樊 丹，鄧福容，李紹戊，盧彤巖，劉紅柏，王 荻*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；4.上海海洋大學(xué) 國家水生動物病原庫，上海 201306）

【研究意義】虹鱒（Oncorhynchus mykiss）是我國重要的淡水冷水魚養(yǎng)殖品種，具有體色艷麗、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、無肌間刺等優(yōu)點，深受廣大垂釣愛好者和消費者青睞，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)擁有良好的發(fā)展和市場前景[1]。隨著市場需求量的不斷增大，高密度集約化人工養(yǎng)殖技術(shù)得到了快速發(fā)展，但由于科學(xué)管理手段的滯后引發(fā)了諸如水質(zhì)環(huán)境惡化、密度脅迫、營養(yǎng)失衡等問題，導(dǎo)致養(yǎng)殖過程中細(xì)菌性疾病頻發(fā)。目前抗生素的使用仍是虹鱒養(yǎng)殖過程中細(xì)菌性病害防治最為有效的方式[2]，而抗生素不規(guī)范不科學(xué)使用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥、養(yǎng)殖環(huán)境及生態(tài)環(huán)境惡化等問題日益突出，對環(huán)境安全及食品健康造成了潛在危害和影響[3-5]。益生菌不僅具有促進(jìn)宿主生長、增強(qiáng)免疫的功能，且能有效抑制條件致病菌生長，降低病害發(fā)生頻率及危害，作為新型生防劑或飼料添加劑在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較好的應(yīng)用效果和發(fā)展前景[6-10]。水產(chǎn)常用益生菌包含酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等[9,11-12]，而芽孢桿菌中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種需氧型革蘭氏陽性菌，具有抗逆性能強(qiáng)，耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿高鹽[13-14]，可產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶等消化酶促進(jìn)宿主消化吸收等功能[15-16]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生抗菌蛋白，其分子質(zhì)量通常大于10 ku，對蘋果樹腐爛病菌（Valsa mali）[17]、大腸桿菌（Escherichia coli）[18]、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）[19]、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[20]等致病菌具有拮抗作用。此類物質(zhì)一般具有熱穩(wěn)定性，酸堿穩(wěn)定性，紫外線穩(wěn)定性，抑菌譜廣，對蛋白酶不敏感，對生態(tài)安全無危害等特點[17-21]；可引起病原菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)積累、細(xì)胞膜透性發(fā)生改變和DNA 降解[22-23]，達(dá)到抑制病原菌的作用?！颈狙芯壳腥朦c及擬解決的關(guān)鍵問題】試驗對虹鱒源枯草芽孢桿菌RT-BS07 益生菌候選株產(chǎn)胞外蛋白發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對其胞外蛋白的抗菌性能進(jìn)行檢測。為該菌株在今后的抗菌及生物防治等方面的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用枯草芽孢桿菌RT-BS07 株分離自遼寧省本溪艾格莫林實業(yè)有限公司的健康虹鱒腸道內(nèi)，前期試驗結(jié)果表明該菌株具有耐酸堿耐高溫、顯著促虹鱒體質(zhì)量增長，安全性能良好等特點，可作為益生菌候選株進(jìn)行進(jìn)一步深入研究；溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、殺鮭氣單胞菌（A.salmonicida）、維氏氣單胞菌（A.veronil）、嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）和魯氏耶爾森菌（Yersinia ruckeri）為本實驗室鑒定保存菌株；胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)XOID公司；氯化鈉購自阿拉丁公司；BCA蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所；分光光度計購自Thermo公司。

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、去離子水定容至1 L，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至7.0，121 ℃滅菌15 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株種子液的制備 取凍存的枯草芽孢桿菌RT-BS07株劃線接種于LB瓊脂平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h復(fù)蘇。挑取單菌落接種于10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h后，得到種子培養(yǎng)液。

1.2.2 胞外蛋白粗提液的制備 將培養(yǎng)好的種子液按1%的接種量接入LB 液體培養(yǎng)基，28 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液于4 ℃，12 000 r/min 離心5 min，經(jīng)濾器（孔徑0.22μm）過濾后，收集上清液，獲得胞外蛋白粗提液[17]。

