牛 康, 陳 瑤, 肖妍妍, 汪惠麗, 陳向濤

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.安徽醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥 230032)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是常見的神經(jīng)退行性疾病,表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害,從臨床癥狀發(fā)作到死亡的平均持續(xù)時(shí)間約為8.5 a。AD每年新增約4 000 000～6 000 000癡呆癥病例,其中中國(guó)及其南亞鄰國(guó)的增長(zhǎng)預(yù)測(cè)最高[1],而且到2050年預(yù)計(jì)病例數(shù)將達(dá)到1.15億,這無(wú)疑將給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2],到目前為止,AD還沒(méi)有有效的治療方法[3]。AD的病理特征主要包括老年斑(senile plaque,SP)的沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)和神經(jīng)元的丟失等[4]。此外,AD患者腦中Aβ的過(guò)度產(chǎn)生和積累也會(huì)引發(fā)隨后的病理事件,如突觸變性、氧化應(yīng)激、Tau-過(guò)度磷酸化和神經(jīng)炎癥[5-6]。而這些繼發(fā)性病理事件又可刺激細(xì)胞產(chǎn)生新的Aβ,形成了一個(gè)惡性循環(huán),加速疾病進(jìn)展[7-8]。

關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制,目前有多種假說(shuō),如β-淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)、Tau蛋白異常磷酸化假說(shuō)、膽堿能低下學(xué)說(shuō)、神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)假說(shuō)和氧化應(yīng)激假說(shuō)等[9]。β-淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)是主流的發(fā)病機(jī)制假說(shuō),該假說(shuō)認(rèn)為Aβ沉積是造成AD病理發(fā)展的主要原因,現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因AD動(dòng)物模型也大多數(shù)從此假說(shuō)構(gòu)建而來(lái),如5×FAD轉(zhuǎn)基因小鼠模型,該模型小鼠在4～6月齡時(shí)即可產(chǎn)生大量的可溶性Aβ單體,在腦中自發(fā)聚集成為寡聚態(tài),直至成為最后的不溶性原纖維沉積,產(chǎn)生了老年斑沉積,進(jìn)而表現(xiàn)出類似于AD的各種病理表征。

我國(guó)傳統(tǒng)中藥石菖蒲具有開竅豁痰、醒神益智等功效,對(duì)癲癇、缺血性腦損傷、阿爾茲海默病、帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病具有保護(hù)作用,而β-細(xì)辛醚是其主要活性成分[10]。因此,本文以4月齡的5×FAD轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象,在給予β-細(xì)辛醚90 d后,檢測(cè)小鼠腦中Aβ的沉積情況,這對(duì)于評(píng)價(jià)β-細(xì)辛醚的抗AD作用有重要意義,將為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)(CT14RD),徠卡冰凍切片機(jī)(Leica),T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(Bio-RAD ),80i熒光顯微鏡(Nikon),凝膠成像系統(tǒng)、渦漩震蕩儀、VE-180凝膠電泳槽(上海天能科技有限公司),移液槍等。

1.1.2 主要試劑

β-細(xì)辛醚(純度為7%,Sigma)、DNA Marker、6×DNA loading buffer、 2×PCR Master Mix、Easy Pure Genomic DNA Kit試劑盒、蛋白酶K(全式金生物技術(shù)有限公司),蔗糖、多聚甲醛、氨水、無(wú)水乙醇、剛果紅、甘油、乙二醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),Aβ抗體(上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司),DAPI(C0060,Solarbio),Triton X-100,羊血清,抗熒光猝滅劑,PBS緩沖液,瓊脂糖,1×TAE電泳緩沖液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5×FAD雄鼠由中國(guó)科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,飼養(yǎng)在SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房,待其適應(yīng)1周后,按1∶3的比例與野生型C57雌鼠合籠,母鼠妊娠后待子代1月齡時(shí)鑒定其基因型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(野生型C57雌鼠)、AD模型組(5×FAD雌鼠)和β-細(xì)辛醚組。β-細(xì)辛醚不溶于水,將其溶解在0.8%的吐溫-80溶液中。小鼠4月齡后開始給藥。β-細(xì)辛醚組每天灌胃給藥(10 mg/kg);模型組給予同體積的0.8%的吐溫-80溶液,持續(xù)90 d。灌胃前一周及灌胃期間,每周測(cè)量1次體質(zhì)量。

1.2.2 小鼠基因型鑒定

按文獻(xiàn)[11]方法鑒定5×FAD轉(zhuǎn)基因鼠基因型。剪取小鼠腳趾,按照DNA提取試劑盒中的操作步驟提取小鼠DNA,而后使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下。

轉(zhuǎn)基因上游引物序列：

5’AGGACTGACCACTCGACCAG,

轉(zhuǎn)基因下游引物序列:

