王梅，龔正鵬，于明，梁東

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 貴陽 550014)

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其中96%～98%為喉鱗狀細(xì)胞癌。在全球范圍內(nèi)，喉癌的發(fā)病率和死亡率分別為2.76/10和1.66/10，嚴(yán)重威脅了人類的健康。雖然近年來對喉癌的研究取得了一定的成果，但其發(fā)病機(jī)制和病因仍不清楚。目前喉癌的治療主要以手術(shù)治療為主，放療、化療、生物治療及免疫治療為輔。盡管采取了多種策略和干預(yù)措施，晚期喉癌患者的5年總生存率仍不理想。因此，更好地了解與其進(jìn)展相關(guān)的分子機(jī)制對于開發(fā)有效的抗喉癌治療方案至關(guān)重要。近年來隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)circRNA在腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本文復(fù)習(xí)國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，就circRNA在喉癌中的可能作用機(jī)制綜述如下。

1 circRNA的形成

1976年，Sanger等在RNA病毒中首次發(fā)現(xiàn)circRNA。circRNA最初被認(rèn)為是細(xì)胞異常剪接的非功能性副產(chǎn)品。隨后有研究者發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸中性別決定區(qū)域

Y

基因的circRNA具有可能的功能。接著有研究者在不同物種的真核生物的細(xì)胞質(zhì)中也證實(shí)了circRNA的存在。直到2012年，由于高通量測序的進(jìn)展，大量的circRNA被不斷的發(fā)現(xiàn)和鑒定。

RNA選擇性剪接是真核細(xì)胞中一種基本的基因表達(dá)事件。前體mRNA由剪接體去除內(nèi)含子，然后與編碼蛋白質(zhì)的外顯子連接，形成成熟的mRNA。與典型的mRNA剪接不同，circRNA是通過反向剪接過程產(chǎn)生的，該過程將下游的5’剪接供體位點(diǎn)與上游的3’剪接受體位點(diǎn)連接起來，形成單鏈共價閉合環(huán)。然后，剪接體移除全部或部分內(nèi)含子，其余序列連接。按其結(jié)構(gòu)域的不同，circRNA可分為4類：外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、外顯子-內(nèi)含子circRNA和基因間circRNA。外顯子circRNA是最常見的circRNA類型，占已知circRNA的80%以上。目前有3種假說模型來解釋外顯子circRNA的形成：①套索驅(qū)動的環(huán)化：供體位點(diǎn)的下游5’剪接位點(diǎn)與受體位點(diǎn)的上游3’剪接位點(diǎn)連接，形成套索結(jié)構(gòu)，繼而內(nèi)含子的內(nèi)部剪接以形成外顯子-內(nèi)含子circRNA；②內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化：供體位點(diǎn)的外顯子和受體位點(diǎn)兩側(cè)的內(nèi)含子序列具有相當(dāng)大的互補(bǔ)性，這使得剪接位點(diǎn)接近形成外顯子-內(nèi)含子circRNA；③RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的環(huán)化：RNA結(jié)合蛋白通過與側(cè)翼的內(nèi)含子結(jié)合，拉近供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)的距離，從而促進(jìn)外顯子的環(huán)化。

2 circRNA的主要生物學(xué)功能

結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，circRNA的主要生物學(xué)功能可以概括為以下幾點(diǎn)：①微小RNA海綿：circRNA含有miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，能夠以堿基對的方式直接與靶mRNA結(jié)合，并觸發(fā)mRNA的切割或抑制mRNA的翻譯，間接調(diào)節(jié)miRNA下游靶基因的表達(dá)。小腦變性相關(guān)蛋白1反義RNA(CDR1as)是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能結(jié)合miR-7并抑制其生物活性和功能，發(fā)揮其分子海綿作用的circRNA。此外，最近的研究表明，單個circRNA可以作為各種miRNAs的海綿，在一定條件下既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為癌基因發(fā)揮作用。例如，circHIPK3可以作為miR-558的海綿來抑制膀胱癌中乙酰肝素酶的表達(dá)，也可以通過與miR-124-3p相互作用，上調(diào)信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)的表達(dá)而促進(jìn)肺癌的發(fā)生；②調(diào)控親本基因的表達(dá)：有研究表明，有些外顯子-內(nèi)含子circRNA與RNA聚合酶II相互作用，并在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)聚集，從而促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄。此外，某些circRNA可以與它們的線性對應(yīng)物競爭，對抗規(guī)范的前體mRNA的剪接，從而抑制它們的親本基因的表達(dá)；③蛋白質(zhì)/肽的翻譯：研究發(fā)現(xiàn)，許多circRNA具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或開放閱讀框架，參與功能蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯。例如，circMb1、circ-SHPRH、circPINT和circ-ZNF609，在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)元件的驅(qū)動下或被m6A RNA修飾時，都可以作為蛋白質(zhì)模板。研究報道circ-SHPRH編碼蛋白SHPRH-146aa，它作為誘餌保護(hù)SHPRH蛋白不被維甲酸調(diào)節(jié)的核基質(zhì)相關(guān)蛋白(DTL)介導(dǎo)的降解泛素化，從而抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生。此外，由circPINT編碼的多肽PINT87aa，直接與RNA聚合酶II相關(guān)因子1復(fù)合物相互作用，從而抑制轉(zhuǎn)錄延長并阻止癌基因