1.2.3 蛋白濃度測定 按照BCA 試劑盒說明書操作，利用Thermo分光光度計的BCA 程序直接測定胞外蛋白濃度。

1.2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗 選取影響菌株發(fā)酵的5 個因素：鹽度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH 值[24-25]，進(jìn)行單因素試驗，考察各因素對蛋白濃度的影響，從而確定正交試驗的因素及水平。每個試驗處理設(shè)置3 次重復(fù)，不同因素的梯度條件見表1。單一變量下其他因素保持不變，常規(guī)設(shè)定鹽度1%、初始pH值7.0，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、28 ℃下培養(yǎng)24 h。

表1 單因素試驗水平設(shè)計Tab.1 Design for single factor

1.2.5 正交設(shè)計 基于單因素試驗結(jié)果，采用正交組合試驗設(shè)計方案，以鹽度（%）、搖床轉(zhuǎn)速（r/min）、培養(yǎng)時間（h）、培養(yǎng)溫度（℃）和初始pH值為自變量因素，以胞外蛋白濃度為評判標(biāo)準(zhǔn)。自變量分別用A、B、C、D、E表示，變量水平表示為1、2、3。

表2 正交試驗因素及水平設(shè)計Tab.2 Design for orthogonal test factors and horizontal

1.2.6 胞外蛋白抑菌實驗 參照李琪敏等[7]的研究方法并改進(jìn)，將魯氏耶爾森菌等5 種條件致病菌培養(yǎng)12 h的100μL 菌懸液涂布于LB 固體培養(yǎng)基表面，晾干后牛津杯打孔。取正交試驗蛋白濃度最高的3份胞外蛋白粗提液與優(yōu)化條件培養(yǎng)的胞外蛋白粗提液各100μL添加至牛津孔內(nèi)，以無菌PBS為陰性對照，于28 ℃培養(yǎng)18 h 后利用十字交叉法測量抑菌圈直徑并計算抑菌面積，每孔設(shè)置3 個重復(fù)。抑菌面積計算公式為S=?πab-πr2。a、b表示抑菌圈的最大直徑；r表示牛津杯孔外徑的半徑。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗

2.1.1 鹽度對胞外蛋白濃度的影響 隨著鹽度升高，胞外蛋白濃度逐漸降低。當(dāng)培養(yǎng)基鹽度為1.0%時，蛋白濃度為（12.74±0.26）mg/mL，顯著高于其他鹽度下的結(jié)果（表3）。

表3 不同鹽度對胞外蛋白濃度的影響Tab.3 Effect of salinity on crude protein concentration

2.1.2 搖床轉(zhuǎn)速對胞外蛋白濃度的影響 隨著搖床轉(zhuǎn)速升高，胞外蛋白濃度呈現(xiàn)先升高而后逐漸降低的趨勢。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時，蛋白濃度達(dá)到峰值（21.42±0.39）mg/mL，顯著高于其他轉(zhuǎn)速組（表4）。

表4 搖床轉(zhuǎn)速對胞外蛋白濃度的影響Tab.4 Effect of speed on extracellular protein concentration

2.1.3 培養(yǎng)時間對胞外蛋白濃度的影響 隨著菌液發(fā)酵時間的增加，胞外蛋白濃度呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間為48 h 時，蛋白濃度為（14.86±0.17）mg/mL，顯著高于其他發(fā)酵時間組。培養(yǎng)72 h 后，雖然獲得了較高濃度的蛋白液，但培養(yǎng)物有強(qiáng)烈的刺鼻性氣味（表5）。

表5 培養(yǎng)時間對胞外蛋白濃度的影響Tab.5 Effect of incubation time on extracellular protein concentration

2.1.4 培養(yǎng)溫度對胞外蛋白濃度的影響 隨著培養(yǎng)溫度升高，蛋白濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時，蛋白濃度為（15.63±0.67）mg/mL，顯著高于其他溫度（表6）。

表6 培養(yǎng)溫度對胞外蛋白濃度的影響Tab.6 Effect of temperature on extracellular protein concentration

2.1.5 初始pH 值對胞外蛋白濃度的影響 隨著pH 值升高，蛋白濃度逐漸升高，且當(dāng)pH 值為8.0時蛋白濃度達(dá)到峰值（15.11±0.20）mg/mL。而pH 值達(dá)到9.0 時，蛋白濃度急速降低。結(jié)果顯示，pH 在5～8，胞外蛋白濃度與pH升高呈正相關(guān)，pH大于8，蛋白產(chǎn)量降低（表7）。

