羅婷婷 孫祥靈 趙昆 段國梅 李土桂 何秋星

中國素有“一白遮三丑”的審美觀念，追求“膚如雪，凝如脂”歷來是中國女性關注的熱點話題。目前，大多數(shù)美白劑的美白作用機制主要通過抑制酪氨酸酶活性、阻斷黑色素合成過程、加速黑色素角質細胞脫落、抑制黑色素向角質細胞遷移、清除自由基等方面來改善皮膚黑色素沉著、膚色暗沉等問題[1-2]。因此，美白型護膚品在化妝品領域的研究中具有較為廣闊的市場和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

實驗部分

01試劑與儀器

煙酰胺、熊果苷、維生素C、凝血酸、光甘草啶、谷胱甘肽、白藜蘆醇，廣州品赫生物技術有限公司;FeSO4、水楊酸，天津市福晨化學試劑廠;三羥甲基氨基甲烷，上海潤捷化學試劑有限公司;DPPH、鄰苯三酚、酪氨酸酶，上海寶曼生物科技有限公司;B16小鼠黑色素瘤細胞株，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院;DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清，美國Gbico公司;DMSO、MTT、TritonX-100，美國MPBiomedicals公司。

UV-2600，CH紫外分光光度計，島津公司;SC-3610低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司;二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，上海圣科儀器設備有限公司;InfiniteM200PRO酶標儀，帝肯貿易有限公司。

02實驗方法

2.1單因素試驗

將維生素C（0.10、0.12、0.14、0.16、0.18mg/mL）、白藜蘆醇（0.04、0.08、0.12、0.15、0.20mg/mL）、谷胱甘肽（0.03、0.05、0.08、0.10、0.12mg/mL）、光甘草叮（0.05、0.08、0.10、0.12、0.15mg/mL）、凝血酸（0.02、0.05、0.08、0.12、0.14mg/mL）、熊果苷（0.25、0.30、0.35、0.40、0.45mg/mL）和煙酰胺（0.14、0.16、0.18、0.20、0.25mg/mL）分別以DPPH自由基清除率為指標，考察7種美白原料的濃度對DPPH自由基的抗氧化作用，根據(jù)其結果篩選出對DPPH自由基清除效果最好的3種美白原料，其為組合1。

將維生素C（0.05、0.10、0.16、0.18、0.20mg/mL）、白藜蘆醇（0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg/mL）、谷胱甘肽（0.10、0.12、0.14、0.17、0.20mg/mL）、光甘草叮（0.10、0.12、0.14、0.18、0.20mg/mL）、凝血酸（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL）、熊果苷（0.08、0.15、0.20、0.30、0.40mg/mL）和煙酰胺（0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mg/mL）分別以羥自由基清除率為指標，考察7種美白原料的濃度對羥自由基的抗氧化作用，根據(jù)其結果篩選出對羥自由基清除效果最好的3種美白原料，其為組合2。

將維生素C（0.05、0.08、0.12、0.16、0.18mg/mL）、白藜蘆醇（0.15、0.25、0.35、0.45、0.50mg/mL）、谷胱甘肽（0.10、0.15、0.20、0.25、0.35mg/mL）、光甘草叮（0.10、0.12、0.14、0.18、0.20mg/mL）、凝血酸（0.08、0.10、0.20、0.30、0.40mg/mL）、熊果苷（0.08、0.15、0.20、0.30、0.40mg/mL）和煙酰胺（0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mg/mL）分別以超氧自由基清除率為指標，考察7種美白原料的濃度對超氧自由基的抗氧化作用，根據(jù)其結果篩選出對超氧自由基清除效果最好的3種美白原料，其為組合3。

2.2正交試驗

根據(jù)2.1的單因素試驗結果，確定3組實驗方案的L9（34）正交試驗，以清除率作為指標，確定3種復配原料的最佳配比，具體實驗安排見表1、表2、表3。全文以下簡稱DPPH自由基清除試驗為組合1、羥自由基清除試驗為組合2、超氧自由基清除試驗為組合3。

2.3抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除試驗的測定方法[3]。用50%乙醇的配制DPPH溶液（0.2mmol/L），精密移取表4中各組反應液于5mLEP管中，混合后充分搖勻，避光反應30min后，置于517nm處測定其吸光度，平行實驗3次，計算其清除率。DPPH自由基清除率（%）=1-（Ai-Aj）/Ao×100%

羥自由基清除試驗的測定方法[3]。分別配制9.0mmol/LFeSO4溶液、9.0mmol/L水楊酸乙醇溶液、8.8mmol/LH2O2溶液。精密移取表5中各組反應液于5mLEP管中，混合后充分搖勻，再加入H2O2溶液，于37℃下反應30min，置于510nm處測定吸光度，平行實驗3次，計算其清除率。羥自由基清除率（%）=1-（Ai-Aj）/Ao×100%

