COX-2 和 PTEN 在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及相關(guān)性研究

陳曦，費(fèi)靜，劉蘭，李雷激

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，四川 瀘州 646000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院 耳鼻咽喉科，重慶 404100)

中耳膽脂瘤是耳外科常見的疾病之一，是一種良性的鱗狀上皮角質(zhì)化增生性病變。中耳膽脂瘤具有類似腫瘤的侵襲性生長、破壞骨質(zhì)、復(fù)發(fā)等特性。關(guān)于中耳膽脂瘤的患病機(jī)制有多種學(xué)說，但仍不能完全解釋其具有的獨(dú)特生物學(xué)特性。

COX-2又稱前列腺素過氧化物合成酶，是催化花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵酶，在大部分正常組織中通常不存在或表達(dá)水平很低，在炎癥和腫瘤中呈高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖及轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和腫瘤血管形成。

PTEN

基因位于10q23.3染色體上，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有磷酸酶活性的抑癌基因，編碼具有403個氨基酸的同名蛋白。PTEN同時具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性，在抑制腫瘤細(xì)胞的生長、遷移、侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡具有重要作用。目前COX-2和PTEN的相關(guān)研究主要集中在惡性腫瘤，在中耳膽脂瘤中的研究報道極少。

本研究通過免疫組化和 Western blot 兩種方法來檢測COX-2和 PTEN在中耳膽脂瘤中的表達(dá)，探討二者在中耳膽脂瘤產(chǎn)生過程中所發(fā)揮的作用以及二者的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

收集2018年5月—2019年4月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科手術(shù)并經(jīng)病理診斷的中耳膽脂瘤標(biāo)本35例，其中男21例，女14例；年齡23～68歲，病程1～24年；中耳肉芽標(biāo)本20例，男9例，女11例；年齡17～78歲，病程3個月至35年。隨機(jī)收集上述患者的外耳道正常皮膚10例作為對照組，其中男6例，女4例；年齡35～69歲，病程2～18年。本實(shí)驗(yàn)患者簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化檢測 將各組織石蠟塊切片，二甲苯脫離，梯度乙醇水化。依次經(jīng)過高溫抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清工作液封閉。加入一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，每次3 min。加入二抗，37 ℃條件下孵育20 min，PBS清洗3次，每次3 min。加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素反應(yīng)液，37 ℃條件下孵育20 min，PBS清洗3次，每次3 min。室溫下DBA顯色15 min，蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染2 min，PBS沖洗。最后依次脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果判讀：以細(xì)胞漿內(nèi)和/或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色為陽性，染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)以華特波等方法按染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽性百分率兩項(xiàng)共同判斷，隨機(jī)選擇5個高倍鏡視野(400×)計(jì)分：①無染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；②細(xì)胞陽性百分率<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分，兩者之和：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，2～4分中等陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性(+++)。每張切片于400倍高倍鏡下隨機(jī)選取5個陽性染色區(qū)域，分別測定其平均光密度值，取平均值作為標(biāo)本測量的結(jié)果。

1.2.2 Western blot檢測 向研磨成粉的組織中加入裂解液，裂解組織30 min，4 ℃下12 000 rpm離心10 min，收集上清，使用BCA法測定濃度。100 ℃煮10 min使蛋白變性，-20 ℃保存。配制10%的分離膠，5%的濃縮膠，SDS-PAGE電泳分離蛋白(分離膠120 V電泳1 h，濃縮膠60 V電泳30 min)。濕轉(zhuǎn)的方式使蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下5%的脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次5 min。加入稀釋好的二抗在室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光液發(fā)光，拍照、保存。用Image J軟件處理圖片，以目的條帶與內(nèi)參(GAPDH)條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較，并進(jìn)一步采用LSD-

t

和SNK檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。以

P

<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化

COX-2陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)。COX-2在中耳膽脂瘤組染色呈強(qiáng)陽性染色，陽性細(xì)胞主要位于基底層；COX-2在中耳肉芽組呈強(qiáng)陽性表達(dá),主要分布在新生的毛細(xì)血管及周圍浸潤的炎性細(xì)胞；COX-2在對照組呈弱陽性表達(dá)。見圖1。中耳膽脂瘤組COX-2的平均光密度表達(dá)量高于中耳肉芽組及對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)；中耳肉芽組中COX-2的平均光密度表達(dá)量高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見圖2。