MYC

、

SOX2

、

CPEB1

的表達(dá)水平；④蛋白質(zhì)誘餌：越來越多的證據(jù)表明，circRNA充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)海綿或誘餌來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。含有與一種或多種蛋白質(zhì)的多個互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的circRNA可能作為蛋白質(zhì)海綿發(fā)揮作用。circRNA和RNA結(jié)合蛋白之間的相互作用已被證明影響癌癥進(jìn)展。此外，circRNA還可以作為蛋白質(zhì)的支架，促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)或阻斷蛋白質(zhì)的功能。例如在小鼠成纖維細(xì)胞中，circ-Foxo3可以與周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑p21(p21)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(Cdk2)相互作用，形成三元復(fù)合物，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。同時，circ-Foxo3還可以作為小鼠雙微體2(MDM2)和p53的蛋白支架，誘導(dǎo)p53降解；⑤ 疾病生物標(biāo)志物：circRNA穩(wěn)定性高，容易進(jìn)入體液(全血、血清、血漿、腦脊液、尿液等)，并且其表達(dá)模式具有組織、時空和疾病特異性，使得circRNA成為有潛力的疾病生物標(biāo)志物。

3 circRN的促癌機(jī)制

3.1 促進(jìn)喉癌的增值、轉(zhuǎn)移、侵襲

3.1.1 CDR1as CDR1as是最常作為miR-7海綿研究的circRNA，因此也稱為ciRS-7。CDR1as含有70多個miR-7結(jié)合位點(diǎn)，可與Argonaute(AGO)蛋白廣泛結(jié)合。miR-7是一種腫瘤抑制因子，CDR1as通過靶向表皮生長因子受體(EGFR)/RAF原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(RAF1)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號或人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因

PTEN

/胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶PI3K(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路，在腫瘤發(fā)生過程中降低了miR-7的有效性。Zhang等用qRT-PCR檢測了60例喉鱗狀細(xì)胞癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織中CDR1as的表達(dá)水平，結(jié)果表明CDR1as在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中顯著高表達(dá)。同時，CDR1as的高表達(dá)與TNM分期、腫瘤分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?；颊呱鏁r間與CDR1as表達(dá)的相關(guān)性分析表明CDR1as的表達(dá)與喉癌患者的生存率成負(fù)相關(guān)。此外，miR-7在喉鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，且CDR1as表達(dá)水平與miR-7表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。在細(xì)胞水平上，敲除CDR1as導(dǎo)致了喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的細(xì)胞周期中G1/S期阻滯和凋亡，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示CDR1as增加了喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中CCNE1和磷酸肌醇-3-激酶催化亞基Δ肽(PIK3CD)的mRNA和蛋白水平，有利于腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，但腫瘤抑制因子miR-7的表達(dá)抑制了CCNE1和PIK3CD在喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)。此外，體內(nèi)研究的結(jié)果表明，CDR1as的單獨(dú)高表達(dá)可以通過促進(jìn)腫瘤生長和上調(diào)腫瘤細(xì)胞中與侵襲相關(guān)的miR-7靶點(diǎn)CCNE1和PIK3CD，這種作用有助于抵消miR-7的抑癌功能，從而加速了喉鱗狀細(xì)胞癌腫瘤的生長。簡言之，CDR1as是一種促癌基因，通過調(diào)節(jié)miR-7信號通路促進(jìn)喉癌的發(fā)展。3.1.2 hsa_circ_0023028 hsa_circ_0023028是新發(fā)現(xiàn)的一種circRNA，位于基因