（3）超氧陰離子自由基清除試驗的測定方法[4]。取Tris-HCl緩沖液3mL與去離子水2.8mL混勻，記為1管;取Tris-HCl緩沖液3mL，去離子水1.8mL與樣液1mL混勻，記為2管。25℃下反應20min，再分別加入鄰苯三酚0.2mL，于319nm處每30s測一次，連續(xù)測4min后測定1、2管吸光度，記為△A1、△A2，平行實驗3次，計算清除率。清除率（%）=1-（△A2/△A1）×100%

2.4酪氨酸酶活性抑制率測定試驗

酪氨酸酶抑制率的測定方法[5]。

2.5B16細胞活性測定

取對數(shù)期生長的B16細胞，調整細胞濃度為3×104個/mL接種于96孔板中，每孔加入培養(yǎng)基100μL，置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)24h。待細胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)基，實驗組分別加入用培養(yǎng)基將0.03g/mL和0.06g/mL的樣液進行等濃度梯度稀釋成不同倍數(shù)的培養(yǎng)基100μL，對照組加入不含樣液的等體積培養(yǎng)基100μL，空白組加入無細胞的培養(yǎng)基100μL，同時設置陽性對照組含熊果苷（0.1mg/mL）、煙酰胺（0.3mg/mL）的培養(yǎng)基稀釋液100μL，每組設置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)結束前4h，每孔加入5mg/mLMTT溶液100μL，4h后吸出上清液，每孔避光加入DMSO50μL，振蕩10min，置于酶標儀測定490nm處的吸光度，取平均值，計算細胞活力。細胞活力（%）=（A樣品組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%

2.6B16細胞內黑色素含量測定

取對數(shù)生長期細胞接入6孔培養(yǎng)板，每孔加入培養(yǎng)基1mL，置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)24h。吸棄上清液，加入不同濃度的樣液，處理同2.5，每孔加入1mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用PBS緩沖沖洗，吸出上清液。然后每孔加入0.2mol/L的NaOH溶液1mL，80℃恒溫水浴保溫1h，置于酶標儀測定405nm處的吸光度，取平均值，計算黑色素的相對含量。黑色素相對含量（%）=（A樣品組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%

03數(shù)據(jù)分析

試驗中每組重復3次，取其平均值。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS25進行統(tǒng)計學分析，采用Origin2018進行繪圖。

04單因素試驗結果

4.1DPPH自由基清除試驗結果及分析

由表6可知，通過比較七種美白劑對DPPH清除率試驗結果表明，清除率最高的為谷胱甘肽，當其濃度為0.05mg/mL，其清除率為75.6%，還原型的谷胱甘肽是由3個氨基酸組成的三肽，其結構中的半胱氨酸殘基通過提供電子以達到清除自由基的作用[6，7];次之為光甘草啶，當其濃度為0.15mg/mL時，其清除率為83.2%，光甘草啶為黃酮類化合物，可能是其結構中的酚羥基提供活潑氫質子，能夠有效降低自由基的氧化作用[8，9];其次為白藜蘆醇，當其濃度為0.15mg/mL時，其清除率為71.8%，有研究表明白藜蘆醇可通過與自由基反應阻止自由基進一步鏈式反應，同時亦可抑制二硫化谷胱甘肽的形成，從而抑制自由基的生成[10，11]。即通過DPPH的清除率初步篩選出組合1的3種原料為：谷胱甘肽、光甘草啶和白藜蘆醇。

4.2羥自由基清除實驗結果及分析

由表7可知，通過比較7種美白劑對羥自由基清除率試驗結果表明，清除率相對較高的為維生素C，當其濃度為0.18mg/mL時，其清除率高達88.7%，可能原因是含有多個酚羥基的維生素C可以捕獲自由基反應鏈中的過氧自由基，阻止自由基鏈反應，從而清除·OH、·O2-等自由基[7，12];次之為凝血酸，當其濃度為0.06mg/mL，其清除率高達92.1%，凝血酸作為一種蛋白酶抑制劑，能夠抑制酪氨酸酶以及黑色素細胞的活性;再次之為白藜蘆醇，當其濃度為0.06mg/mL時，其清除率為64.1%。即通過羥自由基的清除率初步篩選出組合2的3種原料為：凝血酸、維生素C和白藜蘆醇。

4.3超氧陰離子自由基清除試驗結果及分析

由表8可知，通過比較7種美白劑對超氧自由基清除率試驗結果表明，維生素C、白藜蘆醇和谷胱甘肽的超氧自由基清除率相對較高。當維生素C的濃度為0.18mg/mL，其清除率為98.5%;白藜蘆醇的濃度為0.45mg/mL時，其清除率為94.5%;谷胱甘肽的濃度為0.35mg/mL時，其清除率為86.3%。即通過超氧自由基的清除率初步篩選出組合3的3種原料為：維生素C、白藜蘆醇和谷胱甘肽。