圖1 各組中COX-2免疫組化染色結(jié)果 1A:COX-2在中耳膽脂瘤中呈強(qiáng)陽性表達(dá) (SP ×400)；1B:COX-2在中耳肉芽中呈中度陽性表達(dá) (SP ×400)；1C:COX-2在對照組呈弱陽性表達(dá) (SP ×400) 圖2 各組中COX-2的平均光密度 注：與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與中耳肉芽組比較，##P<0.01。 圖3 各組中PTEN免疫組化染色結(jié)果 3A:PTEN在中耳膽脂瘤中呈弱陽性表達(dá) (SP ×400)；3B:PTEN在中耳肉芽組呈中等強(qiáng)度陽性表達(dá) (SP ×400)；3C:PTEN在對照組呈強(qiáng)陽性表達(dá) (SP ×400) 圖4 各組中PTEN的平均光密度 注：與對照組比較，***P<0.001；與中耳肉芽組比較，##P<0.01。 圖5 各組中COX-2和PTEN的Western blot蛋白檢測結(jié)果 5A：各組中COX-2和PTEN的Western blot條帶，GAPDH為內(nèi)參；5B：各組中COX-2的相對表達(dá)；5C：各組中PTEN的相對表達(dá) 注：與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與中耳肉芽組比較，##P<0.01，###P<0.001。

PTEN陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核。PTEN在中耳膽脂瘤組中呈弱陽性染色，陽性細(xì)胞主要位于基底層；PTEN在中耳肉芽組中呈中等強(qiáng)度陽性染色，陽性細(xì)胞散在分布在新生的毛細(xì)血管及周圍的炎性細(xì)胞中；PTEN在對照組中呈強(qiáng)陽性染色，陽性細(xì)胞主要分布在上皮細(xì)胞的基底層和基底上細(xì)胞層。見圖3。中耳膽脂瘤組中PTEN的平均光密度表達(dá)量低于中耳肉芽組和對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)；但中耳肉芽組中PTEN的平均光密度表達(dá)量與對照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

P

>0.05)。見圖4。

2.2 Western blot

中耳膽脂瘤組COX-2表達(dá)高于中耳肉芽組和對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)；中耳肉芽組COX-2表達(dá)高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。中耳膽脂瘤組PTEN表達(dá)低于中耳肉芽組和對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001；

P

<0.001)；但中耳肉芽組中PTEN表達(dá)與對照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

P

>0.05)。見圖5。

2.3 COX-2與PTEN在中耳膽脂瘤組中的相關(guān)性分析

通過Pearson相關(guān)性分析對以上數(shù)據(jù)分析，中耳膽脂瘤組中COX-2和PTEN的免疫及蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(

P

<0.05)。見圖6、7。

圖6 COX-2與PTEN免疫組化結(jié)果相關(guān)性散點(diǎn)圖 圖7 COX-2與PTEN Western blot結(jié)果相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

中耳膽脂瘤侵襲性生長可破壞周圍骨質(zhì)，引起如化膿性腦膜炎、乙狀竇血栓性靜脈炎、面癱、迷路炎等多種顱內(nèi)外并發(fā)癥，嚴(yán)重時可危及患者的生命。但由于中耳膽脂瘤具體致病機(jī)制復(fù)雜，至今未明確。近年研究方向主要集中在細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等方面，此次也從以上方面入手，旨在通過相關(guān)途徑的研究進(jìn)一步探討中耳膽脂瘤的致病機(jī)制。