5’CG-GGGGTCTAGTTCTGCAT;

內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照上游引物序列:

5’CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT,

內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照下游引物序列:

5’GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC。

以提取到的小鼠cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(2 μL):轉(zhuǎn)基因上游、下游引物各1 μL,內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照上游、下游引物各0.5 μL,共計(jì)3 μL;2×PCR Master Mix 10 μL,cDNA 2 μL,添加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序:94 ℃,3 min;94 ℃,30 s;52 ℃,1 min;72 ℃,1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃,5 min;停止。之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,判斷基因型。

1.2.3 小鼠腦組織的處理和染色

冰凍切片。90 d灌胃結(jié)束之后,對(duì)小鼠進(jìn)行心臟灌流、取腦,在4%多聚甲醛中于4 ℃避光浸泡24 h,之后更換浸泡液為30%蔗糖進(jìn)行脫水,待腦組織沉浸于液體底部后,進(jìn)行冰凍切片,厚度為40 μm,于防凍液中-20 ℃保存。

剛果紅染色。將腦片粘貼于粘附載玻片上,適當(dāng)晾干,之后分別浸泡在剛果紅染色液中15 min、蒸餾水2 min、0.2%堿性乙醇分化液10 s、蒸餾水2 min、蘇木精染色2 min、蒸餾水2 min、1%鹽酸分化液10 s、蒸餾水2 min 、2%氨水10 s返藍(lán),之后乙醇梯度脫水、透明并封片,于熒光顯微鏡下觀察。

免疫組織化學(xué)染色。首先,將腦片用PBS清洗5 min,共3次,再在0.7% Triton X-100、5%羊血清破膜封閉2 h;PBS清洗5 min，共3次,將腦片在1∶200 PBS稀釋的一抗中4 ℃孵育過(guò)夜;PBS清洗5 min，共3次,將腦片在1∶5 000 PBS稀釋的二抗中室溫避光孵育2 h;PBS清洗5 min，共3次,將腦片在1∶10 000 PBS稀釋的DAPI中避光孵育8 min;PBS清洗5 min，共3次,在腦片上滴加抗熒光猝滅劑并封片,于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果分析

2.1 AD小鼠基因型的鑒定

以小鼠腳趾提取到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,兩對(duì)引物對(duì)應(yīng)的DNA片段分別為轉(zhuǎn)基因引物基因(片段大小為377 bp),內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照引物基因(片段大小為324 bp)。內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照基因片段在每只小鼠中都會(huì)表達(dá),但轉(zhuǎn)基因只存在于AD小鼠中,因此2個(gè)片段同時(shí)存在時(shí)才可確定為AD小鼠,如圖1所示。

圖1 小鼠基因型的鑒定

圖1中,因瓊脂糖電泳的特性,分子量較小的移動(dòng)速度較快,從下至上分子量大小依次增大,最左側(cè)為DNA Marker,用以指示相應(yīng)位置的分子量大小,范圍為100～1 000 bp,從下到上3條光帶依次對(duì)應(yīng)為引物二聚體、內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照基因片段和轉(zhuǎn)基因片段,圖1紅色方框中同時(shí)存在2個(gè)引物擴(kuò)增的片段,可確定其對(duì)應(yīng)小鼠基因型為AD。

2.2 β-細(xì)辛醚對(duì)AD小鼠體質(zhì)量的影響

在灌胃第7天開始記錄體質(zhì)量,每周記錄1次,灌胃期間小鼠體質(zhì)量變化如圖2所示,因?qū)嶒?yàn)開始時(shí),小鼠已有4個(gè)月的月齡,因此體質(zhì)量變化并不明顯。

從圖2可以看出,與對(duì)照組小鼠相比,模型組小鼠體質(zhì)量明顯下降,但β-細(xì)辛醚灌胃后則出現(xiàn)體質(zhì)量恢復(fù),與對(duì)照組相比并無(wú)明顯差異。表明當(dāng)β-細(xì)辛醚的每天給藥劑量為10 mg/kg時(shí),不僅不會(huì)損壞小鼠的機(jī)體健康,而且可恢復(fù)由溶劑造成的體質(zhì)量下降情況,對(duì)機(jī)體有益無(wú)害。

圖2 灌胃期間小鼠體質(zhì)量變化

2.3 β-細(xì)辛醚對(duì)AD小鼠腦中老年斑的影響

腦中產(chǎn)生的Aβ初始為可溶性單體狀態(tài),可彌散至整個(gè)大腦,因而整個(gè)腦區(qū)中都會(huì)有老年斑的沉積出現(xiàn),但主要以皮層和海馬區(qū)域居多,且這2個(gè)區(qū)域與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān),因此本文以皮層和海馬區(qū)域中老年斑沉積的數(shù)量為分析指標(biāo),研究β-細(xì)辛醚是否具有抑制老年斑沉積的效果。