C11orf80

的

chr11

:66515849-66590145，在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中明顯高表達(dá)。此外，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中hsa_circ_0023028的高表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)部位、臨床分期等臨床特征密切相關(guān)。miR-194-5p是一種脊椎動物特異性miRNA，在胃癌、喉鱗狀細(xì)胞癌等人類腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。有研究表明，miR-194-5p在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)過低，且miR-194-5p的低表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌的T分期、臨床分期、復(fù)發(fā)和不良預(yù)后相關(guān)。有研究報道m(xù)iR-194-5p的高表達(dá)可以通過靶向Wee1抑制喉鱗狀細(xì)胞癌的惡性表型。Chen等對20例喉鱗狀細(xì)胞癌實(shí)體瘤標(biāo)本和配對的癌旁非癌組織標(biāo)本及人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(Hep-2和TU212)和正常鼻咽上皮細(xì)胞系(NP69)進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁非癌組織相比喉鱗狀細(xì)胞癌組織中hsa_circ_0023028表達(dá)上調(diào)，而miR-194-5p在Hep-2和TU212細(xì)胞中的表達(dá)水平低于NP69細(xì)胞。CCK-8和EdU檢測結(jié)果表明hsa_circ_0023028的下調(diào)導(dǎo)致了細(xì)胞增殖的顯著減少；跨孔遷移和侵襲實(shí)驗結(jié)果顯示hsa_circ_0023028的下調(diào)抑制了Hep-2和TU212細(xì)胞的遷移能力及侵襲能力。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示miR-194-5p的下調(diào)促進(jìn)了hsa_circ_0023028對喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。簡言之，hsa_circ_0023028作為miR-194-5p海綿促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

3.2 抑制喉癌細(xì)胞的凋亡

3.2.1 hsa_circ_0000285 Qin等用RT-qPCR檢測了50例喉癌組織和喉癌細(xì)胞株中hsa_circ_0000285的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)喉癌組織中hsa_circ_0000285的表達(dá)較癌旁組織高，且喉癌細(xì)胞株的hsa_circ_0000285表達(dá)也有不同水平的升高。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，敲除hsa_circ_0000285可抑制喉癌中Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路，而

hsa_circ_0000285

基因的過度表達(dá)則有相反的作用。hsa_circ_0000285是在鼻咽癌中新發(fā)現(xiàn)的一種表達(dá)失調(diào)的circRNA，并將其作為放射敏感性的預(yù)后生物標(biāo)志物。Wnt/β-catenin信號通路是腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)干細(xì)胞完整性、干細(xì)胞分裂和遷移的重要途徑之一，其在轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞中的表達(dá)可能是多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子。例如，通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號和miR-516b誘導(dǎo)的FZD4表達(dá)，circRNA_100290促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展?？偠灾?，

hsa_circ_0000285

作為一種致癌基因，通過誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路，通過抑制喉癌細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)了喉癌的增殖。3.2.2 circRNA_100290 Wang等發(fā)現(xiàn)在喉鱗狀細(xì)胞癌組織和喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中circRNA_100290顯著上調(diào)，且其在喉鱗狀細(xì)胞癌患者中的高表達(dá)水平與TNM晚期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。在細(xì)胞培養(yǎng)中，circRNA_100290的上調(diào)通過抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)了喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和集落形成，增強(qiáng)了喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲或遷移。在體內(nèi)實(shí)驗中，circRNA_100290的過表達(dá)可以促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長。小gtp結(jié)合蛋白Rap超家族的第5個成員RAP2C是RAS家族成員之一，是多種癌癥的致癌基因。例如，RAP2C通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)組織抑制劑的蛋白水平和增加p-Akt的水平，促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_100290作為miR-136-5p的海綿，通過調(diào)控靶基因

RAP2C

促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。

4 circRNA抑制喉癌的機(jī)制

Tian等利用circRNA微陣列對3例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的circRNA進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0042666是下調(diào)的差異基因中表達(dá)差異最大的circRNA之一。Wei等通過qRT-PCR檢測35例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中hsa_circ_0042666的表達(dá)，結(jié)果顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中hsa_circ_0042666表達(dá)明顯降低，且hsa_circ_0042666的低表達(dá)與晚期喉鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)。體外功能檢測結(jié)果顯示，hsa_circ_0042666可降低喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。進(jìn)一步研究表明，hsa_circ_0042666在喉鱗狀細(xì)胞癌中充當(dāng)miR-223的海綿。有研究報道轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β-III型受體(TGFBR3)在癌癥進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。例如, Li等發(fā)現(xiàn)miR-19a/miR-424通過調(diào)控TGFBR3表達(dá)促進(jìn)舌癌的發(fā)生發(fā)展。在這組學(xué)者的研究中，TGFBR3作為為喉鱗狀細(xì)胞癌中miR-223的靶點(diǎn)，且敲除TGFBR3后增強(qiáng)了喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力。簡言之，下調(diào)的hsa_circ_0042666通過調(diào)控miR-223/TGFBR3軸，在喉鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用。

