丁文東, 崔康平, 郭 志

(合肥工業(yè)大學 資源與環(huán)境工程學院,安徽 合肥 230009)

諾氟沙星(NOR)是廢水中第2常見的氟喹諾酮類抗生素[1]，已被廣泛合成并用于治療細菌感染、水產(chǎn)養(yǎng)殖和牲畜等領(lǐng)域[2]，它們存在于污水處理廠、地表水、地下水甚至飲用水的流入[3]。諾氟沙星對微生物降解具有很強的抵抗力,并且由于其不易發(fā)生自然衰減,引起水環(huán)境、土壤、地下水等的富集[4],在環(huán)境中檢測到的質(zhì)量濃度可達到最大值[5](7 560 ng/L)。這些化合物不受控制地釋放可能破壞水中重要的生物過程,并對水生和陸地生物構(gòu)成潛在風險[6]。

納米銀(AgNPs)是商業(yè)產(chǎn)品中使用最廣泛的納米材料,因其具有高抗菌性能[7]被廣泛用于生產(chǎn)日常必需品,包括紡織品、消毒醫(yī)療器械和家用電器[8]。由于納米銀技術(shù)的廣泛應(yīng)用,不可避免地直接或間接被排放到城市廢水中,從而導致其在大氣、水、土壤或生物環(huán)境中的積累、轉(zhuǎn)化和降解[9]，已經(jīng)在天然水體和污水處理廠中檢測到納米銀的存在。這對環(huán)境中的微生物具有負面影響,除了抗菌活性外,納米銀在生物處理過程中對一些水生生物和微生物群落具有較高毒性,特別是在水生環(huán)境中[10]。

AgNPs與抗生素已廣泛存在于水體環(huán)境中,雖然目前對其產(chǎn)生的生物毒性已經(jīng)有一些研究,然而在AgNPs和抗生素共存環(huán)境中的生物響應(yīng)機制研究很少。因此本文對不同劑量AgNPs刺激NOR的生物去除進行評估,并通過抗氧化性酶活性的變化探究其機理，研究揭示AgNPs在廢水中與NOR共存情況下對NOR生物去除的影響,對研究AgNPs在復雜水環(huán)境中的生物行為具有重要意義。

1 實 驗

1.1 AgNPs的制備與表征

AgNPs的制備以文獻[11]的方法為基礎(chǔ)并加以修改,采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為穩(wěn)定劑。本研究中，聚乙烯吡咯烷酮-納米銀(PVP-AgNPs)的合成路線如下:取4 mL聚乙烯吡咯烷酮(0.3%)和12 mL硼氫化鈉溶液(15 mmol/L),冰浴下加入233 mL超純水,攪拌下加入5 mL硝酸銀溶液(20、40 mmol/L),攪拌3 min使其均勻反應(yīng)后撤去冰浴,在室溫(約20 ℃)下,使用540 r/min的磁力攪拌器將混合物進一步攪拌2 h,得到AgNPs溶液。生成的AgNPs通過1 kDa的透析袋去除多余的聚乙烯吡咯烷酮和銀離子,純化后放在42 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

本研究采用火焰原子吸收光譜法測定所制備AgNPs的濃度,并利用紫外可見分光光度計、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)、動態(tài)光散射等手段表征本文合成的AgNPs材料的紫外可見吸收峰、流體動力學直徑、表面電荷及晶體結(jié)構(gòu)等。

1.2 黃孢原毛平革菌的培養(yǎng)

從中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)獲得黃孢原毛平革菌AF-96007菌株,并儲存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(200 g/L馬鈴薯提取物、20 g/L葡萄糖、20 g/L瓊脂、3 g/L KH2PO4、1.5 g/L MgSO4·7H2O、8 g/L維生素B1),將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移到超純水中,調(diào)節(jié)至2.0×106CFU/mL。然后將孢子懸浮液接種到液體培養(yǎng)基(0.211 g/L酒石酸銨、11.098 g/L葡萄糖、0.2 g/L KH2PO4、0.05 g/L MgSO4·7H2O、0.01 g/L CaCl2、1.641 g/L NaAc、0.5 mL/L維生素溶液、1 mL/L無機溶液)中。按上述方法將黃孢原毛平革菌培養(yǎng)3 d后,待其進入對數(shù)生長期后期,在錐形瓶中形成較為均勻的菌絲球。采集菌絲并用2 mmol/L NaHCO3緩沖溶液洗滌幾次。