表7 初始pH值對粗蛋白濃度的影響Tab.7 Effect of initial pH on extracellular protein concentration

2.2 方差分析

方差分析結(jié)果如表8所示。表8中F、Fα是方差分析F檢驗法中常用的符號，F(xiàn)＞Fα為顯著性水平，F(xiàn)α為根據(jù)數(shù)據(jù)自由度以及自由變量數(shù)的值，通過查閱不同顯著水平下F分布檢驗表后所得的結(jié)果。通過與α=0.05 水平下的對比得出，培養(yǎng)溫度對RT-BS07 株的胞外蛋白濃度有顯著影響（P＜0.05）。結(jié)合單因素與正交試驗結(jié)果（表9），培養(yǎng)溫度最適值應(yīng)為33 ℃。

表8 正交試驗方差分析Tab.8 Analysis of variance

2.3 極差分析

由極差分析結(jié)果（表9）可知，5個因素的影響程度由大到小依次為D、A、B、E和C，即溫度、鹽度、轉(zhuǎn)速、初始pH 值和培養(yǎng)時間。優(yōu)化組合為A3B2C2D2E2，即鹽度3.0%、轉(zhuǎn)速150 r/min、培養(yǎng)時間36 h、培養(yǎng)溫度33 ℃、初始pH值7.0，在此條件下進(jìn)行試驗，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。蛋白濃度測定為（22.91±0.91）mg/mL，高于正交試驗預(yù)期值（20.61±0.21）mg/mL，表明該培養(yǎng)條件能夠較好的促進(jìn)枯草芽孢桿菌RT-BS07株的蛋白分泌。

表9 正交試驗極差分析Tab.9 Range analysis

2.4 發(fā)酵蛋白抑菌實驗分析

由圖1可知，a即正交試驗編號14，胞外蛋白濃度為（20.61±0.21）mg/mL，對維氏氣單胞菌抑菌效果顯著，抑菌面積達(dá)（11.45±0.97）mm2；對嗜水氣單胞菌的抑菌面積最小僅（2.81±0.18）mm2。b 即正交試驗編號2胞外蛋白濃度為（18.34±0.36）mg/mL，抑制嗜水氣單胞菌的效果好，抑菌面積為（13.90±1.01）mm（2P＜0.05）；抑制魯氏耶爾森氏菌面積最小為（6.63±0.63）mm2。發(fā)酵蛋白液c 即正交試驗編號2，胞外蛋白濃度為（16.61±0.26）mg/mL 顯著低于發(fā)酵蛋白液a，對維氏氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌的抑菌面積分別為（9.75±0.65）mm2、（4.06±0.60）mm2。d為正交優(yōu)化培養(yǎng)條件所得，其胞外蛋白濃度為（22.91±0.91）mg/mL，對魯氏耶爾森氏菌、維氏氣單胞菌具有顯著抑菌效果，抑菌面積分別為（13.87±1.03）mm2、（11.78±0.46）mm2，對殺鮭氣單胞菌的抑菌面積為（6.02±0.44）mm2。結(jié)果表明，a 與c 對維氏氣單胞菌抑菌效果顯著，b 抑制嗜水氣單胞菌效果顯著，d抑制魯氏耶爾森氏菌與維氏氣單胞菌的效果顯著。4 種蛋白粗提液對維氏氣單胞菌均有良好的抑菌效果。

圖1 胞外蛋白的抑菌分析Fig.1 Bacteriostatic analysis of extracellular protein

3 討論與結(jié)論

試驗中單因素控制變量比較結(jié)果表明，鹽度1.0%，初始pH 值8.0，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時間48 h為最佳發(fā)酵條件。有研究表明轉(zhuǎn)速過低培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)與菌株接觸不充分，而轉(zhuǎn)速過高對細(xì)菌造成機(jī)械性損傷影響蛋白分泌，都會對微生物發(fā)酵造成影響[26]。當(dāng)培養(yǎng)時間達(dá)到72 h時，胞外蛋白濃度顯著高于其他培養(yǎng)時間，但產(chǎn)生了強(qiáng)烈刺鼻性氣味，推測是由于細(xì)菌發(fā)酵后期，分泌大量次級代謝產(chǎn)物或細(xì)菌死亡破碎溶解大量蛋白；而微生物的氨基酸代謝中發(fā)生脫羧反應(yīng)產(chǎn)生有機(jī)氨，或者脫氨反應(yīng)產(chǎn)生有機(jī)酸與氨氣，使得菌液氣味刺鼻[27]。

枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物包括抗菌蛋白、蛋白酶、脂肪酸等[28-29]，其種類與產(chǎn)量受培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、發(fā)酵條件和高度復(fù)雜的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制影響[30-31]。通過優(yōu)化菌株的培養(yǎng)基組成或發(fā)酵條件可以充分發(fā)揮菌株代謝產(chǎn)物的潛力。路研等[32]利用單因素控制變量法與響應(yīng)面分析法快速優(yōu)化出枯草芽孢桿菌S-16株產(chǎn)胞外蛋白的發(fā)酵條件，初始pH 值為7.5的LB 液體培養(yǎng)基，菌種接種量為4.74%，在溫度為34 ℃條件下振蕩培養(yǎng)53 h，轉(zhuǎn)速為200 r/min。秦楠等[33]采用單因素試驗和響應(yīng)面法對解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）HRH317 株產(chǎn)胞外蛋白的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳發(fā)酵條件為初始pH 值7.0 的NB 培養(yǎng)液，菌種接種量4%，37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)速為200 r/min。此次試驗借助單因素試驗與正交試驗結(jié)合得到枯草芽孢桿菌RT-BS07株產(chǎn)胞外蛋白發(fā)酵條件，與以上研究相比初始pH值相近，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和轉(zhuǎn)速則均有所降低，推測是由于菌株同屬芽孢桿菌屬但來源不同造成的。

菌株胞外蛋白對致病菌的抑菌效果常通過抑菌面積、抑菌直徑、抑菌率等指標(biāo)進(jìn)行檢測。王文君[34]優(yōu)化枯草芽孢桿菌BL株發(fā)酵條件后，胞外蛋白抑制創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）直徑達(dá)21.21 mm，顯著大于優(yōu)化前的12.06 mm。吳惠仙[35]研究結(jié)果表明芽抱桿菌B0s1株胞外蛋白對嗜水氣單胞菌CL99817株的抑菌率大于85%較優(yōu)化前提高近20%。與前期多為單一受試菌株或相比，本試驗觀測了RT-BS07 株胞外蛋白對5 株水產(chǎn)常見條件致病菌的抑菌效果，結(jié)果顯示對維氏氣單胞菌具有較好的抑菌效果，但經(jīng)過優(yōu)化條培養(yǎng)獲得的胞外蛋白抑制魯氏耶爾森菌面積顯著增大。結(jié)果還表明胞外蛋白濃度與同一菌株的抑菌面積不呈線性關(guān)系，可能是不同發(fā)酵條件下胞外蛋白中抗菌蛋白的類型或含量發(fā)生變化。由試驗結(jié)果可見根據(jù)不同的抑菌需求，枯草芽孢桿菌RT-BS07株的培養(yǎng)條件應(yīng)做適當(dāng)調(diào)整。

本研究對枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生胞外蛋白的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化分析，今后的工作中應(yīng)關(guān)注抗菌蛋白的分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定，抑菌機(jī)制及基因表達(dá)等方面[36]，以期為鮭鱒魚類的病害防治及菌株的高效利用等方面提供數(shù)據(jù)參考。

綜上，此次實驗結(jié)合單因素控制變量法與正交試驗得出枯草芽孢桿菌RT-BS07 株產(chǎn)胞外蛋白的最佳發(fā)酵條件為鹽度3.0%、初始pH 值7.0、轉(zhuǎn)速150 r/min、培養(yǎng)時間36 h、培養(yǎng)溫度33 ℃，可獲得（22.91±0.91）mg/mL 的胞外蛋白產(chǎn)物，顯著高于常規(guī)培養(yǎng)的蛋白濃度（12.74±0.26）mg/mL。其胞外蛋白對魯氏耶爾森菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等常見條件致病菌的抑菌效果顯著，這些研究結(jié)果為該菌株在今后的水產(chǎn)養(yǎng)殖中的抗菌及生物綠色防治等方面的應(yīng)用提供理論參考。

致謝：黑龍江水產(chǎn)研究所李紹戊研究員對本研究給予了幫助，冷水性魚類病害防控創(chuàng)新團(tuán)隊項目（2020TD43）同時對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意!