目前circRNA在喉癌中的可能作用機(jī)制研究并不是太多，近幾年喉癌中異常表達(dá)的circRNA主要研究情況見表1。

表1 喉癌中異常表達(dá)的circRNAs

circRNA表達(dá)情況作用機(jī)制與喉癌的關(guān)系hsa_circ:chr20:31876585-31,897,648下調(diào)可能主要調(diào)控PPAR軸突導(dǎo)向、Wnt和細(xì)胞周期信號通路[44]腫瘤抑制劑hsa_circ_0042666下調(diào)作為miR-223的海綿,競爭性與miR-223結(jié)合,調(diào)控TGFBR3基因[42]抑制喉癌的增殖和侵襲hsa_circ_0044520和hsa_circ_00445229上調(diào)競爭性抑制hsa-miR-4726-5p和hsa-miR-4640-5p的活性,調(diào)控COL1A1基因參與膠原的合成[45]促進(jìn)喉癌的發(fā)生發(fā)展CDR1as(ciRS-7)上調(diào)作為miR-7的海綿,競爭性抑制miR-7的活性,增加CCNE1和PIK3CD的表達(dá)[31]促進(jìn)喉癌的增殖和轉(zhuǎn)移has_circ_0023028上調(diào)作為腫瘤抑制劑miR-194-5p的海綿,競爭性抑制了miR-194-5p的活性,調(diào)控Weel基因[35]促進(jìn)喉癌的增殖、遷移和侵襲circRNA_100290上調(diào)作為miR-136-5p的海綿,競爭性抑制miR-136-5p的活性,促進(jìn)癌基因RAP2C的表達(dá)[39]促進(jìn)喉癌的增殖、遷移和侵襲,抑制細(xì)胞凋亡circMYLK上調(diào)作為腫瘤抑制因子miR-195的海綿,競爭性抑制miR-195的活性,增加cyclinD1的表達(dá)[46]促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌的增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)展circFLNA上調(diào)充當(dāng)miR-486-3p的海綿,競爭性與miR-486-3p結(jié)合,增加移行標(biāo)志MMP2和FLNA蛋白的表達(dá)[47]促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移circRASSF2上調(diào)充當(dāng)miR-302b-3p的海綿,競爭性抑制miR-302b-3p的活性,促進(jìn)癌基因IGF-1R的表達(dá)[41]促進(jìn)喉癌的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲,抑制細(xì)胞的凋亡circ-CCND1上調(diào)與HuR和miR-646相互作用,從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控CCND1基因,進(jìn)而增強(qiáng)CCND1的穩(wěn)定性[48]促進(jìn)喉癌的增殖has_circ_0057481上調(diào)充當(dāng)miR-200c的海綿,競爭性抑制miR-200c的活性,調(diào)控ZEB1的表達(dá)[49]促進(jìn)喉癌的增殖和轉(zhuǎn)移hsa_circ_0000285上調(diào)激活Wnt/β-catenin信號通路[36]促進(jìn)喉癌的增殖和抑制細(xì)胞凋亡hsa_circRNA_100855上調(diào)未知促進(jìn)喉癌的增殖和轉(zhuǎn)移[32]hsa_circRNA_104912下調(diào)未知抑制喉癌的增殖和轉(zhuǎn)移[32]circCORO1C上調(diào)競爭性結(jié)合let-7c-5p,阻止其降低PBX3水平,促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[50]促進(jìn)喉癌的增殖、轉(zhuǎn)移circPARD3上調(diào)海綿細(xì)胞化miR-145-59激活PRKCI-Akt-mTOR通路[51]促進(jìn)喉癌的增殖、轉(zhuǎn)移及化療耐藥

注：PPAR：過氧化物酶體增殖物激活受體；TGFBR3：轉(zhuǎn)化生長因子β-III型受體；COL1A1：膠原蛋白I型Alpha1鏈；PIK3CD：磷酸肌醇-3-激酶催化亞基Δ肽；cyclin D1：G1/S-特異性周期蛋白-D1；MMP2：蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2；FLNA：細(xì)絲蛋白A；IGF-1R：胰島素樣生長因子1受體；CCND1：周期蛋白D1；PBX3：同源盒基因3；PRKCI：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶蛋白激酶c；Akt：蛋白激酶B；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

5 總結(jié)與展望

綜上所述，circRNA在喉癌的相關(guān)研究較少，但就目前的研究顯示其在喉癌中的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要的作用，參與了喉癌的侵襲、增值、凋亡、轉(zhuǎn)移，可作為喉癌的早期診斷及預(yù)后的標(biāo)志物。相信隨著生物信息學(xué)的發(fā)展及人們對基因組學(xué)研究的進(jìn)一步深入，circRNA 在基因水平上與喉癌的相關(guān)性終將明晰，屆時circRNA將成為喉癌治療的新靶點(diǎn)，為喉癌患者的早期診斷和評估預(yù)后提供生物學(xué)標(biāo)志物。