剛果紅試劑可與淀粉樣蛋白結(jié)合,在綠色熒光激發(fā)下使老年斑呈現(xiàn)紅色,如圖3所示。從圖3可看出,7月齡的對(duì)照組小鼠腦中,無(wú)老年斑沉積,表明正常情況下此月齡的野生型小鼠不會(huì)表現(xiàn)出AD癥狀。但在7月齡5×FAD小鼠腦中出現(xiàn)了大量的老年斑沉積,證明5×FAD轉(zhuǎn)基因AD模型可很好的模擬AD患者腦中的Aβ沉積情況,滿足研究所需。而通過(guò)對(duì)比是否給予β-細(xì)辛醚的2組5×FAD小鼠腦中老年斑的沉積情況可以看出，與模型組相比,每天用β-細(xì)辛醚10 mg/kg灌胃90 d后,可明顯減少5×FAD小鼠腦中皮層與海馬區(qū)域的老年斑沉積數(shù)量。

圖3 剛果紅染色

為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性,本文進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果如圖4所示,由圖4可知,染色結(jié)果與剛果紅染色結(jié)果一致,β-細(xì)辛醚組小鼠腦中的老年斑數(shù)量呈下降趨勢(shì)，不同的是免疫組織化學(xué)染色靈敏度比剛果紅染色更高,不僅可觀測(cè)到已形成的老年斑,還可檢測(cè)到還未聚集、沉積的Aβ淀粉樣蛋白,此類蛋白彌散在皮層神經(jīng)元四周,表明在5×FAD小鼠腦中,其皮層神經(jīng)元是產(chǎn)生Aβ蛋白的主要地點(diǎn),為靶向治療AD提供了一定參考。

圖4 免疫組織化學(xué)染色

3 討 論

根據(jù)β-淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō),Aβ的產(chǎn)生和沉積是導(dǎo)致AD發(fā)病的核心原因,且已證明了Aβ除本身能夠直接造成神經(jīng)毒性外,也會(huì)引起多種細(xì)胞毒性作用,包括氧化應(yīng)激、炎癥損傷、細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高、Tau蛋白過(guò)度磷酸化等,最終誘導(dǎo)阿爾茲海默癥的病發(fā)[5-6]。因此有效抑制Aβ蛋白的生成、減緩或抑制其胞外發(fā)生的聚集進(jìn)程以減少Aβ在腦中的堆積,仍是目前AD研究的重點(diǎn)。

本文從β-淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)出發(fā),指出β-細(xì)辛醚是否可改善AD小鼠腦中老年的沉積情況。首先,大量繁殖擴(kuò)增5×FAD轉(zhuǎn)基因小鼠,鑒定其子代基因型,為實(shí)驗(yàn)所需提供充足的樣本量。待其4月齡時(shí),實(shí)驗(yàn)組每天給予β-細(xì)辛醚劑量為10 mg/kg;模型組則給予同體積的溶劑,即0.8%的吐溫-80,持續(xù)灌胃90 d。文獻(xiàn)[12]研究發(fā)現(xiàn)在每天給予大鼠β-細(xì)辛醚80 mg/kg、連續(xù)7 d的情況下,會(huì)導(dǎo)致大鼠虛弱、精神疲勞、體質(zhì)量減輕甚至死亡,表明β-細(xì)辛醚除具有神經(jīng)保護(hù)的藥理作用之外,對(duì)機(jī)體還有一定的毒性作用。因此從3個(gè)月灌胃期間小鼠體質(zhì)量的變化情況可以看出，對(duì)照組與β-細(xì)辛醚組間無(wú)明顯差異,證明每天β-細(xì)辛醚劑量10 mg/kg長(zhǎng)期灌胃不會(huì)給機(jī)體帶來(lái)?yè)p傷,保證了長(zhǎng)期用藥的安全性。

在整個(gè)灌胃過(guò)程結(jié)束后,采用剛果紅染色和免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠腦中老年斑的沉積情況,發(fā)現(xiàn)2種染色方法所得的結(jié)果趨勢(shì)一致。與模型組相比,β-細(xì)辛醚組小鼠腦中皮層和海馬區(qū)域的老年斑沉積數(shù)量明顯減少,且由免疫組化染色結(jié)果顯示,皮層神經(jīng)元是5×FAD小鼠腦中Aβ產(chǎn)生的主要地點(diǎn),為AD的治療提供了一種思路。本文是深入開展β-細(xì)辛醚對(duì)于AD是否具有治療作用的基礎(chǔ),根據(jù)β-細(xì)辛醚可減輕5×FAD小鼠腦中老年斑的沉積情況,為開展后續(xù)的相關(guān)研究提供支持與依據(jù)。