明，連作土壤中并存著多種酚酸類物質(zhì)，且酚酸類物質(zhì)之間存在互作效應[12]。如不同濃度水平的水楊酸分別對對羥基苯甲酸表現(xiàn)增效和拮抗作用。因此，連作環(huán)境中由酚酸物質(zhì)導致的化感作用是多種酚酸物質(zhì)共同作用的結(jié)果[13]。

將生防微生物引入綜合防控系統(tǒng)是重要且有效的方法之一[14]。目前，已獲得若干拮抗FON的菌株，并經(jīng)室內(nèi)試驗證明其對病原菌具有不同程度的拮抗作用[15—16]，部分菌株在田間的試驗也表現(xiàn)出較好的防效[17]。然而，筆者在應用菌劑中遇到了二個問題，一是某些生防菌株在室內(nèi)對峙培養(yǎng)試驗中具有較高抑菌率，而田間防效卻不盡如人意；二是相同生防菌劑在不同土壤環(huán)境中使用，防效具有差異。土壤微生物的生存及活性極易受環(huán)境因子的影響[18]。連作土壤中的酚酸類物質(zhì)與植株健康生長和土壤病原菌數(shù)量變化存在一定關系，但其對病原菌的拮抗菌及其功能的影響至今未見報道。本試驗在添加不同濃度鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸的條件下，比較FON和生防細菌菌落生長的情況，并通過對峙培養(yǎng)，研究不同外源酚酸對生防細菌拮抗FON性能的影響，以期為生防菌劑的應用研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試病原菌 西瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON）菌株由寧夏大學農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境教研室提供。

1.1.2供試拮抗菌 供試拮抗菌為商品菌劑，購自當?shù)剞r(nóng)資市場。含單一細菌-解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），有效活菌數(shù)500×108CFU/mL。

1.1.3培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基用于病原菌的培養(yǎng)和對峙試驗。

1.1.4試劑 供試鄰苯二甲酸由國藥集團化學試劑有限公司提供，對羥基苯甲酸和肉桂酸由北京索萊寶科技有限公司提供，阿魏酸由北京博奧拓達科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌活化與菌碟制備 在直徑為9.0 cm的PDA平板中央點接少量FON斜面培養(yǎng)物，28℃、相對濕度60%，倒置培養(yǎng)5~6 d，待菌落基本長滿平皿，于距平皿中心2.0 cm處用無菌打孔器打取直徑0.5 cm、菌絲生長狀態(tài)一致的菌碟備用。

1.2.2拮抗細菌對FON菌落生長的影響 以無菌水制備菌劑10倍、50倍和100倍稀釋液，室溫下?lián)u床振蕩混勻30 min，制成菌懸液。在PDA平板中央放置1個FON菌碟，以菌碟為中心距其邊緣2.0 cm處以十字對稱方式放置4個無菌牛津杯，每個杯中注入同一稀釋倍數(shù)菌懸液120μL，28℃恒溫培養(yǎng)24 h。此時菌懸液中大部分水分已蒸發(fā)，取走牛津杯，持續(xù)培養(yǎng)并于48、72和96 h時觀察菌落生長情況，使用游標卡尺測量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。在牛津杯內(nèi)注入120μL無菌水作為空白對照。每處理設5次重復。抑菌率計算公式：抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理后菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.2.3不同酚酸對FON菌落生長的影響 用無菌水制備質(zhì)量濃度為10、30和50 mg/L的鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸試劑，混合酚酸試劑中鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸和肉桂酸的質(zhì)量分數(shù)各占1/4。取酚酸試劑0.1 mL置于PDA培養(yǎng)基表面，用無菌三角棒均勻涂抹，靜置2~3 min，待其滲入培養(yǎng)基，制成酚酸平板。于酚酸平板中央放置1個FON菌碟，28℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)，分別于48、72和96 h時觀察菌落生長情況，測量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。以培養(yǎng)基表面加0.1 mL無菌水代替酚酸試劑為空白對照（CK1）。每處理設5次重復。

1.2.4不同酚酸對拮抗細菌菌落生長的影響 在酚酸平板中央?yún)^(qū)放置2個無菌牛津杯，二者相距4.0 cm，每個杯中注入同種菌劑的100倍稀釋液120μL，28℃恒溫培養(yǎng)，至24 h取走牛津杯，分別于48、72和96 h時觀察菌落生長情況，測量菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。以培養(yǎng)基上加0.1 mL無菌水代替酚酸試劑為空白對照（CK2）。每處理設5次重復。