1.3 AgNPs對去除NOR的影響實驗

利用配制好的0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HNO3將培養(yǎng)3 d后黃孢原毛平革菌溶液的pH值調(diào)節(jié)為6.5,從而使除NOR的生物去除實驗在最適pH值條件下進行。為了測定AgNPs濃度對黃孢原毛平革菌降解性能的影響,將0.5 g/L的黃孢原毛平革菌置于10 mg/L的NOR緩沖液中,并保持AgNPs初始濃度為0.01～60.00 μmol/L。在37 ℃、150 r/min條件下震蕩培養(yǎng),并于不同時間點取出小份試樣進行NOR質(zhì)量濃度的檢測,同時還進行硝酸銀的對照實驗。另外,為了更進一步探究低濃度AgNPs對NOR的生物降解效果,在濃度為0.12 μmol/L的不同尺寸AgNPs(76、48 nm)刺激下,監(jiān)測0.5 g/L的黃孢原毛平革菌置于10 mg/L NOR緩沖液中NOR的質(zhì)量濃度變化。

NOR的質(zhì)量濃度通過高效液相色譜法測定[12],采用紫外檢測器和Eclipse xdb-c18柱進行分析。紫外檢測器設(shè)置為275 nm,以甲醇和水的混合物(兩者的體積比為2∶1)為流動相,流速為1 mL/min。

1.4 抗氧化性酶活的測定

抗氧化酶類是細胞抵御氧化脅迫的第1防御機制[13]。環(huán)境中的毒性物質(zhì)會刺激抗細胞內(nèi)抗氧化劑的產(chǎn)生,如抗氧化酶類超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及非酶類抗氧劑谷胱甘肽,以保護細胞組分免受ROS損傷。實驗考察了10 mg/L的NOR處理的對照組、10.0 μmol/L銀離子處理組以及10.00、0.10 μmol/L AgNPs處理組中SOD和CAT的酶活性。

離心收集脅迫后的黃孢原毛平革菌菌球,于0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值為7.8)中破碎,將破碎后的菌漿于4 ℃、15 000 r/min離心10 min,離心后取上清液用于酶活測定。CAT的活性通過測定240 nm處吸光度的下降速率來表征其活性。3 mL的反應(yīng)體系包括:0.2 mL的酶液、1 mL蒸餾水和1.5 mL 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值為7)。將混合液于25 ℃預熱后,加入0.3 mL 0.1 mol/L的H2O2啟動反應(yīng),并立即記錄240 nm處吸光度的變化情況,定義每分鐘內(nèi)的吸光度下降0.01為1個酶活單位。SOD酶活性測定采用氮藍四唑(Nitro Blue Tetrazoliumchloride,NBT)比色法[14]。反應(yīng)體系為:1 mmol/L NaCO3、200 mmol/L蛋氨酸、2.251 mmol/L NBT、 3 mmol/L EDTA、60 mmol/L核黃素和0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.8)。向測定管中加入0.01 mL粗酶液,對照管則加入0.01 mL的磷酸緩沖液代替粗酶液,對照管和測定管各取2只,混合均勻后,把一支對照管放在暗處,其他置于30 μmol/(m2·s)日光燈下反應(yīng)15 min,然后記錄各管在560 nm的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 AgNPs的表征

針對不同尺寸AgNPs進行紫外可見光掃描，結(jié)果如圖1a所示。從圖1a可以看出,AgNPs在401 nm處有很強的特征吸收峰,關(guān)于AgNPs在自然水體中的穩(wěn)定性也可以通過峰值大小的變化判斷,當2種尺寸的AgNPs分散在自然水體中2 h后,溶液中的峰值發(fā)生了不同程度的變化。相比于超純水,48 nm的AgNPs在自然水體中的吸光度減小8%,而76 nm的AgNPs減小3%。顯然,小尺寸納米銀較不穩(wěn)定,更容易溶解釋放出銀離子,但是這種釋放都是微乎其微的。此外,在4 ℃的儲存條件下,2個月后的AgNPs比剛合成的AgNPs特征峰值減小47%,但仍有較明顯的特征峰,在6個月后峰值減小63%,特征峰已不明顯。可見,合成的PVP-AgNPs在溶液中是緩慢溶解的過程,具有較長時間的穩(wěn)定性。

電鏡法是觀察納米材料的幾何形貌、材料的顆粒度等方面最直觀、最常用的方法,而材料的很多重要物理化學性質(zhì)均由其形貌決定,因此對PVP-AgNPs進行TEM分析，結(jié)果如圖1b所示。從圖1b可以看出,實驗合成的AgNPs呈顆粒狀,形狀分布較為均勻,在超純水中是單分散的球形形狀。