05正交試驗結果與分析

5.1組合1正交試驗

由表9可知，組合1中3種復配原料對DPPH自由基清除率的影響效果順序為白藜蘆醇>谷胱甘肽>光甘草啶，最佳組合為A3B1C1，即白藜蘆醇：谷胱甘肽：光甘草啶=0.17：0.03：0.10。通過3次驗證實驗測定最佳組合A3B1C1的DPPH自由基清除率分別為68.86%、70.25%、70.08%，其平均值為69.73%。然而當白藜蘆醇：谷胱甘肽：光甘草啶=0.13：0.03：0.10時，其清除率達到73.14%，高于最佳組合A3B1C1的DPPH自由基清除率。由此可得，在組合1中3種原料的復配比例為白藜蘆醇：谷胱甘肽：光甘草啶=0.13：0.03：0.10。

5.2組合2正交試驗

由表11可知，組合2中3種復配原料對羥自由基清除率的影響效果順序為凝血酸>白藜蘆醇>維生素C，最佳組合為A2B2C1，即白藜蘆醇：維生素C：凝血酸=0.06：0.18：0.04，正交試驗模型模擬的最佳組合A2B2C1與實驗組7結果一致，其羥自由清除率為95.31%。由此可得，在組合2中3種原料的復配比例為白藜蘆醇：維生素C：凝血酸=0.06：0.18：0.04。

5.3組合3正交試驗

由表13可知，組合3中3種復配原料對超氧自由基清除率的影響效果順序為維生素C>谷胱甘肽>凝血酸，最佳組合為A2B1C3，即凝血酸：谷胱甘肽：維生素C=0.45：0.32：0.20。通過3次驗證實驗測定最佳組合A2B1C3的超氧自由基清除率分別為89.50%、88.77%、90.26%，其平均值為89.51%。然而當凝血酸：谷胱甘肽：維生素C=0.38：0.35：0.20時，其清除率達到92.56%，高于最佳組合A2B1C3的超氧自由基清除率。由此可得，在組合3中3種原料的復配比例為凝血酸：谷胱甘肽：維生素C=0.38：0.35：0.20。

06美白功效綜合評價

將3種組合再進行酪氨酸酶活性抑制試驗、DPPH自由基清除試驗、羥自由基清除試驗、超氧陰離子自由基清除試驗，結果如表15所示，組合2對酪氨酸酶活性的抑制能力、DPPH自由基清除能力以及羥自由基清除能力皆最高，分別為89.61%、94.03%、95.31%;組合1對超氧自由基清除能力最高，其清除率為92.56%。通過綜合評價分析，確定組合2為最佳美白劑復配組合，即白藜蘆醇：維生素C：凝血酸=0.06：0.18：0.04時，其美白綜合效果最好。

07B16細胞試驗結果與分析

7.1B16細胞活性試驗

由圖1可知，質量濃度為0.03g/mL、0.06g/mL的組合2的B16細胞活性試驗中，當質量濃度為0.03×10-16g/mL的組合2時，其對B16細胞活力與陽性對照組熊果苷、煙酰胺無顯著性差異（P>0.05），而質量濃度為0.06×10-8g/mL的組合2時，對細胞活力有顯著性抑制作用（P<0.05），表明該濃度對細胞毒性相對較大。

7.2B16細胞黑色素相對含量試驗

由圖2可知，質量濃度為0.03×10-16g/mL與0.06×10-8g/mL對B16細胞黑色素的生成具有一定的抑制作用，在統(tǒng)計學上具有顯著性差異（P<0.05）。當組合2的質量濃度為0.06×10-8g/mL時，其抑制率為3.77%，低于陽性對照組熊果苷（39.35%）、煙酰胺（41.24%），其抑制黑色素合成的效果相對較差;而質量濃度為0.03×10-16g/mL，其抑制率為35.04%，略低于陽性對照組，表明該濃度對B16細胞有顯著的抑制黑色素合成的能力。

結論

本文通過對7種不同美白劑原料進行復配研究，采用單因素試驗、正交試驗以及綜合評價，優(yōu)選最佳美白復配組合，通過B16細胞試驗評價美白復配組合的美白功效，得到以下結論：

1.單因素試驗通過測定DPPH自由基、羥自由基以及超氧自由基的清除率，優(yōu)選出3組美白組合，分別為組合1（谷胱甘肽、光甘草啶、白藜蘆醇）、組合2（凝血酸、維生素C、白藜蘆醇）、組合3（維生素C、白藜蘆醇、谷胱甘肽）。

2.正交試驗優(yōu)選其3組美白組合的最佳復配比例，分別為組合1=0.13：0.03：0.10、組合2=0.06：0.18：0.04、組合3=0.38：0.35：0.20。

3.通過綜合評價3組美白組合的酪氨酸酶活性抑制率以及3種自由基清除率，最終優(yōu)選組合2為最佳美白組合。

4.B16黑色素瘤細胞試驗表明，質量濃度為0.03×10-16g/mL時，其抑制黑素色合成的能力相對較好。