1.2.5不同酚酸對生防細菌拮抗FON的影響 用30 mg/L的5種酚酸試劑制備相應的酚酸平板，方法同1.2.3。于酚酸平板中央放置1個FON菌碟，以菌碟為中心距其2.0 cm處以十字對稱方式分別放置4個無菌牛津杯，每個杯中注入同一稀釋倍數(shù)的菌懸液120μL，28℃恒溫培養(yǎng)，至24 h取走牛津杯，分別于48、72和96 h時觀察菌落生長情況，測量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)，以無菌水代替酚酸和菌劑為絕對對照，計算抑菌率。以培養(yǎng)基表面加0.1 mL無菌水代替酚酸試劑為空白對照（CK3）。每處理設5次重復。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本試驗數(shù)據(jù)采用microsoft excel 2010處理及制作圖表；方差分析采用SPSS；利用LSD法在P＜0.05水平上進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細菌對FON菌落生長的影響

由圖1可知，供試菌劑對FON具有拮抗作用，抑菌率隨著菌劑稀釋倍數(shù)的增大而降低。培養(yǎng)48、72和96 h時，與10倍稀釋液的抑菌率比較，菌劑50倍稀釋液的抑菌率分別降低3.62%、2.98%和1.02%，100倍稀釋液的抑菌率分別降低6.72%、3.64%和1.28%。這說明菌劑對病原菌的抑制率隨稀釋倍數(shù)增加而減小，稀釋10倍處理的抑菌率顯著高于稀釋100倍處理；隨著培養(yǎng)時間的增長，各稀釋倍數(shù)處理間抑菌率的差異呈降低趨勢。

圖1 不同稀釋倍數(shù)的拮抗菌劑對FON的抑菌率

2.2 不同酚酸對FON菌落生長的影響

由表1可知，在試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同酚酸處理均對FON菌落生長具有促進作用，且該作用隨酚酸質(zhì)量濃度增加而增強。隨著培養(yǎng)時間的增長，不同酚酸對FON菌落直徑的促進作用發(fā)生了變化。50 mg/L不同酚酸處理對FON菌落生長的促進作用如下：培養(yǎng)48 h時由強到弱依次為鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、混合酚酸、阿魏酸、肉桂酸，菌落直徑較CK分別增加了3.74%、3.54%、2.77%、2.36%和2.21%；培養(yǎng)72 h時強弱依次為混合酚酸、阿魏酸、肉桂酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸；培養(yǎng)96 h時強弱依次為肉桂酸、混合酚酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、阿魏酸。培養(yǎng)48 h，同一酚酸組中50 mg/L處理對菌落直徑的促進作用顯著高于10 mg/L處理，鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、混合酚酸、阿魏酸和肉桂酸的增幅分別為2.95%、2.18%、1.88%、1.79%和0.81%。隨著培養(yǎng)時間的增長，該差異逐漸縮小，至96 h時差異無顯著性。

表1 不同酚酸對FON菌落直徑的影響

2.3 不同酚酸對生防細菌菌落生長的影響

拮抗菌株是生防菌劑的核心成分，作為微生物活體，其生長受到不同酚酸的影響。如表2所示，不同酚酸對生防細菌菌落的生長具有顯著抑制作用，抑制強度因酚酸種類而不同，并隨著酚酸質(zhì)量濃度增加而增強。50 mg/L不同外源酚酸對生防細菌菌落生長的抑制作用如下：培養(yǎng)48 h時由強到弱依次為鄰苯二甲酸、混合酚酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸，菌落直徑較CK分別減少了18.82%、18.68%、17.24%、16.71%和15.13%；培養(yǎng)72和96 h時強弱依次為混合酚酸、鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸。培養(yǎng)初期，50 mg/L鄰苯二甲酸、肉桂酸和混合酚酸對生防細菌菌落直徑的抑制作用顯著高于10 mg/L相應酚酸處理，培養(yǎng)時間至72、96 h差異幅度縮減至無顯著性。50 mg/L混合酚酸處理的菌落直徑均為各組最低水平，48、72和96 h菌落直徑與CK相比降幅為18.68%、14.64%和14.64%。

表2 不同酚酸對生防細菌菌落直徑的影響

2.4 不同酚酸對生防細菌拮抗FON的影響

由圖2可知，在外源酚酸環(huán)境中，生防細菌仍對FON表現(xiàn)出拮抗性，抑菌率隨著菌劑稀釋倍數(shù)的增加而降低。添加不同酚酸顯著降低菌劑對FON的抑菌率，48 h時與CK比較，不同酚酸處理下菌劑的10、50和100倍稀釋液的抑菌率分別下降16.94%~21.23%、18.27%~25.32%和23.79%~28.19%。30 mg/L酚酸處理下，肉桂酸對菌劑100倍稀釋液拮抗性的影響最大，抑菌率僅為19.23%，較CK降低了28.19%；混合酚酸對菌劑10倍稀釋液拮抗性的影響最小，抑菌率為23.85%，較CK降低了16.94%（圖2-a）。如圖2-b和2-c所示，隨著培養(yǎng)時間的增長，各處理的抑菌率進一步提高，但相同時間內(nèi)的增幅逐漸減小，抑菌率與CK的差距縮小。至96 h時，除CK和阿魏酸，各菌劑不同稀釋倍數(shù)處理間的抑菌率差異不顯著。CK3組10倍稀釋液的抑菌率始終顯著高于50和100倍稀釋液。阿魏酸組10倍稀釋液的抑菌率始終顯著高于100倍稀釋液。