不同尺寸AgNPs流體動力學平均直徑分布直方圖如圖2所示。從圖2可以看出,實驗中合成的AgNPs粒徑分布較為分散,且2種不同硝酸銀濃度(40、20 mmol/L)制備得到的納米銀在超純水中的流體動力學平均直徑分別為48.70、76.41 nm。另外,2種不同粒徑AgNPs的zeta電位值分別為-12.70、-17.77 mV,電位值較大的更為穩(wěn)定,這表明實驗中所合成的大粒徑的AgNPs較為穩(wěn)定,較小粒徑的AgNPs較不穩(wěn)定且可能更容易在水環(huán)境中溶解釋放出銀離子,這與其在紫外可見光譜分析的結(jié)果相同。

圖1 AgNPs的表征分析

圖2 不同尺寸AgNPs流體動力學平均直徑分布直方圖

2.2 AgNPs對NOR生物去除的影響

加入AgNPs后,NOR的去除率隨時間的變化如圖3所示。

圖3 AgNPs濃度對NOR去除效果的影響

從圖3可以看出,NOR的生物去除均可在12 h內(nèi)完成,在12 h后去除效果不明顯。此外,隨著AgNPs濃度的變化,NOR的去除率有顯著變化。當AgNPs的初始濃度大于1.00 μmol/L時,NOR的去除率低于對照組的56%,且隨著AgNPs初始濃度的增加而顯著降低,在AgNPs濃度達到60.00 μmol/L時,NOR的去除率僅為13%,其生物去除作用受到了抑制。然而,當AgNPs初始濃度小于0.10 μmol/L時,NOR的去除率比對照組有所提高,可達73%。結(jié)果表明,較低濃度的AgNPs會對黃孢原毛平革菌產(chǎn)生毒物興奮效應(yīng),即在一定范圍內(nèi)的低劑量致毒因素反而會使細胞興奮,刺激微生物生長、抵御外部不利因素。AgNPs的毒物興奮效應(yīng)可能是由于其在低濃度下激活了毒性損傷的修復機制，這種修復過程可能對毒物的暴露進行過度補償,從而加強對NOR生物降解[15]。另一方面,高濃度AgNPs明顯抑制黃孢原毛平革菌的生物活性，AgNPs的毒性機制包括破壞膜完整性,使活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成以及對能量代謝和基因轉(zhuǎn)錄的破壞,這些都可能與AgNPs本身或銀離子的釋放直接相關(guān)[16]。這也導致AgNPs在較高的初始濃度下,可能因AgNPs釋放或溶解產(chǎn)生的銀離子對NOR的生物去除產(chǎn)生抑制作用。

為了進一步探索AgNPs在低濃度下對NOR的生物去除效果,實驗采用不同粒徑的AgNPs,并監(jiān)測其初始濃度在0.12 μmol/L下溶液中NOR去除率隨時間的變化，如圖4所示。由圖4可知,76 nm AgNPs刺激下的NOR最大去除率為75%,而48 nm AgNPs刺激下的去除率為70%?？梢园l(fā)現(xiàn),不同粒徑AgNPs的初始濃度均在0.12 μmol/L對黃孢原毛平革菌產(chǎn)生毒物興奮效應(yīng),可以增強對NOR的生物去除,相比對照組有明顯的提高。不同的是,在48 nm AgNPs的刺激下,黃孢原毛平革菌對NOR的去除率迅速提高,24 h后去除率達到穩(wěn)定水平。相比之下,在76 nm AgNPs的刺激下,NOR的生物去除過程持續(xù)48 h,并在之后較為穩(wěn)定。結(jié)果表明,小尺寸AgNPs的刺激在低濃度更有效率,AgNPs可以通過“特洛伊木馬效應(yīng)”將離子或顆粒輸送到細胞中,從而提高顆粒和離子在有機物和細胞中的滲透性和生物利用度[17]。通過這種方式,AgNPs可以很容易地進入細胞,而較小的顆粒更容易進入細胞,同時也具有更大的表面積和更多的連接位點,低濃度AgNPs產(chǎn)生毒物興奮效應(yīng),對于NOR的去除效率較為明顯。