3.1 COX-2與中耳膽脂瘤

COX-2由癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)釋放，能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡抵抗、增殖、血管生成、炎癥、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2通過調(diào)節(jié)包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在內(nèi)的多種血管生長因子調(diào)控腫瘤新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤的生長。VEGF被廣泛認(rèn)為是血管生成的主要誘導(dǎo)因子，在新生血管形成和促進(jìn)血管通透性增加中有重要作用。典型的肉芽組織主要由增生的成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管和炎性細(xì)胞(白細(xì)胞)浸潤共同組成。本研究結(jié)果顯示：在中耳肉芽組織中COX-2表達(dá)增加，且主要位于毛細(xì)血管及炎性細(xì)胞中，提示COX-2過表達(dá)可通過促進(jìn)新生血管形成參與中耳肉芽組織的形成。COX-2的過表達(dá)能上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，Bcl-2蛋白能抑制Caspase凋亡通路，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的生長。Jeong等研究發(fā)現(xiàn)，COX-2可產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9，MMP-9)，MPP-9可以裂解多種細(xì)胞外基質(zhì)，在癌細(xì)胞侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果顯示，與正常外耳道皮膚相比，COX-2在中耳膽酯瘤中明顯高表達(dá)，提示COX-2高表達(dá)可能通過抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)毛細(xì)血管的生成及骨質(zhì)的破壞參與了中耳膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展。

3.2 PTEN與中耳膽脂瘤

PTEN研究發(fā)現(xiàn)，PTEN低表達(dá)或表達(dá)缺失與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、結(jié)腸癌和子宮內(nèi)膜癌等。本研究結(jié)果顯示相對于正常外耳道皮膚，PTEN在膽脂瘤上皮中表達(dá)量明顯降低，提示PTEN的低表達(dá)可能在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。劉東亮等研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在中耳膽脂瘤中的表達(dá)低于正常皮膚組織，考慮PTEN與膽脂瘤上皮的高度增殖和抗凋亡密切相關(guān)。與本研究不同，汪欣等發(fā)現(xiàn)，PTEN在膽脂瘤上皮與外耳道皮膚的表達(dá)無顯著差異，作者認(rèn)為PTEN是維持膽脂瘤上皮細(xì)胞正常生理狀態(tài)而不是引起上皮細(xì)胞的異常增殖。殷團(tuán)芳等研究發(fā)現(xiàn)在膽脂瘤上皮和正常外耳道皮膚中，PTEN陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，且與正常外耳道皮膚比較，膽脂瘤上皮中PTEN呈明顯低表達(dá)，本研究結(jié)果與其一致。

磷脂酰肌-3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)信號通路是體內(nèi)參與細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要代謝通路。PTEN是PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)控因子，通過磷酸化3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，降低細(xì)胞內(nèi)PIP3水平，抑制PI3K和Akt異常激活，阻斷所有受Akt信號調(diào)節(jié)的下游通路,從而抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)PTEN表達(dá)降低，PI3K/Akt通路激活，從而增加Akt的表達(dá),Akt通過多種途徑使細(xì)胞凋亡因子失活與增加抗凋亡蛋白的活性。有研究發(fā)現(xiàn)，沉默人角質(zhì)形成細(xì)胞的

PTEN

基因后，角質(zhì)形成細(xì)胞將出現(xiàn)類似中耳膽脂瘤樣的異常增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常外耳道皮膚相比，中耳膽脂瘤中PTEN的表達(dá)明顯降低。我們推測在中耳膽脂瘤形成過程中，PTEN低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和抗凋亡，PI3K/Akt作為信號通路參與了這一過程。

3.3 COX-2與PTEN的相互作用

本研究顯示在中耳膽脂瘤中COX-2與PTEN表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，同樣的結(jié)果也在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌中報道。目前尚無COX-2和PTEN在中耳膽脂瘤相關(guān)性的研究。Chang等發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中COX-2過表達(dá)能靶向降低PTEN的表達(dá)，而使用COX-2抑制劑后，PTEN表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率增加，侵襲和增殖能力顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，抑制Akt活性時，COX2表達(dá)下降，上調(diào)Akt活性時，COX-2表達(dá)增加，提示Akt可調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)。PI3K/Akt信號可被PTEN負(fù)調(diào)控，而COX-2是PI3K/Akt信號通路的下游靶點(diǎn)信號之一。推測在中耳膽脂瘤的形成過程中，PTEN與COX-2可能通過PI3K/Akt信號通路相互調(diào)控，抑制膽脂瘤上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)膽脂瘤上皮的增殖和侵襲，從而導(dǎo)致中耳膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展。綜上，PTEN的低表達(dá)和COX-2的過表達(dá)與中耳膽脂瘤的發(fā)病有密切關(guān)系。二者在中耳膽脂瘤中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可能通過PI3K/Akt信號通路相互調(diào)控，但二者之間具體的調(diào)控機(jī)制，尚需我們進(jìn)一步研究。