圖2 不同酚酸處理下不同稀釋倍數(shù)菌劑對FON的抑制率

3 結(jié)論與討論

3.1 不同酚酸對FON菌落生長的影響不同

土壤中的酚酸類物質(zhì)多源于植物的根系代謝分泌和植株殘體分解，其中多種酚酸處于一定濃度范圍可促進FON的菌絲生長及產(chǎn)孢[11]，同時考慮到耕作層土壤中單一酚酸濃度多處于較低水平，故本試驗采用的酚酸質(zhì)量濃度為10~50 mg/L。郝文雅等[11]研究酚酸類物質(zhì)對FON的影響，認為阿魏酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸對FON孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢具有促進作用，且阿魏酸的促進作用較為突出。本試驗結(jié)果表明，10~50 mg/L的鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對FON菌落的生長均具有促進作用。培養(yǎng)初期50 mg/L酚酸處理的菌落直徑顯著大于低質(zhì)量濃度處理，且阿魏酸對FON菌落的促生長作用顯著低于其他酚酸。隨著培養(yǎng)時間的增長，酚酸類物質(zhì)作為有機營養(yǎng)物可被微生物所消耗[19]，培養(yǎng)至96 h時，該試驗環(huán)境中部分酚酸可能已被降解，各處理的FON菌落直徑無顯著差異。

3.2 不同酚酸對拮抗菌菌落生長的影響不同

試驗采用細菌型生防菌劑。由于細菌的最適pH值范圍一般為弱堿性，故外源添加酚酸造成環(huán)境pH值降低，不利于細菌的生長。試驗結(jié)果表明，鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對生防細菌生長均具有抑制作用，至72、96 h時已無顯著差異。培養(yǎng)至96 h，阿魏酸對生防細菌生長的抑制作用最低。值得注意的是，較高質(zhì)量濃度的混合酚酸對生防細菌菌落生長的抑制作用處于最高水平（除鄰苯二甲酸對菌劑10倍稀釋液處理外），這說明混合酚酸較相同質(zhì)量濃度的單一酚酸對生防細菌生長的抑制作用更強。土壤中共存多種酚酸類物質(zhì)，且連作土壤的酚酸含量高于非連作土壤[20]，因此連作土壤中酚酸的積累必然影響生防細菌的生物活性。

3.3 不同酚酸對菌劑拮抗FON能力的影響不同

生防菌劑中拮抗菌的數(shù)量與稀釋倍數(shù)成反比，因此無論環(huán)境中是否有酚酸，抑菌率均隨著稀釋倍數(shù)的增加而減小。外源添加一定質(zhì)量濃度的酚酸類物質(zhì)，對FON和生防細菌菌落的生長分別具有顯著促進作用和抑制作用，導致生防菌劑對FON的抑菌率顯著降低。在培養(yǎng)初期（48 h），環(huán)境中的酚酸含量較高，抑菌率顯著下降，最高降幅達28.19%。隨著培養(yǎng)時間的增長，可能由于環(huán)境中的酚酸逐漸被菌體消耗，質(zhì)量濃度下降，其對抑菌率的影響也逐漸減小，直到與CK無顯著性差異。至培養(yǎng)后期（96 h），阿魏酸對FON的促生長作用及其對生防菌生長的抑制作用均為最弱，故不同稀釋倍數(shù)菌劑的抑菌率差異較大，與CK相似。一般而言，有機酸分子量越大，越不易被降解。阿魏酸是試驗中分子量最大的酚酸，可能由此導致其對微生物的作用較弱。值得關注的是，混合酚酸對生防細菌生長的抑制作用最強，但在生防細菌與FON對峙培養(yǎng)的初期，雖然顯著降低了生防細菌的抑菌率，但對其影響的強度卻不及其他酚酸處理?？赡苁怯捎诓煌铀嶂g的互作效應不同[13]，以及微生物對各種酚酸的敏感度和代謝差異導致了該結(jié)果。

鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對FON的生長具有促進作用，對其生防細菌的生物活性具有抑制作用，從而導致酚酸環(huán)境中生防細菌對FON的拮抗性下降，且菌劑稀釋倍數(shù)越大，受酚酸影響越嚴重，下降幅度越大。混合酚酸對生防細菌的抑制作用較相同質(zhì)量濃度的單一酚酸更強。因此，在酚酸積累的環(huán)境如連作土壤或基質(zhì)中施用細菌型生防菌劑，應適當降低菌劑的稀釋倍數(shù)，有利于生防菌株對病原菌的拮抗性保持在較高水平。