圖4 不同粒徑AgNPs對NOR去除效果的影響

2.3 銀離子對NOR生物去除的影響

銀離子濃度對NOR去除效果的影響如圖5所示,從圖5可以看出,硝酸銀的初始濃度為0.1、0.5、1.0、10.0、60.0 μmol/L時,NOR的最大去除率分別為41%、31%、28%、25%、22%?？梢园l(fā)現(xiàn),在所有組別中,在最初的4 h內(nèi),NOR的去除率逐漸增加,在4 h之后NOR的去除率基本保持不變,去除率均顯著低于對照組的57%。一般認為,銀離子是對生物產(chǎn)生毒性作用最主要的機理,銀離子可以連接在質(zhì)膜和細胞內(nèi)的含硫蛋白上,導致細胞膜的完整性被破壞、功能蛋白受損以及產(chǎn)生氧自由基[18]。暴露的銀離子會與DNA堿基對反應(yīng),引起基因的損傷。然而當銀離子被基團絡(luò)合時,銀離子則不具有毒性。因此在一開始黃孢原毛平革菌表面基團受到銀離子的刺激與銀離子絡(luò)合,使銀離子暫時不具有毒性,從而仍對NOR具有降解作用。然而,隨著銀離子濃度的升高,黃孢原毛平革菌對NOR的去除率越來越低。這是由于黃孢原毛平革菌菌絲表面基團對銀離子的絡(luò)合量有限,從而使更多的銀離子暴露在細胞表面,對細胞產(chǎn)生毒性,抑制了細胞的活性以及對NOR的去除。顯然,低濃度的銀離子并沒有顯示出毒物興奮效應(yīng),高濃度的銀離子表現(xiàn)出對NOR生物降解較強的抑制作用。

圖5 銀離子濃度對NOR的去除效果影響

2.4 抗氧化行為分析

黃孢原毛平革菌細胞內(nèi)的SOD和CAT酶活性對不同毒物脅迫響應(yīng)隨時間的變化情況如圖6所示。從圖6可以看出,當細胞只暴露于短時間(2 h)時,由于硝酸銀和AgNPs的引入,SOD酶活性較對照組顯著提高;暴露24 h后,硝酸銀和高濃度AgNPs刺激下的SOD酶活性逐漸降低,而對照組和低濃度AgNPs的SOD酶活性逐漸升高。這表明硝酸銀以及高濃度AgNPs釋放出較多的銀離子具有毒性,誘導細胞內(nèi)的ROS水平急劇增加,促使細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,從而在短時間內(nèi)可以產(chǎn)生較多的SOD。然而,24 h后SOD活性的下降被認為是一個消耗期。其抗氧化防御系統(tǒng)超載,抗氧化酶系無法消除大量產(chǎn)生的ROS,導致細胞結(jié)構(gòu)嚴重損害甚至細胞死亡,SOD的進一步表達受限,從而表現(xiàn)出較低活性的SOD。相反,低濃度的AgNPs能刺激細胞內(nèi)SOD的活性,催化細胞內(nèi)超氧陰離子自由基歧化反應(yīng)生成氧氣和過氧化氫,對機體抗氧化平衡起重要作用。而CAT酶活性暴露于低濃度AgNPs后,表現(xiàn)出類似于SOD的變化,并逐漸增加,展現(xiàn)出較好的抗氧化應(yīng)激能力。然而,與低濃度AgNPs脅迫后的變化相比,高濃度AgNPs和硝酸銀刺激24 h后CAT酶活性要低得多。這可能是由于銀離子抑制了CAT的生物合成或金屬酶復合物的形成,從而導致CAT結(jié)構(gòu)和酶活性的改變。

綜上所述，銀離子在短時間(2 h)內(nèi)可以刺激細胞產(chǎn)生更多的SOD,但毒性作用或金屬酶復合物的形成導致CAT酶生物合成受到抑制,造成抗氧化防御系統(tǒng)超載,導致慢性損傷甚至細胞死亡,對NOR生物去除產(chǎn)生抑制作用。相反,低濃度的AgNPs可以提高SOD和CAT的酶活性,而抗氧化酶活性的誘導是實現(xiàn)抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵[19],即說明低濃度的AgNPs可以激活細胞誘導更多的抗氧化酶來增強抗氧化應(yīng)激能力,從而實現(xiàn)了真菌對環(huán)境中NOR的生物去除。

圖6 抗氧化性酶隨時間的變化

3 結(jié) 論

本實驗探究了不同劑量AgNPs刺激黃孢原毛平革菌對NOR的去除效果。在0.10 μmol/L AgNPs的刺激下,NOR的生物去除率從對照組的56%提高至73%,而60.00 μmol/L AgNPs抑制NOR的生物去除,去除率僅為13%。AgNPs表現(xiàn)出高濃度抑制、低濃度促進的效果,而銀離子僅表現(xiàn)出抑制作用。同時在0.12 μmol/L AgNPs的刺激下,76、48 nm AgNPs均能提高NOR的生物去除率,分別為75%、70%,尺寸較小的AgNPs對NOR的生物去除更有效率。通過抗氧化行為的分析,表明低濃度的AgNPs可以提高SOD和CAT的酶活性,可以增強抗氧化應(yīng)激能力,從而實現(xiàn)了真菌對環(huán)境中抗生素的生物去除。